乳酸菌全基因組測序的應用進展

張彥位，楊 玲，路江浩，嚴 超，仵紅巖，李 玲，劉明月，齊世華，何 方,2,

（1.河北一然生物科技股份有限公司，河北石家莊 050000；2.四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川成都 610041）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）在系統(tǒng)發(fā)育樹中處在革蘭氏陽性菌的梭狀芽孢桿菌分支上，具有豐富的物種和菌株多樣性，DNA 組成中GC 含量<50%[1]。目前，乳酸菌家族成員眾多，其中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬作為益生菌的重要組成成員，在維持腸道、生殖道、口腔和皮膚等微生態(tài)系統(tǒng)平衡和調(diào)節(jié)全身免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要的作用[2]；鏈球菌屬中的嗜熱鏈球菌具有產(chǎn)酸快、產(chǎn)胞外多糖以及產(chǎn)香（雙乙酰、乙偶姻）豐富的特點，可賦予發(fā)酵乳制品獨特的質(zhì)構(gòu)和風味，作為優(yōu)良的發(fā)酵型乳酸菌被廣泛應用[3]；乳球菌屬中的乳酸乳球菌在發(fā)酵乳制品中發(fā)揮重要作用的同時，還可生成Nisin、lactococcin 和bacteriocin 等細菌素，作為天然的生物保鮮劑被廣泛應用[4]。我國傳統(tǒng)發(fā)酵制品的歷史悠久，蘊藏著豐富的乳酸菌資源?；蚪M學技術(shù)可以對微生物體所有基因進行集體表征、定量及不同基因組的比較研究。乳酸菌全基因組測序與分析技術(shù)能夠全局且系統(tǒng)性地解析菌株的代謝特征和遺傳背景，揭示其益生功能的作用機制[5]。乳酸菌基因組學的迅猛發(fā)展大大加快了優(yōu)良乳酸菌的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應用。

1 基因組測序技術(shù)的發(fā)展

基因組測序是指通過高通量DNA 測序和生物信息學組裝獲得整個基因組序列信息[6]。全基因組信息可以全面解析基因組成和結(jié)構(gòu)特征，有助于研究人員了解菌株代謝特點并在菌株水平認識其遺傳信息與生理功能之間的聯(lián)系。1977 年，Walter Gilbert和Frederick Sanger 發(fā)明了第一臺測序儀，并完成噬菌體X174-全長5375 個堿基序列的測定，被稱為第一代測序技術(shù)[7]。高通量測序（High-Throughput Sequencing，HTS）單次運行即可同時得到幾十萬到幾百萬條核酸分子的序列，適用于基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、擴增子測序和宏基因組測序等，在現(xiàn)階段科研領(lǐng)域應用最為廣泛，也被稱為下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）或第二代測序[8]。第二代測序技術(shù)包括：Roche 公司的454 技術(shù)、ABI 公司的SOLiD 技術(shù)和Illumina 公司的Solexa 技術(shù)等。第二代測序技術(shù)序列讀長較短，大多只有100～150 bp。測序過程主要包括DNA 文庫制備、PCR 富集序列和測序3 個步驟，PCR 富集序列過程會引入一定概率的錯誤堿基，測序過程中454 技術(shù)如遇到PolyA時會因無法準確測量而一次加入多個T，進而引入插入和缺失的測序錯誤，SOLiD 技術(shù)由于雙堿基確定一個熒光信號，因此熒光解碼過程中易發(fā)生連鎖解碼錯誤，Solexa 技術(shù)使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進行DNA 測序，熒光信號去除不完全會導致背景噪聲升高，儀器的錯誤率不斷增加[9]。為增加序列的讀長并保證基因序列的準確性，科研人員開發(fā)了可以對單條長序列進行從頭測序的第三代測序技術(shù)也稱為單分子測序技術(shù)。第三代測序技術(shù)以PacBio 公司的SMRT 技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies 公司的納米孔單分子技術(shù)為代表，其最大的特點在于測序過程無需進行PCR 擴增，且對核酸序列的長度無要求[10?11]。第三代測序技術(shù)結(jié)果的一致性和準確性很高，測序過程不存在堿基偏好性，但測序成本較貴[12]。Nanopore 技術(shù)平臺通過電流變化檢測并識別堿基，體積小、易操作，在測序過程中可以根據(jù)實時結(jié)果進行診療，適用于臨床實踐[13]。隨著測序技術(shù)的不斷成熟，利用測序技術(shù)從組學的角度研究生物問題將會成為越來越有效的方法。

2 乳酸菌全基因組測序的應用

2.1 乳酸菌基因組學研究進展

基因組學研究對象包括染色體和質(zhì)粒基因，是生物體包含的全部基因[6]。最初，微生物基因組測序技術(shù)主要應用于與人類健康息息相關(guān)的病原微生物的研究[4]。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者開始關(guān)注作為重要工業(yè)微生物的乳酸菌的基因組信息[14]。世界上，第一株完成全基因組測序并公開的乳酸菌為乳酸乳球菌IL1403（GenBank：AE005176.1，2001 年），其基因組大小為2.4 Mb，包含超過2300 個基因（見圖1）[15]；我國在2008 年完成了第一株干酪乳桿菌的全基因組測序[16]。截止2021 年9 月，GenBank 已經(jīng)收錄了7055 種乳酸菌（乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌）的基因組數(shù)據(jù)（包括全基因組和框架基因組等不同完成程度）?；蚪M數(shù)據(jù)顯示乳酸菌基因組較?。?.3～3.3 Mb），GC 含量偏低，不同屬種菌株的代謝具有多樣性，研究人員將乳酸菌的基因組信息與表型特征相結(jié)合，探究菌株的進化歷程與分類，評估菌株基因水平的安全性和遺傳穩(wěn)定性[14]。此外，基于乳酸菌的全基因組信息構(gòu)建基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡模型（Genome Scale of Metabolic Network Model，GSMM），可系統(tǒng)地模擬菌株在不同環(huán)境中特定的代謝過程，進而指導大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和菌株的定向改造[17]。

圖1 Lactococcus lactis IL1403 的基因組圈圖[15]Fig.1 The circle map of Lactococcus lactis IL1403 chromosome

2.2 乳酸菌的功能特性分析

作為益生菌的重要成員，乳酸菌具有耐酸、耐膽鹽、抗氧化、高粘附和生成短鏈脂肪酸等優(yōu)良特性?；蚪M學的研究將菌株的遺傳信息與這些表型特性緊密聯(lián)系起來，可以系統(tǒng)地探究乳酸菌的代謝特征、潛在的益生特性和應用方向[14]。植物乳桿菌NCU116基因組信息中注釋到多個與寡/聚糖水解相關(guān)的糖苷水解酶、膽鹽水解酶、抗氧化相關(guān)酶類（谷氨酸脫羧酶（gadB）、谷胱甘肽合酶（gshF）和谷胱甘肽還原酶（gor））和胞外多糖合成基因簇，為其適應植物基原料（淀粉和多糖）發(fā)酵、耐受膽鹽、降膽固醇、抗氧化和合成胞外多糖等功能特性提供了重要依據(jù)[18]。全基因組測序與分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌JDFM216 基因組中包含的編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.5.1.7）、ErfK/YbiS/YcfS/YnhG 蛋白家族和特異性位點重組酶XerD 等的特征基因，可能與JDFM216 延長秀麗隱桿線蟲壽命和增強免疫反應的功能特性有關(guān)[19]。植物乳桿菌LPL-1 可有效抑制單增李斯特菌54002 的增值。LPL-1 的基因組中包含Ⅱa 類細菌素的生物合成基因，分別編碼前體、免疫蛋白、輔助蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白。細菌素是由核糖體合成的抗菌蛋白或肽，對病原菌具有較高的抑制活性。應用基因組學技術(shù)解析了LPL-1 抑菌作用的機制，提升了LPL-1 在營養(yǎng)保健食品和藥品中潛在的應用價值[20]。

2.3 乳酸菌的進化與分類研究

作為重要的食品工業(yè)微生物，乳酸菌的遺傳背景與進化歷程是工業(yè)化菌株開發(fā)與應用的基礎(chǔ)。乳酸菌的遺傳與進化主要研究選擇壓力對基因突變的作用和基因?qū)Ρ硇托誀畹挠绊慬21]。遺傳與進化的研究方法在DNA 序列差異分析的基礎(chǔ)上不斷發(fā)展，包括早期基于單基因16S rRNA 基因間隔區(qū)分析技術(shù)、基于多個看家基因的多位點序列分型技術(shù)（Multilocus Sequence Typing，MLST）和基于基因組信息差異分析的全基因組測序技術(shù)（Whole-Genome Sequencing）[22]。全基因組測序技術(shù)是將測序獲得的基因組序列與參考序列進行比對，確定基因組中插入與缺失位點、單核苷酸多態(tài)性位點和結(jié)構(gòu)變異位點等，以研究菌株的進化與分類[23]。乳酸菌基因組包含了全部的遺傳信息，因此全基因組測序技術(shù)是研究乳酸菌進化與分類的有效手段。

應用全基因組測序技術(shù)可以獲得乳酸菌完整的基因組信息。乳酸菌基因組信息能夠如實反饋菌株在進化歷程中發(fā)生的遺傳與變異。經(jīng)基因組分析發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)豐富環(huán)境中乳酸菌進化的總體趨勢為將無用基因片段不斷鈍化、缺失，實現(xiàn)基因組的最小化[24]。嗜熱鏈球菌和乳桿菌在進化過程中逐漸缺失了毒力和生成孢子的相關(guān)基因，不斷從致病性鏈球菌和芽孢桿菌中分離出來，也因此作為公認的食品級安全微生物在發(fā)酵食品中被廣泛應用[25]。除垂直遺傳外，水平基因轉(zhuǎn)移（Horizontal Gene Transfer，HGT）在乳酸菌進化歷程中普遍存在。水平轉(zhuǎn)移來的基因序列與基因組相比，在結(jié)構(gòu)和組成（密碼子偏好性、GC 含量等）上會存在顯著差異[26]。應用全基因組測序與分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)組胺的副布氏乳桿菌基因組中組氨酸脫羧酶（HDC）基因簇位于一個基因組島中，其GC 含量明顯高于基因組平均GC 含量，且與嗜鹽四聯(lián)球菌、希氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和酒類球球菌的HDC 基因簇的相似性高達74.7%～89.2%，表明副布氏乳桿菌的組氨酸脫羧酶（HDC）基因簇來源于水平基因轉(zhuǎn)移[27]。

理想情況下，基于生物體之間的進化關(guān)系可完成分類。最初，研究者利用微生物的表型特征（例伯杰細菌鑒定手冊）來指導分類，但由于存在大量無法純培養(yǎng)的細菌，龐大的細菌家族分類法的發(fā)展受到了阻礙。而不依賴于純培養(yǎng)的測序技術(shù)的快速發(fā)展使得微生物分類進入依賴于全基因組比較的系統(tǒng)基因組學時代?；诨蚪M的鑒定分類方法包括平均核苷酸一致性（ANI）和總核苷酸一致性（TNI）2 個指標[28]。在TNI 指標中，同一科屬的微生物通常具有20%的遺傳相似性，而乳桿菌屬的微生物其遺傳相似性較低，約為10%；在ANI 指標中，同一科屬的成員擁有約70%～80%的核苷酸同源性，而目前乳桿菌屬的微生物僅有65%的同源性[29]。Salvetti 等[30]使用ANI、保守蛋白百分比等不同的方法，對222 株不同乳桿菌進行系統(tǒng)性及網(wǎng)絡化分析后，建議將乳桿菌屬分為10 個屬。Parks 等[31]對94759 個原核微生物基因組的120 種蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)分析后，提議將乳桿菌屬分為16 個亞群。然而，絕對的分類標準并不存在，使用不同的方法和判斷閾值會得到不同的分類結(jié)果。基于全基因組分類方法的優(yōu)勢在于新屬具有更好的同質(zhì)性，且可以保證屬的分類數(shù)量穩(wěn)定，進而盡量避免將來發(fā)現(xiàn)的新菌種需要再重新分類的情況。

2.4 乳酸菌的安全性評估

食品和醫(yī)藥用微生物及其發(fā)酵制品的安全性對于公共衛(wèi)生至關(guān)重要，因此，在工業(yè)應用前需對新引入菌株及其發(fā)酵制品的安全性進行徹底評估。國際上用于安全性評估的參考指南包括：聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（2002）提出的ICMR-DBT 和歐洲食品安全局提出的Qualified Presumption of Safety（QPS）等。我國新頒布了《食品用菌種安全性評價程序》（意見稿），評價程序要求將擬評價菌株的基因組信息與對應的表型結(jié)合起來，綜合評估菌株的安全性。

全基因組信息可以從耐藥/毒力/致病性等相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能信息反映菌株的安全性。嗜熱鏈球菌、唾液鏈球菌和前庭鏈球菌同屬于唾液鏈球菌群，但目前僅嗜熱鏈球菌作為公認安全的食品級微生物（GRAS），廣泛應用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)[32]。唾液鏈球菌和前庭鏈球菌多與疾病感染（齲齒、心內(nèi)膜炎等）有關(guān)。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌較其他致病種的顯著特征是基因組中缺失或失活了毒力相關(guān)基因[25]。耐藥基因依靠水平基因轉(zhuǎn)移在相同或不同物種間進行傳遞。當乳酸菌對某些藥物具有抗性時，應確定其抗性的遺傳基礎(chǔ)，不可轉(zhuǎn)移性是具有抗生素抗性乳酸菌應用的前提[33]。Zhang 等[34]對植物乳桿菌JDM1 的全基因組序列進行分析，共發(fā)現(xiàn)51 個與抗生素抗性相關(guān)的基因，126 個毒力相關(guān)的基因和23 個與不良代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因，且這些基因大都不可轉(zhuǎn)移。Li 等[35]對從中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中分離到的瑞士乳桿菌KLDS1.8701 進行了安全性評價，全基因組測序與分析發(fā)現(xiàn)KLDS1.8701 的基因組中含有不可轉(zhuǎn)移的抗生素抗性基因和不良代謝產(chǎn)物（生物胺、D-乳酸等）相關(guān)基因，表型實驗證實KLDS1.8701 對6 種抗生素具有抗性，未見不良代謝產(chǎn)物的表達，經(jīng)口毒性試驗未見毒性，證明KLDS 1.8701 具有安全性，是可在食品領(lǐng)域應用的潛在益生菌。

2.5 乳酸菌的遺傳穩(wěn)定性評估

微生物退化的現(xiàn)象在菌株凍存、高密度培養(yǎng)、凍干和流通過程中較為常見，表現(xiàn)為菌株典型形態(tài)改變、發(fā)酵異常和功能特性衰減等，嚴重影響和制約菌株產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。菌株的遺傳穩(wěn)定性一般通過表型特征和遺傳信息兩個層面來進行評價。微生物的遺傳變異廣泛存在于基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，而常用的分子生物學技術(shù)多以單個或幾個基因為靶點，結(jié)果較為局限。隨著全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，通過菌株全基因組的深度測序在全基因組水平上掃描并檢測基因的序列變異和結(jié)構(gòu)變異等，以其高效、低成本、信息量完整準確的特點，正逐步成為研究菌株遺傳變異的重要工具[36]。

乳酸菌作為重要的食品用菌株，其優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性是保證其產(chǎn)業(yè)化順利進行的關(guān)鍵。乳酸菌發(fā)酵過程中會面臨酸脅迫、營養(yǎng)缺乏和冷凍脅迫等，暴露于壓力條件下會增加其基因組變化的頻率。Stage 等[37]應用全基因組測序與分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)化過程中鼠李糖乳桿菌GG 基因組的重疊群與參考基因組的覆蓋率具有高度一致性，ANI 得分分布未見顯著差異，單核苷酸多態(tài)性（SNP）未見積累，證明產(chǎn)業(yè)化過程中鼠李糖乳桿菌GG 基因組可穩(wěn)定遺傳。同樣Feng 等[38]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ATCC 14917 繼代培養(yǎng)過程中碳水化合物代謝相關(guān)基因不可穩(wěn)定遺傳，其中編碼磷酸甘油酸變位酶基因在第30 代、60 代和90 代菌株中產(chǎn)生6 個非同義突變，使得第30 代、60 代和90 代菌株不可利用葡萄糖酸和龍膽二糖，但卻增加了d-山梨糖醇、α-甲基-d-甘露糖和d-棉子糖的利用能力。

乳酸菌具有優(yōu)良的產(chǎn)香特性和豐富的益生代謝產(chǎn)物，作為發(fā)酵劑在發(fā)酵食品領(lǐng)域被廣泛應用。在發(fā)酵過程中，噬菌體污染情況普遍存在。噬菌體侵染會嚴重影響乳酸菌的穩(wěn)定遺傳和生長代謝，導致發(fā)酵不完全或失敗[39?41]。噬菌體污染包括外部來源的溶菌性噬菌體污染和內(nèi)部來源的溶原性噬菌體（前噬菌體）污染，前者可通過環(huán)境控制等手段進行有效預防，而后者卻無法控制[42]。前噬菌體在乳桿菌中普遍存在，研究表明，惡劣環(huán)境會誘導乳酸菌中前噬菌體的表達[43]。因此，在菌株產(chǎn)業(yè)化應用前，可應用全基因組測序技術(shù)闡明菌株基因組中是否存在前噬菌體相關(guān)基因，并通過驗證試驗將含有易誘導表達噬菌體的菌株排除在外。Wei 等[44]發(fā)現(xiàn)雖然植物乳桿菌NCU116基因組中攜帶3 個前噬菌體，但絲裂霉素C、乳酸、膽鹽、乙醇和過氧化氫等壓力處理均不能誘導其表達，表明植物乳桿菌NCU116 具有遺傳穩(wěn)定性，可用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)而不會導致發(fā)酵失敗。

2.6 基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡模型

隨著基因組測序和注釋信息的大量獲得，GSMM 成為系統(tǒng)生物學中眾多建模工作的基礎(chǔ)。微生物的基因組信息可以反饋它所能進行的全部生化反應[6]?；诨蚪M信息構(gòu)建的GSMM 實質(zhì)上是描繪微生物中酶效應組裝（enzymatic assembly）線路的藍圖[17]。GSMM 可以表征基因-蛋白-反應三者之間相互作用關(guān)系，包括典型代謝模型、互作網(wǎng)絡模型、泛基因組模型和宏基因組模型，在分析網(wǎng)絡特性、預測細胞表型、指導菌株設計、驅(qū)動模型發(fā)現(xiàn)、研究進化過程和分析相互作用等系統(tǒng)生物學的六個方面得到了廣泛地應用（見圖2）[45?46]。

乳酸菌第一個GSMM 是基于乳酸乳球菌IL1403的基因組序列構(gòu)建的，共包含621 個反應和509 種代謝物，成功預測并驗證了用于菌株生長的最小培養(yǎng)基，指導了提升二乙酰產(chǎn)量的代謝工程策略[47]。Kristjansdottir 等[45]構(gòu)建了羅伊氏乳桿菌JCM1112T的GSMM（Lreuteri_530），利用模型發(fā)現(xiàn)不同菌株之間糖酵解途徑（PK 途徑和EMP 途徑）的通量分布有很大差異，羅伊氏乳桿菌JCM1112T的EMP 途徑最大通量僅為總糖酵解通量的7%。Xu 等[48]以干酪乳桿菌LC2W 的全基因組序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了干酪乳桿菌的第一個GSMM（iJL846）。iJL846 包含846 個基因，969 個代謝反應和785 種代謝物，重新注釋了342 個基因的代謝功能，確定了菌株生長必需的10 種氨基酸和7 種維生素，鑒定出可以提高胞外多糖（EPS）的產(chǎn)量的11 種營養(yǎng)素以及生物合成途徑中的重要反應，分析了氧氣對風味化合物形成的影響，預測了3 個新的敲除靶標以提升乙酰輔酶的產(chǎn)量。為比較同種但不同來源的菌株的代謝能力的異同，Elena 等[49]分別構(gòu)建了干酪乳桿菌ATCC 334 和玉米青貯分離株干酪乳桿菌12A 的GSMM，對比發(fā)現(xiàn)兩株菌的代謝網(wǎng)絡、遺傳和直系同源基因高度相似。綜上，GSMM 已成為研究和改良乳酸菌代謝必不可少的工具。此外，增加約束條件并整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組的數(shù)據(jù)將進一步提高模型的準確性[50]。

3 展望

乳酸菌作為重要的食品工業(yè)微生物，擁有廣闊的應用前景?；蚪M測序技術(shù)飛速發(fā)展，成為促進乳酸菌研究的有力工具，有助于深入了解菌株的代謝特征、遺傳背景、安全性及應用穩(wěn)定性，為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應用奠定理論基礎(chǔ)。將乳酸菌的基因組與表型信息相結(jié)合可以為闡明功能菌株的具體作用機制提供線索；重構(gòu)GSMM 可以準確、高效地指導菌株工業(yè)化生產(chǎn)與應用。未來幾年，乳酸菌的研究必將受益于基因組學的最新進展以及新的生物信息學算法和分析工具的發(fā)展。然而，乳酸菌作為活的生命體，菌株與菌株或菌株與環(huán)境間的相互作用均會影響基因的選擇性表達，使得基因組與表型信息間一致性水平較低。轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組信息可反映菌株轉(zhuǎn)錄與表達的情況，將其與基因組學信息學整合能夠更完整地展示菌體細胞的動態(tài)生命過程，這將是促進乳酸菌應用的重要技術(shù)手段。