基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討火麻仁治療便秘的作用機(jī)制*

李煥

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046

便秘是一種消化系統(tǒng)常見癥狀，以功能性便秘(functional constipation，F(xiàn)C)居多[1]，其特點(diǎn)有大便次數(shù)減少、排便難，或兩者兼有，排便難包括排便費(fèi)力、大便不盡感、糞便干、大便時(shí)間延長(zhǎng)，甚至需手法輔助排便等。便秘主要有三種類型，分別為功能性便秘、緩慢的傳輸和排泄功能障礙[2]。慢性便秘的病程至少6個(gè)月[3]。目前文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)普通成年人群便秘的患病率為3.19%～11.6%[4-7]，且患病率隨年齡上漲而增加，有研究發(fā)現(xiàn)，便秘主要發(fā)生在女性患者中，同時(shí)社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位較低的人群便秘患病率也較高[8]。慢性便秘的反復(fù)發(fā)作雖不危及生命，但會(huì)增加高血壓、心腦血管疾病、缺血性卒中的致死率[9]，降低患者的生活質(zhì)量。目前，臨床上治療便秘的藥物沒有統(tǒng)一規(guī)范，化學(xué)藥物和中藥均廣泛運(yùn)用[10]，主要可分為四類：刺激性瀉劑、滲透性瀉劑、促分泌劑、促動(dòng)力劑[11]。

中醫(yī)認(rèn)為，便秘的主要病因?yàn)榇竽c傳導(dǎo)失常、胃腸積熱、機(jī)體津虧血少、氣虛陽(yáng)衰、陰寒積滯和氣機(jī)郁滯等[12]。中醫(yī)藥治療便秘積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，如 《傷寒論》中的蜜煎導(dǎo)法，所記載的麻子仁丸至今仍廣泛使用，該方中火麻仁作為君藥發(fā)揮了顯著作用[13]?；鹇槿?，味甘，性平，歸脾、胃、大腸經(jīng)，有“潤(rùn)燥滑腸”的功效[14]，主要用于血虛津虧腸燥型便秘?！侗静菔觥费浴奥樽尤剩茄幎谢?，不益氣而有行氣之用”，其化血作用對(duì)津血虧虛的便秘更為適用[15]?；鹇槿士膳c厚樸、枳實(shí)配伍以通暢氣機(jī)、瀉濁通腑；也可配伍玄參、生地黃增液通腑；配伍大黃以通腑瀉熱、導(dǎo)痰下行[16]?，F(xiàn)代藥理證實(shí)，火麻仁富含的脂肪油可刺激腸黏膜，使分泌增多，蠕動(dòng)加快，減少大腸吸收水分，從而發(fā)揮瀉下的作用[17]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念由Andrew L Hopkins于2007年首次提出[18-19]，基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用，系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病的影響，從而揭示藥物發(fā)揮作用的奧秘。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，多靶點(diǎn)的給藥模式突破了傳統(tǒng)的單靶點(diǎn)研究模式的束縛，從“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”出發(fā)使傳統(tǒng)新藥研發(fā)理念發(fā)生變化，對(duì)中醫(yī)藥的整體性、系統(tǒng)性研究起到了重要支撐作用。本文將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)火麻仁治療便秘的有效成分及作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床中醫(yī)藥治療便秘提供思路。

1 資料與方法

1.1 火麻仁有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的挖掘藥物必須通過吸收、分布、代謝、排泄等過程到達(dá)靶器官或組織發(fā)揮作用，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)是篩選藥物成分的重要參數(shù)。OB是指藥物經(jīng)口服進(jìn)入人體后，被機(jī)體吸收進(jìn)入全身血液循環(huán)的相對(duì)量和速率，是藥代動(dòng)力學(xué)最重要的參數(shù)之一；DL是指化合物與Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)里所有已知藥物之間的相似程度，類藥性指數(shù)越低，則表示該化合物越不適合作為藥物。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)[20]，在“Herb name”檢索框里輸入“火麻仁”進(jìn)行檢索，篩選同時(shí)符合OB≥30%和DL≥0.18[21]這兩個(gè)條件的藥物活性成分，并提取藥物活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，為使蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息標(biāo)準(zhǔn)化，使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org)[22]進(jìn)行規(guī)范。

1.2 便秘疾病靶點(diǎn)的挖掘利用DisGeNET(https：//www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[23]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)[24]、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)以“constipation”為關(guān)鍵詞，檢索便秘相關(guān)治療靶點(diǎn)信息，Score值越大則代表該靶點(diǎn)與疾病關(guān)系越密切，設(shè)置Score≥0.9，將所得到的靶點(diǎn)整理成靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 火麻仁治療便秘潛在作用靶點(diǎn)的篩選利用Draw Venn Digram(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線工具將火麻仁活性成分靶點(diǎn)與便秘疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，制作成韋恩圖，交集部分為火麻仁治療便秘的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將潛在靶點(diǎn)蛋白以multiple proteins的形式上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)[25]，研究物種選擇為“Homo Sapiens”，“minimum required interaction score”采用默認(rèn)值0.400，“max number of interactors to show”采用默認(rèn)參數(shù)，構(gòu)建潛在靶點(diǎn)的蛋白作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)[26-27]對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。GO功能富集分析包括分子組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)三個(gè)部分。

1.6 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析使用R語(yǔ)言軟件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，運(yùn)行R語(yǔ)言得到KEGG富集分析的氣泡圖。

1.7 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析利用Cytoscape3.6.0軟件(https：//cytoscape.org/index.html/)[28]構(gòu)建“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步探討火麻仁中藥的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 火麻仁有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn)以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選得到火麻仁有效成分6個(gè)，分別為花生四烯酸(arachidonic acid)、谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、二十碳烯醇(gondoic acid)、木犀草素(luteolin)、(Z)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]acrylamide，見表1?；钚猿煞窒嚓P(guān)靶點(diǎn)531個(gè)，通過初步去重及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步篩選，共得到199個(gè)靶點(diǎn)。

表1 火麻仁活性成分信息表

2.2 便秘相關(guān)作用靶點(diǎn)及火麻仁治療便秘的潛在作用靶點(diǎn)設(shè)置Score≥0.9，利用DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并去重后得到便秘靶點(diǎn)742個(gè)。應(yīng)用Draw Venn Diagram在線工具，繪制韋恩圖，通過靶點(diǎn)映射取交集共得到潛在作用靶點(diǎn)32個(gè)。見圖1。

圖1 火麻仁與便秘共有靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖將32個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到火麻仁治療便秘潛在靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2，連線越密集的靶點(diǎn)越重要。該網(wǎng)絡(luò)圖共涉及32個(gè)節(jié)點(diǎn)，116條邊，平均自由度7.25。其度值前10的蛋白分別有：1型膠原(collagen type 1，Col1a1)、張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1)、胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞(islet cell tumor cells，INS-1)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、B細(xì)胞編碼κ輕鏈多肽抑制基因(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-Cells，kinase gamma,IKBKG)、外周血過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor，PPARG)、髓細(xì)胞組織增生蛋白(myelocy tomatosis proteins)、肝細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1A)、雄激素受體(androgen receptor，AR)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)32個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析得到CC 15個(gè)條目，MF 27個(gè)條目，BP 123個(gè)條目。排名前10位的CC分別是細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)、胞外區(qū)(extracellular region)、漿膜(plasma membrane)、細(xì)胞外空隙(extracellular space)、核漿(nucleoplasm)、線粒體(mitochondrion)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、蛋白質(zhì)復(fù)合體(protein complex)、膠原蛋白三聚物(collagen trimer)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)；排名前10位的MF分別是蛋白結(jié)合(protein binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity，sequence-specific DNA binding)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合(transcription regulatory region DNA binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、異源二聚體蛋白活性(protein heterodimerization activity)、序列特異性DNA結(jié)合(sequence-specific DNA binding)、同源二聚體蛋白活性(protein homodimerization activity)；排名前10位的BP分別是RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、藥物反應(yīng)(response to drug)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)(glucose homeostasis)、細(xì)胞增殖(cell proliferation)、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription，DNA-templated)、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控(negative regulation of cell proliferation)、細(xì)胞增殖正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控(negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)(cellular response to DNA damage stimulus)、基因表達(dá)正調(diào)控(positive regulation of gene expression)。見圖3、圖4、圖5。

圖3 CC富集條形圖

圖4 BP富集條形圖

圖5 MF富集條形圖

2.5 KEGG通路分析使用R語(yǔ)言軟件對(duì)32個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到86條通路，并繪制了顯著性前20的通路的氣泡圖，橫坐標(biāo)表示靶點(diǎn)數(shù)，縱坐標(biāo)表示通路名稱，通路上靶點(diǎn)數(shù)越多顏色越紅，靶點(diǎn)數(shù)越少顏色越藍(lán)。涉及到磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路、人乳頭瘤病毒感染(human papillomavirus infection)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、前列腺癌(prostate cancer)、丙型肝炎(hepatitis C)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)、糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy)、癌癥蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)、癌癥中心碳代謝(central carbon metabolism in cancer)、小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer)、胰島素抵抗(insulin resistance)、鞘脂信號(hào)通路(sphingolipid signaling pathway)、腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、發(fā)病型糖尿病(maturity onset diabetes of the young)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)等信號(hào)通路。見圖6。

圖6 KEGG富集氣泡圖

2.6 火麻仁-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0軟件繪制火麻仁-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖7，淡綠色代表藥物，紫色代表藥物活性成分，黃色代表靶點(diǎn)。連線越密集、圖形越大且顏色越深的節(jié)點(diǎn)越重要。

圖7 火麻仁-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

便秘之癥首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，將其稱之為“大便難”和“后不利”。張仲景所著《傷寒雜病論》中將該病稱之為 “脾約”。張景岳《景岳全書》將便秘分為陽(yáng)結(jié)、陰結(jié)兩類?！氨忝亍?一名則首見于清代沈金鏊所著 《雜病源流犀燭》一書，并沿用至今[29]。從理論上來講，慢性便秘并不會(huì)提高病死率，但相關(guān)研究顯示，長(zhǎng)期便秘者的總病死率仍高于無便秘者[30]，且對(duì)患病者的生活造成了很多不便。

火麻仁具有緩解便秘狀態(tài)、抗氧化、抑炎、調(diào)節(jié)脂代謝、抑制血小板聚集、改善記憶力、提高免疫力等藥理作用[31]。實(shí)驗(yàn)研究顯示，火麻仁能夠促進(jìn)大鼠膽汁的分泌，抑制小鼠胃腸蠕動(dòng)和番瀉葉引起的腹瀉[32]。麻子仁片具有瀉下作用，對(duì)小鼠每天進(jìn)行1次灌胃，連續(xù)灌胃4 d后，可顯著增加小鼠的排便次數(shù)[33]。慢性便秘是老年人常見的疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，火麻仁富含膳食纖維(約28%)，可以有效改善老年人慢性便秘[34]。

火麻仁的活性成分中，花生四烯酸具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液黏度，調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能等一系列生理活性。同時(shí)，花生四烯酸對(duì)預(yù)防心血管疾病、 糖尿病和腫瘤等具有重要功效。β-谷甾醇能夠以濃度依賴的方式降低結(jié)腸炎小鼠腸道組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，并顯著增加腸上皮細(xì)胞中抗菌肽的表達(dá)，降低腸道炎癥病原菌的存活率，減輕炎癥對(duì)腸道環(huán)境的干擾[35]。豆甾醇又稱豆固醇，是一種植物甾醇，廣泛存在于多種植物種子中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗感染、降低膽固醇、保護(hù)精神狀況、鎮(zhèn)痛和抗糖尿病作用[36]。豆甾醇和 β-谷甾醇均可減輕脂質(zhì)蓄積造成的肝細(xì)胞過氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)胞的解毒功能[37]。木犀草素能夠降低平滑肌細(xì)胞AKT磷酸化水平，抑制PI3K/AKT通路激活，從而抑制平滑肌增殖[38]，還可通過減少一氧化氮產(chǎn)生抑制結(jié)腸平滑肌收縮，使結(jié)腸運(yùn)動(dòng)變得遲緩，導(dǎo)致便秘發(fā)生[39]。

GO分析表明，火麻仁可通過RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、藥物反應(yīng)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等生物過程，發(fā)揮蛋白結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、鋅離子結(jié)合等分子功能。PPI結(jié)果顯示：COL1A1、PTEN、AKT1等靶點(diǎn)與其余靶點(diǎn)相互作用更強(qiáng)，互動(dòng)更好，其中AKT1主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[40]，可能對(duì)腸道動(dòng)力學(xué)發(fā)揮作用[41]，但目前研究較少，機(jī)制尚不明確。

綜上，火麻仁可通過多靶點(diǎn)、多機(jī)制改善便秘的癥狀，為臨床中醫(yī)藥治療便秘提供相應(yīng)的理論依據(jù)。本研究也進(jìn)一步證實(shí)，在現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的背景下，中藥治病的作用機(jī)制可得到新的闡釋，進(jìn)而增加中藥的科學(xué)性和實(shí)用性。但該研究并未通過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有必要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果，增加結(jié)果的可信度。