結(jié)核分枝桿菌感染檢測兩步法在學校結(jié)核病篩查中的應用價值

董小偉 郭卉欣 張晨晨 王嘉雯 何俊磊 李觀海 李建偉 溫文沛

為減少學校結(jié)核病疫情的發(fā)生，國家衛(wèi)生健康委員會和教育部門要求將結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染檢測納入高中及以下學生人群健康體檢必檢項目［1-3］。當前，MTB感染的篩查沒有一致的共識，主要方法有結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）和γ-干擾素釋放試驗（interferon-γrelease assays，IGRA）［4］。其 中，TST檢測操作簡單，經(jīng)濟實惠，應用最廣，為學校結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）篩查和結(jié)核病患者的主動發(fā)現(xiàn)奠定了堅實的基礎，但其檢測結(jié)果的特異性具有明顯局限性［5］；而IGRA 的特異度雖大大提高，但技術(shù)要求高，操作復雜，且費用較高，也是限制其廣泛應用的主要問題。鑒于TST和IGRA各具優(yōu)勢，越來越多的研究建議將兩者聯(lián)合應用，即在TST檢測陽性后再聯(lián)合IGRA檢測，稱之為MTB感染檢測“兩步法”，以降低檢測成本并提高檢測特異度。

為評估學生人群MTB感染水平，以及預防性服藥治療的有效性和安全性，廣東省結(jié)核病控制中心于2017年開始承擔“十三五”國家科技重大專項課題結(jié)核病重點人群干預策略研究——學生人群潛伏感染干預技術(shù)的科研任務，先后在廣州、佛山、陽江和汕尾等地市的初中、高中和大學等各個層級學校開展了大規(guī)模學生人群TST、IGRA 和胸部X線攝片（簡稱“胸片”）檢查，并進一步對TST和IGRA均陽性且排除活動性肺結(jié)核的學生人群作為LTBI者開展預防性服藥治療的隨機對照臨床試驗研究?，F(xiàn)筆者通過分析TST 和IGRA 對MTB感染檢測的一致性，分析二者優(yōu)劣，初步評估“兩步法”在學校結(jié)核病篩查中的作用，為學校有效開展MTB感染檢測和肺結(jié)核篩查提供一種可行的思路和參考。

對象和方法

一、研究對象

采用橫斷面研究方法，從上述課題中選取2017—2021年廣東省有TST和IGRA 檢測及胸片等結(jié)核病檢查項目的74 358名學生資料進行分析。其中，男性40007名（53.80%），女性32987名（44.36%），性別資料缺失1364名（1.84%）；平均年齡為（16.0±2.5）歲，14 歲及以下16 129 名（21.69%），15～17歲34 551名（46.47%），18歲及以上21 161名（28.46%），年齡資料缺失者2517名（3.38%）；50 701 名（68.18%）完成了胸片篩查；74 148 名（99.72%）完成了TST篩查；9702名（13.08%）TST陽性者進一步完成IGRA檢測。

二、研究方法

1.TST檢測：試驗試劑采用成都生物制品研究所有限責任公司的卡介苗純化蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin of Bacillus，BCGPPD），由統(tǒng)一培訓的醫(yī)護人員于學生左前臂掌側(cè)1/3中央皮內(nèi)注射5 IU BCG-PPD，72 h 后檢查TST反應，測量皮膚硬結(jié)平均直徑。以硬結(jié)平均直徑＜5 mm或無反應者為陰性，5～＜10 mm 為一般陽性，10～＜15 mm 為中度陽性，≥15 mm 或局部出現(xiàn)雙圈、水皰、壞死及淋巴管炎者為強陽性。依據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》標準規(guī)范性附錄D—結(jié)核菌素皮膚試驗標準，本研究以硬結(jié)平均直徑≥10 mm為MTB感染判定標準。

2.IGRA 檢測：采用T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗法（T-SPOT.TB），試劑采用廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB試劑盒并嚴格按照試劑盒說明書進行。采集靜脈血6 ml，肝素抗凝，淋巴細胞分離液分離得到外周血單個核細胞（PBMC）并制備成濃度為2.5×106/ml的細胞懸液。每份測試樣本需要4個檢測孔，以細胞培養(yǎng)液作為陰性對照、植物血凝素（PHA）作為陽性對照、MTB早期分泌抗原靶6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）作為特異性刺激抗原，每孔加入0.1 ml制備好的細胞懸液，將微孔板放在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日洗板后加入生物素標記的抗體（小鼠抗人γ-干擾素單抗）于2～8℃反應1 h，洗板后加入顯色底物液室溫靜置7 min，去離子水終止反應，觀察結(jié)果。使用酶聯(lián)斑點分析儀計數(shù)著色的斑點，每1個點代表1個分泌γ-干擾素（IFN-γ）的T淋巴細胞，并按照說明書的標準進行結(jié)果判定。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)性變量經(jīng)正態(tài)性檢測后，正態(tài)分布的計量資料采用“”描述；計數(shù)資料采用“百分率（%）”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義?？紤]到IGRA 是采用卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌缺失的ESAT-6和CFP-10等作為抗原刺激物，具有良好的特異性；本研究以IGRA檢測結(jié)果為MTB 感染檢測效能的參照標準，分別評估TST 和“兩步法”檢測對學生人群MTB感染和活動性肺結(jié)核的篩查效果。采用Kappa檢驗評價兩種檢測結(jié)果的一致性，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好、0.4～＜0.75為兩者一致性一般、＜0.4為一致性較差。

結(jié)果

一、TST和IGRA篩查情況

74 148名（99.72%）學生完成了TST 篩查，結(jié)果顯示：陰性51 114名（68.93%）、一般陽性14 382名（19.40%）、中度陽性7111名（9.59%）、強陽性1541名（2.08%）；TST 檢測陽性率為31.07%，強陽性率為2.08%。結(jié)合個人意愿及陽性情況，對9702名（13.08%）TST 檢測陽性者進一步開展IGRA檢測，發(fā)現(xiàn)陽性者887名（9.14%）。最終經(jīng)胸片和病原學檢查診斷為活動性肺結(jié)核患者17例（圖1）。不同學習階段學生人群TST 和IGRA 篩查結(jié)果分布情況見表1。

圖1 研究對象經(jīng)TST和IGRA篩查和診斷結(jié)果

二、TST和IGRA檢測MTB感染一致性比較

9702名學生同時完成了TST 和IGRA 試驗，以IGRA檢測結(jié)果為參照標準，以TST硬結(jié)平均直徑5、10和15 mm 為陽性臨界值時，兩種篩查方法的一致率分別為15.97%、26.63%和81.11%，Kappa值分別為0.014、0.014和0.112。TST 檢測MTB感染的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值見表2。

表2 以IGRA檢測結(jié)果為參照標準不同陽性臨界值下TST對MTB感染的檢測效能

三、TST和“兩步法”檢測MTB 感染情況的比較

完成TST檢測的74 148名學生中，TST 檢測MTB 感染率（11.67%）明顯高于“兩步法”（1.02%），差異有統(tǒng)計學意義，具體見表3。

表3 TST和兩步法判定74 148名學生人群MTB感染情況

四、TST和“兩步法”檢測肺結(jié)核能力的比較

最終共確診篩查學生肺結(jié)核患者17例，包括病原學陽性9 例、病原學陰性8 例。其中，5219 名TST中陽或強陽者經(jīng)胸片、病原學等檢查確診肺結(jié)核15 例，患者檢出率為0.29%；759 名TST 和IGRA 雙陽者經(jīng)胸片和病原學等檢查確診肺結(jié)核14例，患者檢出率為1.84%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=30.133，P＜0.001）。同時，兩步法對肺結(jié)核的檢出率也高于TST強陽者檢出率，兩者間差異也有統(tǒng)計學意義（χ2=5.860，P=0.015），具體見表4。

表4 TST和兩步法對肺結(jié)核檢出率的比較

討 論

學校是人群密集場所，易發(fā)生結(jié)核病疫情，甚至是突發(fā)公共衛(wèi)生事件，影響社會穩(wěn)定；而新生入學體檢進行結(jié)核病篩查，可及早發(fā)現(xiàn)傳染源，實現(xiàn)防控關(guān)口前移，避免校園內(nèi)傳播。國家衛(wèi)生健康委員會和教育部門陸續(xù)發(fā)文要求對MTB感染篩查中發(fā)現(xiàn)的TST強陽性或IGRA 陽性者進一步開展胸片等結(jié)核病相關(guān)檢查，并建議有肺結(jié)核患者密切接觸史或其他高危因素時進行預防性服藥治療［1-3］。在這種背景下，在學生人群中開展TST 和IGRA 檢測MTB感染的一致性研究十分必要。

本研究發(fā)現(xiàn)，學生人群中TST 和IGRA 對于MTB感染的檢測一致率較差，與既往研究結(jié)論基本一致［6-8］。Li等［6］研究發(fā)現(xiàn)5～15歲兒童和青少年中，TST與IGRA 對MTB感染檢測的一致率為88.0%，Kappa值為0.125；祁雪等［7］曾對19 093例年齡＜15 歲的住院兒童進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)TST 與IGRA檢測MTB感染的一致率為95.2%～97.5%；Kappa值為0.17～0.19。本研究以IGRA 檢測結(jié)果為參照標準，在以TST檢測硬結(jié)平均直徑10 mm為陽性臨界值、在保證較高敏感度的基礎上，發(fā)現(xiàn)兩步法檢測可大幅提高TST檢測特異度，與既往研究基本一致［9］；同時，TST和IGRA檢測MTB感染的一致率，以及TST陽性臨界值設定為5 mm/10 mm時TST 的特異度等兩項指標均低于既往研究水平［9］，可能與本研究兩步法檢測納入了TST＜5 mm一致率較高學生人群的比例過少有關(guān)。

本研究首次驗證了在學生人群中開展MTB感染檢測“兩步法”的可行性。本研究在學生健康體檢中，首先開展TST檢測，然后進一步對TST中陽及強陽的人群進行IGRA檢測，發(fā)現(xiàn)1.02%的學生呈現(xiàn)雙陽性，對比TST 檢測將中陽及強陽性者（11.67%）判定為MTB感染者，大幅縮小了MTB感染和預防性服藥治療對象的判定范圍，認為“兩步法”提高了檢測MTB感染的精準性?？紤]與IGRA排除了TST檢測中因卡介苗和部分非結(jié)核分枝桿菌影響致假陽性有關(guān)。這與既往研究觀點一致。高磊等［10］曾于2020年探討過在中國學生人群中，在常規(guī)入學體檢工作中可結(jié)合當?shù)貙嶋H條件選擇TST+IGRA兩步法以提高檢測MTB感染的特異度，減少假陽性，并在控制成本的前提下盡可能準確界定患者發(fā)現(xiàn)的目標人群，提高工作可行性。目前，普遍認為在卡介苗接種率高的國家，TST 檢測MTB感染時可導致假陽性結(jié)果，從而過高估計感染負擔［6，11］?！皟刹椒ā笨蓽p少TST 假陽性結(jié)果造成的不必要的后續(xù)患者發(fā)現(xiàn)和預防干預資源投入，是符合成本效益的篩查策略［12-15］，已被眾多國家列為MTB 感染檢測策略納入國家結(jié)核病防控指南［16-21］。目前，筆者也在對經(jīng)TST判定和兩步法判定且通過胸部影像學等檢查已排除活動性肺結(jié)核的LTBI者進行登記隨訪追蹤，比較各自后續(xù)發(fā)病風險。

針對“雙陽者”再進一步開展胸片、結(jié)核病病原學等檢查，在保證肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)比例的基礎之上，可大幅提高患者檢出率。若按照當前衛(wèi)生部門和教育部門印發(fā)的相關(guān)規(guī)范［1-2］，新生入學體檢中僅對篩查發(fā)現(xiàn)的TST強陽者開展進一步檢查，則只能檢出8例學生肺結(jié)核患者；若對兩步法篩查發(fā)現(xiàn)的雙陽者進一步開展檢查則可檢出肺結(jié)核14例，從患者發(fā)現(xiàn)數(shù)量來看，兩步法顯示出了優(yōu)勢。故認為“兩步法”可大大減少胸片的使用，降低了X 線輻射對學生人群身體健康的損害。

本研究有以下局限性：首先，本研究有99.72%的學生完成了TST篩查，但僅68.18%同時完成了胸片檢查，無法獲取學生人群中肺結(jié)核患者總數(shù)，無法計算通過兩步法發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核患者數(shù)占肺結(jié)核患者總數(shù)的比例（即發(fā)現(xiàn)能力）。其次，IGRA 對檢測條件和技術(shù)的要求相對更高，操作程序相對復雜，且費用昂貴。即使在第一步的TST篩查后已大大減少了IGRA篩查的對象數(shù)量，但在大規(guī)模學生人群篩查使用時還需綜合權(quán)衡考量。

綜上，TST和IGRA 檢測MTB感染的一致性差，兩步法檢測可大幅提高MTB感染的精準性和篩查肺結(jié)核患者的效率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻董小偉：實施研究，整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；郭卉欣：醞釀和設計實驗，實施研究；張晨晨和何俊磊：實施研究，采集數(shù)據(jù)；王嘉雯：采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析；李觀海：采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)；李建偉：分析/解釋數(shù)據(jù)，指導研究實施；溫文沛：獲取研究經(jīng)費，指導研究實施和論文修改