丹參及其活性單體成分調(diào)控骨質(zhì)疏松癥相關(guān)信號通路的研究進展

王偉偉 歐志學(xué) 章曉云 李時斌 周毅 李統(tǒng)

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000 2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂林 541002

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種臨床上比較常見的骨科疾病，其特征是每單位體積的骨量減少，導(dǎo)致骨強度受損，多見于老年男性和絕經(jīng)后女性[1]。根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，預(yù)計2050年將有599萬例患者因骨質(zhì)疏松而發(fā)生骨折，其醫(yī)療支出將超1 745億元，無論是對個人、家庭還是社會，都將是一個巨大的負擔(dān)[2]。目前臨床上治療OP多以西藥為主，但往往存在費用高等問題。因此，開發(fā)低毒安全、價格低廉的藥物就成為了目前骨質(zhì)疏松癥研究的一大熱點。

丹參又名紅根，味苦、微寒、無毒，入心肝血分，是唇形科植物丹參的根及根莖。根據(jù)現(xiàn)代研究顯示，丹參具有改善微循環(huán)、抗氧化、防止血栓等功效[3]。近年來隨著中藥藥理學(xué)研究的不斷深入，相關(guān)人員發(fā)現(xiàn)，丹參在促進骨骼生長、愈合的同時，還能有效降低絕經(jīng)期婦女或老年骨質(zhì)疏松患者血液中骨吸收生物相關(guān)指標[4]。此外，相關(guān)基礎(chǔ)研究[5-6]也證實，丹參及其活性單體可調(diào)節(jié)相關(guān)骨性細胞增殖、凋亡以及分化。但目前臨床治療上，丹參往往是以復(fù)方形式存在，鮮有以單味中藥或活性單體形式治療骨質(zhì)疏松癥，因此，本文欲通過總結(jié)近些年來，丹參及其活性成分在治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究，從而為其基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供一些幫助。

1 丹參及其活性成分治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究

相關(guān)研究顯示，目前丹參共分離出50余種活性成分，包含水溶性成分：丹參素、丹酚酸、紫草酸等，脂溶性成分：丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA，丹參酮ⅡB、隱丹參酮等，以及三萜類、黃酮類等其他成分[7]。其中以丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮為主，因此闡明丹參及其活性成分參與抗OP的機制研究，將更有利于其相關(guān)研究的開展，從而推動中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究。

1.1 丹參素

丹參素是一種來自中藥丹參的多酚類活性成分，具有抑制細胞凋亡、抗氧化等多種功能[8-9]。目前研究表明[10]，丹參素對于去勢大鼠的骨質(zhì)量有著明顯的提升作用，是目前OP藥物防治領(lǐng)域的一大熱點。其中，申健等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可顯著增加大鼠骨形成指標和減小骨吸收指標，從而達到防治OP的作用。機制研究方面，王秉義等[12]通過實驗發(fā)現(xiàn)，丹參素能激活MC3T3-E1細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路，從而拮抗成骨細胞凋亡。沙鑫等[13]研究觀察到，丹參素可下調(diào)磷酸化AKT的表達水平，從而抑制核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)的破骨細胞分化，這可能與不同細胞中丹參素的靶基因不相同有關(guān)，而其具體作用機制則有待后續(xù)研究進一步探討。由此可見，筆者認為無論是在促進骨形成還是抑制骨吸收方面，丹參素都能發(fā)揮一定作用，值得深入研究，從而為其臨床應(yīng)用提供一些幫助。

1.2 丹酚酸B

丹酚酸B是丹參中一種水溶性單體，其顯著的抗氧化作用是丹參藥用功效的主要貢獻來源[14]。相關(guān)研究表明，骨質(zhì)疏松癥患者機體的氧化應(yīng)激水平要明顯高于正常人[15]，因此相關(guān)學(xué)者紛紛將研究重心轉(zhuǎn)移至丹酚酸B減輕細胞氧化損傷的機制研究上。榮彩麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可恢復(fù)因氧化應(yīng)激所致的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)表達水平下降，從而恢復(fù)成骨細胞相關(guān)活性。另外，張海龍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可通過激活介導(dǎo)AKT/轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)信號通路，增強牙周膜干細胞的抗氧化能力，從而減輕其對后者增殖和成骨分化的損害。

除了抗氧化應(yīng)激作用，丹酚酸B還可通過其他途徑起到抗骨質(zhì)疏松作用。其中，Zhang 等[18]研究證實，丹酚酸B可通過一氧化氮途徑誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化；而劉鈺瑜等[19]研究則表明，在地塞米松引起的MC3T3-E1細胞中，丹酚酸B可抑制其Dickkopf Wnt信號通路抑制劑1(dickkopf wnt signaling pathway inhibitor 1，DKK1)mRNA的表達，從而促進骨形成。由此可見，筆者認為丹酚酸B可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，減輕骨性細胞的氧化損傷，并同時促進成骨分化，從而起到治療骨質(zhì)疏松的作用。

1.3 丹參酮ⅡA

丹參酮ⅡA是中藥丹參中有效的脂溶性成分，具有舒張血管、改善微循環(huán)以及抗炎等作用[20]。近些年其在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的防治作用也逐漸引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。王璽等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可通過促進骨形成和抑制骨吸收，增加廢用性骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的骨密度。

其中在抑制骨吸收方面，Kim等[22]發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能抑制RANKL誘導(dǎo)破骨前體細胞的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、AKT和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而降低整合素b3和降鈣素受體的mRNA表達水平。另外，丹參酮ⅡA還可通過調(diào)節(jié)成骨細胞增殖與分化，起到防治作用。莫朝論等[23]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，在一定時間內(nèi)，適宜濃度的丹參酮ⅡA可促進大鼠成骨細胞增殖，其通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)的mRNA表達來促進成骨分化。由此可見，無論是在骨形成還是骨吸收過程中，丹參酮ⅡA都有一定的研究價值。

1.4 隱丹參酮

隱丹參酮是一種脂溶性蒽醌類衍生物，具有祛瘀止痛、抗菌抗炎和抗氧化等作用[24]。其在抗骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的作用目前也在被不斷挖掘。Lee等[25]通過實驗證實，0.5～2.5 μg/mL的隱丹參酮可有效抑制破骨細胞的增殖分化。Wang等[26]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)，炎性環(huán)境下，隱丹參酮可通過阻斷NF-κB信號通路來抑制破骨細胞生成。

而隨著機制研究的不斷深入，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在隱丹參酮調(diào)控破骨細胞過程中發(fā)揮著重要作用。張翕等[27]研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可下調(diào)即早基因(c-fos)、組織蛋白酶 K(Cathepsin K)和活化T-細胞核因子(recombinant nuclear factor of activated T-cell cytoplasmic 1，NFATc1)等破骨細胞特異性基因的表達，從而抑制MAPK信號通路誘導(dǎo)破骨細胞生成作用。Wang等[28]研究同樣發(fā)現(xiàn)，在骨髓源性巨噬細胞中，隱丹參酮可抑制骨髓源性巨噬細胞中破骨形成相關(guān)標記蛋白的表達。另外，他們還發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可減弱RANKL誘導(dǎo)的ERK磷酸化和NF-κB激活。這些結(jié)果皆表明，隱丹參酮通過抑制ERK磷酸化和NF-κB激活，抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生。由此可見，隱丹參酮主要是通過抑制NF-κB和MAPK信號通路來抑制破骨細胞生成，進而抑制骨吸收，最終起到防治作用。

2 丹參及其活性成分治療骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)機制

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路是Wnt信號通路中公認的經(jīng)典通路，可誘導(dǎo)一系列骨代謝和骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子表達，以此起到防治骨質(zhì)疏松的作用。Wnt蛋白與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)/Frizzled受體結(jié)合后，通路被激活，其胞質(zhì)內(nèi)散亂的蛋白也被相應(yīng)激活，糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)活性被抑制，從而阻礙β-catenin與細胞支架蛋白(Axin)、GSK-3β以及大腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)結(jié)合形成β-catenin降解復(fù)合物，而后β-catenin進一步磷酸化，導(dǎo)致胞內(nèi)游離β-catenin增多，其達到閾值后會向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，激活相關(guān)靶基因，從而促進成骨細胞增殖分化及抑制其凋亡。

其中，丹參素和丹酚酸B皆已被證實，可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來促進成骨細胞分化。Cui等[29]研究表明，丹酚酸B和丹參素可抵抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞中DKK1表達和促進β-catenin表達。另外，閆小飛等[30]研究通過丹參素干預(yù)成骨細胞發(fā)現(xiàn)，后者細胞核內(nèi)β-catenin表達量要明顯高于對照組，并通過抑制該通路，進一步證實丹參素能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路來促進成骨細胞分化。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞增殖分化的調(diào)控機理，在丹參及其活性單體治療骨質(zhì)疏松癥的過程中發(fā)揮著重要作用。但由于目前有關(guān)文獻仍較為欠缺，因此還需后續(xù)研究進一步補充及深入探討(圖1)。

圖1 丹參及其活性單體介導(dǎo)Wnt信號通路抗骨質(zhì)疏松的作用機制Fig.1 Anti osteoporosis mechanism of Wnt signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.2 OPG/RANKL/RANK軸

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/RANKL/核因子κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor Kappa B，RANK)軸是近年來破骨細胞領(lǐng)域中研究較為廣泛的一種傳導(dǎo)機制。RANKL是誘導(dǎo)破骨前體細胞分化的重要細胞因子，由骨基質(zhì)細胞和成骨細胞產(chǎn)生，與RANK相結(jié)合后，可增強破骨細胞活性從而促進骨吸收[31]。而RANK是RANKL的最主要受體，常見于破骨細胞的胞膜上。OPG則為RANKL的另一種受體，可競爭性結(jié)合RANKL來阻斷RANK/RANKL信號通路的傳遞[32]。而腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(tumer necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)、NF-κB以及MAPK是RANKL/RANK軸的中下游信號位點，當(dāng)RANKL與RANK結(jié)合后，刺激信號會以級聯(lián)反應(yīng)方式沿著這些信號位點傳遞至NFATc1，而在破骨細胞分化的最后階段，NFATc1與c-Fos/c-Jun二聚體結(jié)合共同轉(zhuǎn)錄破骨細胞特異性基因，最終調(diào)節(jié)破骨細胞分化。

Wang等[33]通過實驗發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的破骨細胞中，丹酚酸B鎂可抑制RANKL、c-Src等表達，表明丹酚酸B通過抑制RANKL/RANK傳導(dǎo)途徑，抑制破骨細胞生成。張曉燕等[34]研究則發(fā)現(xiàn)，丹參素能夠通過調(diào)控OPG-RANKL-RANK軸，抑制破骨細胞活性；并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，丹參素可同時增加OPGmRNA和蛋白的表達，從而促進成骨細胞增殖[35]。由此可見，丹參及其活性單體可通過調(diào)控OPG-RANKL-RANK軸，抑制RANKL在破骨細胞中的信號傳導(dǎo)來抑制破骨細胞生成，最終起到治療骨質(zhì)疏松癥的作用(圖2)。

圖2 丹參及其活性單體介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK軸抗骨質(zhì)疏松的作用機制Fig.2 Mechanism of anti osteoporosis of OPG/RANKL/rank axis mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.3 MAPK信號通路

MAPK是一類絲裂原活化蛋白激酶，可將細胞外的刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，從而引起不同的細胞反應(yīng)。其主要有4條分支路線，其中與防治OP聯(lián)系密切的主要為ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及p38/MAPK三條分支[36-37]。而目前已有研究證實，丹參及其活性單體可通過調(diào)控MAPK信號通路來防止骨量流失。

夏慶泉等[38]發(fā)現(xiàn)，丹參注射液可通過激活ERK1/2傳導(dǎo)途徑，促進成骨細胞增殖分化。Xu等[39]研究則顯示，丹酚酸B對骨髓間充質(zhì)干細胞無明顯毒性作用，并且可顯著提高骨髓間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALT)活性、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和RUNX2表達，從而證實了丹酚酸B可通過激活ERK信號通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。除此之外，Cheng等[40]通過實驗發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA還能抑制RANKL誘導(dǎo)MAPK通路激活，導(dǎo)致破骨相關(guān)標志物cathepsin K、TRAF6、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase9，MMP9)和NFATc1的表達降低，從而抑制破骨細胞分化和生成。由此可見，丹參及其活性單體可通過調(diào)控MAPK信號通路的ERK分支，來保護骨髓間充質(zhì)干細胞及促進其成骨分化，并同時促進成骨細胞分化和抑制破骨細胞生成，最終起到防治OP的作用(圖3)。

圖3 丹參及其活性單體介導(dǎo)MAPK信號通路抗骨質(zhì)疏松的作用機制Fig.3 Anti osteoporosis mechanism of MAPK signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.4 NF-κB信號通路

NF-κB信號通路可通過影響破骨細胞生成及活化，從而在骨質(zhì)疏松癥的防治過程中發(fā)揮重要作用。靜息狀態(tài)下，p50或者p65以與核因子κB抑制因子A(recombinant inhibitory subunit of NF Kappa B Alpha，IκBα)形成共聚體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，而在外界相關(guān)信號如脂多糖、RANKL等刺激下，IκBα磷酸化并進行降解，使得p50或者p65進入細胞核內(nèi)，從而促進破骨細胞生成以及活化相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄[41]。而目前相關(guān)研究已證實，丹參及其活性單體可通過調(diào)控NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)骨性細胞的生物活性。王麗麗等[42]研究通過丹酚酸B干預(yù)小鼠后發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可有效降低NF-κB-p65和Cathepsin K的表達，改善干預(yù)組小鼠牙槽骨骨密度下降，并且發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可有效改善高脂飲食所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，最終防止小鼠牙槽骨骨質(zhì)流失。洪瑛等[43]研究則表明，丹參酮ⅡA可抑制重組人白介素1(IL-1beta protein，IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細胞中TRAF6、p65以及p-p65的表達，通過抑制NF-κB信號通路，從而改善IL-1β對軟骨細胞的炎性損傷。由此可見，丹參及其活性抗體可通過調(diào)控NF-κB信號通路，改善機體氧化應(yīng)激損傷以及軟骨細胞的炎性損傷，并同時抑制破骨細胞生成，從而防止機體的骨質(zhì)流失。但目前在抗骨質(zhì)疏松領(lǐng)域中，丹參及其活性單體調(diào)控NF-κB通路的相關(guān)性研究較少，這有待后續(xù)研究進一步探討(圖4)。

圖4 丹參及其活性單體介導(dǎo)NF-κB信號通路抗骨質(zhì)疏松的作用機制Fig.4 The anti-osteoporosis mechanism of NF-κB signal pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

2.5 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT作為機體內(nèi)關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，已被證實在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[44]。PI3K在受到上游激活信號后，其胞膜上的磷脂酰肌醇4，5(phosphatidylinositol-4，5-bisphos-phate，PIP2)會轉(zhuǎn)化成第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-bisphosphate，PIP3)，并作用于靶基因AKT，PIP3與AKT相結(jié)合，活化AKT[45]，傳遞信號至下游效應(yīng)分子，進而調(diào)節(jié)下游多種激酶，影響細胞的分化和代謝效果，最終對骨質(zhì)疏松起到防治作用。

其中，李汪洋等[46]研究發(fā)現(xiàn)，紫草酸能通過上調(diào)B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和p-Akt，下調(diào)Bax，從而緩解H2O2誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡。曹慧敏等[47]研究則發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可降低內(nèi)皮細胞中丙二醛的含量，增強超氧化物歧化酶的活性，促進其自噬，并同時檢測細胞中PI3K、AKT以及p-雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)的表達，從而表明丹參酮ⅡA可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT促進自噬，對內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷起到一定的保護作用。孟如丹等[48]亦通過實驗證實，丹參酮ⅡA可通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制軟骨細胞的炎癥反應(yīng)，從而對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞起到保護作用。除此之外，林院等[49]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可通過激活PI3K/AKT信號通路，上調(diào) OPN、ALP和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)表達，從而刺激MC3T3-E1細胞成骨分化。由此可見，丹參及其活性單體可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，影響相關(guān)骨性細胞的增殖、凋亡、自噬、抗氧化以及炎癥反應(yīng)，從而起到防治骨質(zhì)疏松的作用(圖5)。

圖5 丹參及其活性單體介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路抗骨質(zhì)疏松的作用機制Fig.5 Anti osteoporosis mechanism of PI3K/Akt signaling pathway mediated by salvia miltiorrhiza and its active monomers

3 總結(jié)與展望

目前有關(guān)丹參防治OP的研究較為零散，多數(shù)僅僅局限于某個活性單體在某種骨性細胞上的作用，而中醫(yī)治療具有多靶點、多途徑的特點，因此本文通過總結(jié)近年來丹參及其活性單體在該領(lǐng)域的相關(guān)研究，從整體方面來對丹參的抗骨質(zhì)疏松機制進行探討。并通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)，丹參及其活性單體相對西藥毒性較小，其主要通過調(diào)控Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK、NF-κB、PI3K/AKT信號通路以及MAPK信號通路的ERK分支，促進骨形成、抑制骨吸收，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。并且還發(fā)現(xiàn)，丹參及其活性單體調(diào)控骨性細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)是其抗骨質(zhì)疏松的另外一種重要方式。

相關(guān)研究表明[50]，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致成骨細胞體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧，進而抑制其分化，成骨細胞數(shù)量減少使得骨質(zhì)流失加速；同時，氧化應(yīng)激與前體破骨細胞內(nèi)抗氧化酶、谷胱甘肽水平降低以及NADPH氧化酶的激活有關(guān)，激活前體破骨細胞分化，從而增強骨吸收[51]。由此可見，進一步深化丹參抗氧化與骨代謝平衡之間的機制研究，將對今后中醫(yī)藥抗骨質(zhì)疏松具有重要意義。除此之外，本文還發(fā)現(xiàn)該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀存在如下問題，目前有關(guān)研究多集中于丹參素、丹酚酸B 、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等幾種活性單體，其余成分研究較少，且目前調(diào)控機制研究的有關(guān)驗證也略顯不足，這都有待后續(xù)研究進一步探討與完善。

但總體來說，在促進骨形成和抑制骨吸收，尤其是在改善骨性細胞氧化應(yīng)激損傷方面，丹參及其活性單體具有一定的研究前景，相關(guān)中藥通過改善骨性細胞氧化應(yīng)激損傷也將是今后中醫(yī)藥抗骨質(zhì)疏松研究的一種新思路。