TRPV5基因多態(tài)性與腎含鈣結(jié)石疾病的相關(guān)性研究

范先明 林劍鋒 涂建平 梁福律 葉志彬 張明芽 李亞楠 郭昭建 胡力仁

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)B門市第三醫(yī)院泌尿外科，福建 廈門 361100）

泌尿系結(jié)石在我國(guó)乃至全世界都是常見的疾病，其發(fā)病率仍持續(xù)增加，我國(guó)發(fā)病率高達(dá)6.06%，但呈不均衡分布，男性多于女性，農(nóng)村高于城市，南方高于北方[1]；而含鈣結(jié)石是最常見的泌尿系結(jié)石的類型[2]。泌尿系結(jié)石病因涉及環(huán)境和遺傳因素等方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)泌尿系結(jié)石患者其親屬50%～70%患有泌尿系結(jié)石[4]。而Curhan等[5]對(duì)泌尿系結(jié)石患者的家庭成員限制鈣攝入量后，結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致人們對(duì)遺傳因素、環(huán)境因素及混雜因素增加泌尿系結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)存有疑惑。目前有基因的作用研究支持有泌尿系結(jié)石病史的家庭中有常染色體顯性遺傳可能[6]。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study wide association，GWAS）是在全基因組范圍內(nèi)常見遺傳變異（單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)）與疾病進(jìn)行輪廓性的整體性的關(guān)聯(lián)分析方法，篩選出與疾病相關(guān)的SNPs。目前僅有少量來(lái)自歐洲和日本關(guān)于泌尿系結(jié)石形成中調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽代謝的各種基因位點(diǎn)的GWAS，認(rèn)為常見遺傳變異的尿液轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和大分子是尿路結(jié)石病相關(guān)的危險(xiǎn)因素[7-8]。GWAS研究易于實(shí)施并呈上升的趨勢(shì)，是評(píng)估復(fù)雜疾?。ㄈ缒I結(jié)石）的遺傳決定因素，實(shí)用且經(jīng)濟(jì)高效的方式，在資源有限的研究環(huán)境中有明顯的優(yōu)勢(shì)[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與增加腎結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)[10-14]。但能夠減少腎結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)較少報(bào)道。本研究旨在確定TRPV5、UMOD基因中常見遺傳變異與泌尿系結(jié)石患者易感性之間的潛在關(guān)聯(lián)。此外，我們還通過(guò)收集和分析與含鈣腎結(jié)石易感性相關(guān)的TRPV5、UMOD基因多態(tài)性的現(xiàn)有數(shù)據(jù)，采用了系統(tǒng)的方法，這是通過(guò)使用含鈣腎結(jié)石病患者和健康對(duì)照的候選基因關(guān)聯(lián)研究確定的，通過(guò)Logistic回歸分析影響含鈣腎結(jié)石發(fā)病的危險(xiǎn)因素，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究組：隨機(jī)選擇在廈門市第三醫(yī)院確診的腎含鈣腎結(jié)石共237例為研究對(duì)象，時(shí)間為2017年10月至2020年7月，年齡52～73歲，平均（64.78±3.93）歲；對(duì)照組：選擇我院同期的無(wú)泌尿系結(jié)石病史的健康者149名，年齡55～74歲，平均（65.31±3.87）歲。兩組一般資料比較，P＞0.05，具有可比性。采用相同方法分析血清中的鈣、尿素和肌酐，并分析尿液以研究尿鈣排泄[15]。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查獲得研究組與對(duì)照組年齡、性別、BMI、腎結(jié)石家族史的詳細(xì)信息。對(duì)所有的參與研究的結(jié)石患者進(jìn)行隨訪，以了解結(jié)石的復(fù)發(fā)情況。本研究已經(jīng)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～85歲；確診泌尿系結(jié)石患者；患者屬于中國(guó)國(guó)籍及漢族；臨床資料完整；患者經(jīng)結(jié)石成分分析為含鈣結(jié)石。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有腎結(jié)石家族史的患者；懷孕期、哺乳期的泌尿系結(jié)石患者；有骨髓自體移植和外周干細(xì)胞移植等器官移植史，及近期輸血史患者；有明顯精神障礙及中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙史者；伴有嚴(yán)重泌尿系感染或活動(dòng)性消化道潰瘍需要治療者；合并有長(zhǎng)期的尿路梗阻、甲狀腺功能亢進(jìn)、慢性腸道疾病、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、不能控制的糖尿病等疾病患者；合并惡性腫瘤患者。

1.3 方法 收集研究組血液樣本237例及對(duì)照組血液樣本149例。留取EDTA抗凝血標(biāo)本，棄去上清后留取其他的細(xì)胞成分，存放于-80 ℃冰箱，待后采用苯酚-氯仿法提取DNA，測(cè)定DNA濃度及純度，保持DNA A260/280在1.7～1.9。在第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)中檢測(cè)目的基因SNP。

試驗(yàn)流程：樣品質(zhì)檢—設(shè)計(jì)引物??—PCR驗(yàn)證—PCR擴(kuò)增—PCR產(chǎn)物回收純化—建庫(kù)—上機(jī)測(cè)序—數(shù)據(jù)分析。利用HapMap據(jù)庫(kù)（http://hapmap.ncbi.nlm.nil.gov/）以及相關(guān)文獻(xiàn)，選擇候選基因功能性SNP位點(diǎn)位于啟動(dòng)子、5'-非翻譯區(qū)（5'-UTR）、內(nèi)含子和3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）等，且滿足在CHB人群中MAF＞0.05。與TVRP5相關(guān)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（rs17210、rs17212和rs17262），UMOD基因相關(guān)的SNP（rs13329952、rs11648131和rs9652588）已進(jìn)行調(diào)查。對(duì)于所有SNP，樣品中的檢出率約為91%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)驗(yàn)證了受試者符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）。根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息并采用Assay Designer 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并交由有限公司合成。TRPV5、UMOD基因各個(gè)SNP位點(diǎn)引物序列詳見表1。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)在4 μL體系中進(jìn)行，每個(gè)微孔中的總體積為4 μL，包括1 μL基因組DNA，0.625 μL 10×PCR緩沖液，1 μL引物使用液，0.325 μL MgCl2，0.1 μL HotstarTaq，用雙蒸水補(bǔ)足不足體積。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，4 ℃ forever。PCR反應(yīng)后，多余的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物用SAP酶清除，SAP程序：37 ℃40 min，85℃ 5 min，4 ℃ forever。延長(zhǎng)反應(yīng)，延長(zhǎng)反應(yīng)條件：1.94 ℃ 30 s；2.94 ℃ 5 s；3.52 ℃ 5 s；4.80 ℃ 5 s；5.72 ℃ 3 min；6.4 ℃ forever。3～4步驟5個(gè)循環(huán)后，2～4步驟再40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物純化及構(gòu)建文庫(kù)，把檢測(cè)樣品轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的Mass ARRAY SpectroCHIP測(cè)序芯片上，即可放入質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動(dòng)分析檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)只需3～5 s。應(yīng)用邊合成邊測(cè)序方式進(jìn)行測(cè)序，堿基種類根據(jù)4種不同的熒光信號(hào)來(lái)確認(rèn)，并保證核酸序列質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)果用TYPER軟件分析并獲得分型數(shù)據(jù)。

表1 TRPV5、UMOD 基因SNP位點(diǎn)的合成引物序列

1.4 研究指標(biāo) 研究對(duì)象的基本情況、飲食和運(yùn)動(dòng)情況。研究對(duì)象基本情況包括：年齡、性別、基礎(chǔ)?。ㄌ悄虿　⑿难芗膊〉龋┖腕w質(zhì)量指數(shù)（BMI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 收集的資料符合正態(tài)分布的用（）描述。利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組獨(dú)立樣本采用Student's檢驗(yàn)，3組樣本及以上計(jì)量資料用方差分析。統(tǒng)計(jì)所有樣本中SNP位點(diǎn)的分型情況，基因型、最小等位基因數(shù)（MAF）以及不同等位基因/基因型的比例。使用χ2檢驗(yàn)檢查受試者中每個(gè)的基因型頻率是否偏離Hardy-Weinberg平衡（HWE），P＞0.05被認(rèn)為與HWE差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用χ2檢驗(yàn)分析不同基因型/等位基因與腎結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，以P＜0.05其相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)二元Logistic回歸分析了SNP與含鈣結(jié)石患者之間的關(guān)聯(lián)，確定比值比（odds ratio，OR）及其95%置信區(qū)間（confidenceInterval，CI）。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較 研究組的BMI、血尿酸、血肌酐、收縮壓及收縮壓顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組基本資料比較（）

表2 兩組基本資料比較（）

2.2 兩組TRPV5和UMOD基因多態(tài)性分布比較 研究組TRPV5基因rs17212位點(diǎn)的等位基因A的頻率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），rs17212位點(diǎn)AA、GA的基因型顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），UMOD基因rs11648131位點(diǎn)的等位基因C的頻率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），rs11648131位點(diǎn)CC的基因型顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他點(diǎn)位基因多態(tài)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、表4。

表3 兩組TRPV5基因多態(tài)性分布比較

表4 兩組UMOD基因多態(tài)性分布比較

2.3 含鈣腎結(jié)石危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示年齡≤35歲、BMI和rs17212是含鈣腎結(jié)石發(fā)病的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），rs11648131是含鈣腎結(jié)石發(fā)病的保護(hù)因素（P＜0.05），血尿酸與含鈣腎結(jié)石無(wú)明顯相關(guān)性。見圖1。

圖1 Logistic回歸分析泌尿結(jié)石危險(xiǎn)因素的OR值

3 討 論

目前腎結(jié)石可通過(guò)許多微創(chuàng)的方法治療，但其有較高的殘石率及復(fù)發(fā)率，腎結(jié)石仍是泌尿外科中棘手問(wèn)題之一[16]。在泌尿系結(jié)石中以草酸鈣或磷酸鈣結(jié)石為主，主要成分是鈣離子[17-18]。既往研究表明，高尿鈣癥也是泌尿系結(jié)石的主要危險(xiǎn)因素之一，遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素會(huì)對(duì)原尿液中鈣離子再吸收產(chǎn)生重大影響，繼而導(dǎo)致泌尿系結(jié)石[19-20]。因此，促進(jìn)尿液鈣離子再吸收和減少尿鈣排泄可能是減少腎結(jié)石形成的一種方式。

在腎臟中，TRPV5蛋白質(zhì)主要在腎遠(yuǎn)曲小管和連接小管的上皮中表達(dá)，是鈣離子重吸收的最后門戶，在尿原液中鈣離子的重吸收和維持鈣離子的穩(wěn)態(tài)中起重要的作用[21-23]。已有研究證明，TRVP5基因敲除的小鼠表現(xiàn)出Ca2+重吸收減少，增加腸道鈣吸收和降低骨密度[24-25]，用小的活化RNA（ds-320）激活TRVP5后可促進(jìn)大鼠尿鈣離子的重吸收并減少尿鈣離子的排泄，從而抑制乙二醇誘導(dǎo)的草酸鈣晶體形成[26]。TRPV5表達(dá)下調(diào)直接降低大鼠尿液中鈣離子重吸收，直接導(dǎo)致尿鈣丟失并導(dǎo)致高鈣尿癥[27]。這表明TRPV5的表達(dá)水平涉及腎結(jié)石的形成，上調(diào)TRPV5的表達(dá)可能是腎結(jié)石一個(gè)新的治療方法。

TRPV5單核苷酸多態(tài)性主要在高鈣性疾病中。首個(gè)報(bào)告在美國(guó)非洲裔中TRPV5有A8V、R154H（rs4236480）、A563T和L712F的基因多態(tài)性，僅R154H（rs4236480）與高尿鈣相關(guān)[28]。在20例高的尿鈣患者中檢測(cè)到TRPV5的SNP（A8V、R154H和A561T），盡管對(duì)TRPV5通道功能沒有受到影響[29]。與野生型TRPV5相比，TRPV5的S682P突變導(dǎo)致小鼠模型中出現(xiàn)高鈣尿癥、多尿癥、高磷尿癥和更酸性的尿液[30]。在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)人群中，發(fā)現(xiàn)與泌尿系結(jié)石相關(guān)TRPV5基因多態(tài)性位點(diǎn)是rs4236480，因?yàn)閿y帶TT+CT基因型的患者比CC基因型患者患結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)增加[31]。Oddsson等[32]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)TRPV5與泌尿系結(jié)石的復(fù)發(fā)存在明顯相關(guān)性（OR=3.62，P=4.1×10-5）。在本研究中，所選得TRPV5的SNP（rs17210，rs17212和rs17262）僅發(fā)現(xiàn)rs17212與腎結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，在腎結(jié)石的患者中rs17212的AA 純合子基因型攜帶者高于其他基因型攜帶者，rs17212是腎結(jié)石的危險(xiǎn)因素之一[OR=2.210，95%CI（1.040～4.698）]。

UMOD 基因位于染色體16p12上，編碼哺乳動(dòng)物尿液中含量最高的尿調(diào)節(jié)蛋白（Tamm-Horsfall蛋白）。GWAS發(fā)現(xiàn)UMOD單核苷酸多態(tài)性（SNPs）對(duì)含有鈣的腎結(jié)石具有保護(hù)作用[33]。UMOD通過(guò)細(xì)胞外作用和減少TRPV5的內(nèi)吞作用來(lái)上調(diào)TRPV5，刺激Ca2+重吸收有助于防止腎結(jié)石發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，形成并具有抑制結(jié)石形成特征的巨細(xì)胞[34-35]。在本研究中UMOD 3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（rs13329952、rs11648131和rs9652588）僅發(fā)現(xiàn)rs1164813多態(tài)性位點(diǎn)與腎結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著負(fù)相關(guān)，在腎結(jié)石患者中CC純合子基因型攜帶者低于CG雜合子基因型攜帶者，有助于防止腎結(jié)石發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

這項(xiàng)研究仍然存在局限性。由于潛在的SNP是根據(jù)已發(fā)表的文章和公共數(shù)據(jù)庫(kù)選擇的，因此我們可能會(huì)錯(cuò)過(guò)其他一些潛在的功能遺傳變異性，這些變異不一定是SNPs。其次，偏差可能由本研究的樣本量相對(duì)較小引起，需要進(jìn)一步研究樣本量較大的樣本量來(lái)驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。此外，這項(xiàng)研究的參與者都是中國(guó)人，最好將這項(xiàng)研究擴(kuò)展到不同的種族群體，并檢驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)的有效性。此外，雖然我們已經(jīng)揭示了SNP rs17212、rs1164813與腎結(jié)石之間的關(guān)聯(lián)，但實(shí)際分子和細(xì)胞機(jī)制仍有待探索。