朱留鑫,楊建,司東明,路永坤,李鵬飛,楊建軍
河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450001
蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage,SAH)是臨床上常見的一種腦血管疾病,多由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂、腦動(dòng)脈畸形、高血壓、外傷等因素造成,患者發(fā)病年齡低,致殘、致死率極高,每10萬人中有7.2~10.5人患此病,約占中風(fēng)的5%,嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和臨床經(jīng)驗(yàn)的積累,患者死亡率和致殘率有所下降。因動(dòng)脈瘤破裂出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的發(fā)生率較高,SAH患者遭受持久的心理和身體影響[3]。早期腦損傷(early brain injury,EBI)和腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要并發(fā)癥[4]。研究表明,EBI的主要原因有神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡[5-6]。目前,通過藥物抑制劑或基因干預(yù)技術(shù)抑制炎癥反應(yīng)已成為治療SAH所致腦損傷的一種策略。紅花具有多種功能,已有千年的栽培和用藥歷史,常用于治療各種疾病,如婦科、心血管、腦血管疾病以及瘀血、骨質(zhì)疏松癥等[7-9]。研究表明,紅花的主要有效成分紅花多糖具有抗氧化、抗癌、降血壓、抗凝血、抗感染及增強(qiáng)免疫等作用[10-15]?;诖耍緦?shí)驗(yàn)探討紅花多糖對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠早期腦損傷的保護(hù)作用。
1.1 動(dòng)物50只4~6月齡健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量300~350 g,購自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(滬)[2017-005]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過,倫理批號(hào):DWLL202007011。按需給予食物和水,定期更換墊料、清理和消毒。
1.2 藥物與試劑紅花(河北省安國市遠(yuǎn)光藥業(yè)有限公司,批號(hào):0467191601);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):C0065、P8080、E8040);抗白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗體、抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體、抗IL-1β抗體、抗IL-18抗體(美國Abcam公司,貨號(hào):ab233706、ab183218、ab216995、ab243091);半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶1(caspase1)抗體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)二抗(美國Santa Cruz公司,貨號(hào):sc-398715、sc-134306、sc-514414、sc-8432、sc-358798);活性氧(reactive oxygen species,ROS)測(cè)定試劑盒(化學(xué)熒光法)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):E004、G001-4);PierceTMBCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司,貨號(hào):23225)。
1.3 儀器全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):Synergy HTX);CO2培養(yǎng)箱(德國 Binder 公司,型號(hào):C170);超薄切片機(jī)(德國 Leica 公司,型號(hào):EMUC7);垂直電泳槽(美國 Bio-Rad公司,型號(hào):MiniProtein)。
2.1 紅花多糖溶液的制備將干燥紅花200 g在 2 L 水中充分浸泡后煎煮1 h,共煎煮4次。將濾液混合濃縮至總體積的1/4后,加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇,用醇沉法沉淀得到紅花多糖(safflower polysaccharide,SPS),200 g·min-1離心5 min,將SPS溶解于去離子水中,用乙醇沉淀2次。采用硫酸-苯酚法測(cè)定SPS含量,純度可達(dá)76.05%,用PBS將SPS配制成濃度為40 g·L-1的溶液。
2.2 SAH模型建立、動(dòng)物分組與給藥隨機(jī)從50只SD大鼠中選取15只為假手術(shù)組,其余大鼠建立SAH動(dòng)物模型[16],具體如下:以40 mg·kg-1的劑量腹腔注射1%戊巴比妥麻醉大鼠后,進(jìn)行常規(guī)備皮和消毒,在大鼠頸部進(jìn)行手術(shù)切口,充分暴露右側(cè)總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,將頸外動(dòng)脈向遠(yuǎn)端橫切后將3-0單絲尼龍縫合線置于內(nèi)部,通過頸內(nèi)動(dòng)脈插入并推進(jìn)直至感覺到阻力。將縫合線進(jìn)一步推進(jìn)約3~5 mm進(jìn)行動(dòng)脈穿孔并產(chǎn)生SAH,停留10 s后拔出尼龍線。假手術(shù)組大鼠除了不刺破血管壁外,其余操作均與造模大鼠一致。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組和紅花多糖組,每組15只。紅花多糖組大鼠給予400 mg·kg-1的紅花多糖溶液灌胃,假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水,每天1次,持續(xù)14 d。
2.3 SAH大鼠神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分通過對(duì)大鼠自主運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、身體活動(dòng)和軀體感覺等評(píng)估SAH大鼠的神經(jīng)功能[17]。根據(jù)改良Garcia評(píng)分,對(duì)觸電反應(yīng)、肢體對(duì)稱性、本體感覺、攀爬、自發(fā)活動(dòng)、前肢伸展等6項(xiàng)測(cè)試進(jìn)行評(píng)分,并測(cè)量總分,得分越低表明損傷越嚴(yán)重。一個(gè)獨(dú)立的觀察者進(jìn)行所有的評(píng)估。
2.4 SAH大鼠腦水腫評(píng)估每組取10只大鼠,于末次給藥24 h后斷頭處死,取整個(gè)大腦并直接稱其質(zhì)量。大鼠的大腦在100 ℃脫水24 h后,稱其干質(zhì)量。
腦含水量的百分比=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%
2.5 ROS測(cè)定每組取5只大鼠,于末次給藥 24 h 后麻醉斷頭處死,分離腦組織。取每只大鼠的新鮮腦組織0.5 g,按質(zhì)量體積比120的比例加入PBS,對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行勻漿。勻漿液在4 ℃下 1 000 r·min-1離心10 min,取上清,取1 mol·L-1DCFH-DA 10 μL和上清液190 μL混合于96孔板中,190 μL上清液中加入10 μL PBS作為對(duì)照。樣品在3 ℃、480 nm激發(fā)波長(zhǎng)和520 nm發(fā)射波長(zhǎng)下孵育30 min后,用熒光分光光度法檢測(cè)ROS的水平,ROS水平以熒光強(qiáng)度/克蛋白表示。
2.6 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平將儲(chǔ)存于-80 ℃的大鼠腦組織剪成小塊,加入RIPA裂解液(含0.2 % SDS)進(jìn)行裂解,然后在4 ℃下 14 000 g 離心10 min。收集細(xì)胞總蛋白,并加入1×SDS上樣緩沖液。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)量蛋白質(zhì)含量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,并在室溫下用PBST和5%BSA封閉 1 h。加入一抗(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、 cleaved caspase 1、NLRP3、ASC稀釋比例為1500,β-actin稀釋比例為11 000),4 ℃孵育過夜。然后加入HRP二抗(稀釋比例為1500),在室溫下孵育1 h。使用ECL Western印跡試劑盒對(duì)膜顯色,Image J軟件分析,并用光密度測(cè)定法計(jì)算目的蛋白與β-actin蛋白條帶的比值。
2.7 熒光染色于末次給藥24 h后麻醉斷頭處死,分離腦組織。大鼠腦部組織切片,加入體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫液,PBS連續(xù)沖洗3次,每次3 min;滴加濃度為0.1%檸檬酸鈉通透液,4 ℃孵育2 min;向切片滴加1 g·L-1PI蓋住組織,放置在4 ℃冰箱中。常溫下進(jìn)行45 min復(fù)溫,PBS沖洗3次,并加入 1 mg·L-1DAPI染色液將標(biāo)本進(jìn)行覆蓋。15 min 后將多余的DAPI染色液去除,PBS清洗3次,每次 3 min。DAPI 染色完畢后加入淬滅封片劑完成封片處理,熒光顯微鏡下觀察切片細(xì)胞情況,每組5只。
PI陽性率=PI陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%
2.8 TUNEL分析評(píng)估大腦皮層中細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度將制備好的切片用TUNEL染色混合物處理,37 ℃下在潮濕的暗室中孵育60 min。在黑暗中于22 ℃下添加DAPI底物,孵育5 min。通過熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)所有過程,每組5只。TUNEL陽性率是根據(jù)TUNEL染色試劑盒制造商的說明書進(jìn)行的。
TUENL陽性率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%
3.1 紅花多糖對(duì)SAH大鼠神經(jīng)功能的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低;與模型組相比,紅花多糖組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 紅花多糖對(duì)SAH大鼠神經(jīng)功能的影響
3.2 紅花多糖對(duì)SAH大鼠腦水腫的影響與假手術(shù)組相比,模型組腦組織含水量升高;與模型組相比,紅花多糖組腦組織含水量降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 紅花多糖對(duì)SAH大鼠腦水腫的影響
3.3 紅花多糖對(duì)SAH大鼠ROS的影響與假手術(shù)組相比,模型組腦組織ROS含量升高;與模型組相比,紅花多糖組大鼠腦組織ROS含量降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 紅花多糖對(duì)SAH大鼠ROS的影響
3.4 紅花多糖對(duì)SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響與假手術(shù)組相比,模型組IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)水平升高;與模型組相比,紅花多糖組 IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,表4。
圖1 Western Blot檢測(cè)SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)
表4 紅花多糖對(duì)SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響
3.5 紅花多糖對(duì)SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達(dá)水平的影響與假手術(shù)組相比,模型組NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達(dá)水平升高;與模型組相比,紅花多糖組NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖2。
圖2 Western Blot 檢測(cè)SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達(dá)
表5 紅花多糖對(duì)SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達(dá)水平的影響
3.6 紅花多糖對(duì)SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響與假手術(shù)組相比,模型組TUNEL和PI陽性率顯著升高(P<0.05);與模型組相比,紅花多糖組TUNEL和PI陽性率顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6,圖3。
表6 紅花多糖對(duì)SAH大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
圖3 各組大鼠PI染色示意圖
蛛網(wǎng)膜下腔出血的死亡率很高,且幸存者可能存在終生損傷,這可能是顱內(nèi)壓急劇升高,腦灌注減少導(dǎo)致的全局性腦缺血及神經(jīng)代謝危機(jī)[18]。雖然動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率低于缺血性中風(fēng),但它發(fā)生在較年輕的患者群體,死亡率較高,對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重?fù)p害[19]。因此,在SAH的背景下,以治療神經(jīng)炎癥為目標(biāo),可減輕腦損傷并有益于提高神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者預(yù)后[20]。中醫(yī)對(duì)SAH的記載始于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,病灶部位在于腦,但其形成與心、肝、脾、腎等皆有關(guān)聯(lián),臟腑功能衰減,氣血逆亂,在標(biāo)為瘀血內(nèi)阻,風(fēng)火相煽,形成本虛標(biāo)實(shí)的證候。丹紅注射液[21]、大株紅景天注射液[22]、丹參川芎嗪注射液[23]等中藥可用于治療或預(yù)防SAH以及SAH后腦血管痙攣。
紅花多糖是菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花的主要有效成分之一,具有抗腫瘤、提高免疫等作用[24-25]。紅花多糖可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[26];還可降低大鼠缺血再灌注損傷組織梗死區(qū)域,抑制炎癥因子表達(dá)[27]。本研究顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠ROS含量升高,大鼠腦組織細(xì)胞凋亡,造成腦水腫;給予紅花多糖治療可顯著提升SAH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分,降低SAH大鼠腦組織含水量、ROS含量以及細(xì)胞凋亡水平,進(jìn)而對(duì)SAH大鼠腦組織發(fā)揮保護(hù)作用,抑制腦水腫。
炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的一部分,在小膠質(zhì)細(xì)胞活化中起著核心作用,涉及感測(cè)各種環(huán)境和細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物[28]。NLRP3炎癥小體激活導(dǎo)致ASC寡聚,觸發(fā)下游銜接蛋白ASC(與CARD凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白)的螺旋狀纖維組裝[29]。ASC可導(dǎo)致caspase1激活,并促進(jìn)IL-1β前體的加工和成熟細(xì)胞因子IL-1β的釋放[30]。NLRP3-ASC炎性小體激活可引起細(xì)胞因子和趨化因子濃度增加[31]。本研究顯示,模型組SAH大鼠腦組織NLRP3、ASC、cleaved caspase1及炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白含量升高,給予紅花多糖治療后,蛋白表達(dá)水平顯著降低,表明紅花多糖直接抑制SAH大鼠腦部炎癥小體高表達(dá),進(jìn)而抑制其產(chǎn)物IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的表達(dá),改善大鼠腦損傷,與Chen H F等[32]研究一致。
綜上所述,紅花多糖可通過抑制NLRP3-ASC炎性小體激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,改善神經(jīng)功能缺損,促進(jìn)受損神經(jīng)功能修復(fù),減輕SAH引起的海馬遲發(fā)性損傷,為開發(fā)新的早期腦損傷治療藥物提供參考。