納米氫氧化銅暴露對水培生菜生長變化的影響

丁潤潤 童玲 張議戈 高露露 史鴻飛 章偉成 方濤

(1.南陽師范學院生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院,南陽 473061;2.南陽師范學院水資源與環(huán)境工程學院,南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,南陽 473061;3.中國科學院水生生物研究所,武漢 430072;4.中國科學院大學,北京 100049)

隨著納米技術的迅猛發(fā)展,納米材料被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、畜牧、工業(yè)、醫(yī)藥和軍工等領域[1]。納米材料因其特有的比表面積、分散性、覆蓋率和黏附性[2]等優(yōu)點促就了它在農(nóng)藥領域上的廣闊應用前景[3—5]?！笆晃濉庇媱濋_始,我國陸續(xù)通過973計劃、國家重點研發(fā)計劃和中國農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程等項目大力發(fā)展新型納米農(nóng)藥[6]。2019年,納米農(nóng)藥被IUPAC(國際純粹與應用化學聯(lián)合會)評為將改變世界的十大化學新興技術之首[7]。納米氫氧化銅(nano-Cu(OH)2)作為新型納米農(nóng)藥之一備受重視[8],其高效殺菌能力將有效緩解作物種植過程中農(nóng)藥濫用的現(xiàn)狀?；趎ano-Cu(OH)2安全設計與應用的需求,它對靶標和非靶標生物體內(nèi)的毒性機制的研究還需要深入開展。

生菜(Lactuca sativaL.)是深受大眾喜愛的一種富含多種礦物質(zhì)與營養(yǎng)元素的蔬菜[9]。在追求生菜高產(chǎn)量和品質(zhì)的過程中往往會出現(xiàn)農(nóng)藥濫用的現(xiàn)象[10]。作為新型納米農(nóng)藥之一的nano-Cu(OH)2具有改善傳統(tǒng)農(nóng)藥(有機磷和有機銅農(nóng)藥等)濫用的現(xiàn)狀。但是,nano-Cu(OH)2在施用過程中是否會對生菜生長產(chǎn)生不利影響還有待進一步研究[11,12]。

本實驗選取生菜作為研究對象,探討不同濃度與暴露時間下nano-Cu(OH)2對生菜株高、根長、鮮重和葉綠素等指標的影響,同時考察生菜體內(nèi)抗氧化酶與MDA含量的變化,以期為nano-Cu(OH)2的設計研發(fā)和合理施用提供一定的理論基礎與必要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

實驗儀器:ZEISS Sigma 500 FE型掃描電鏡(SEM)、Multiwave 3000微波消解儀、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(島津ICP-9800)、Zeta電位分析儀、Eppendorf 5810R離心機、Heal Force超純水儀和SpectraMaxM5多功能酶標儀等。

Nano-Cu(OH)2購自北京中科雷鳴科技有限公司,其商用信息表明nano-Cu(OH)2的直徑為40—80 nm,長度為1—2 μm。CuSO4(Cu2+)購自天津市光復科技發(fā)展有限公司。Hoagland營養(yǎng)液配方[13]為(不含銅):Ca(NO3)2·4H2O(945 mg/L),KNO3(607 mg/L),NH4H2PO4(115 mg/L),MgSO4·7H2O(493 mg/L),H3BO3(2.86 mg/L),MnSO4·7H2O(2.13 mg/L),ZnSO4·7H2O(0.22 mg/L),H2MoO4·2H2O(0.02 mg/L)和鐵鹽溶液(FeSO4·7H2O,5.57 mg/L;EDTA-2Na,8.5 mg/L)?；衔锞徸蕴旖蚴泄鈴涂萍及l(fā)展有限公司,純度＞99%。生菜種子購自南陽種子公司。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)等測定試劑盒均從南京建成生物工程研究所購置。

1.2 實驗方法

納米氫氧化銅表征測定 取適量待檢樣品均勻平鋪在碳導電膠上,用洗耳球吹去殘余樣品,處理完成后上機待測,電壓為3 kV(圖1A)。

生菜的培養(yǎng)與暴露生菜種子經(jīng)10%的H2O2殺菌消毒(30min)后用超純水沖洗干凈,并轉(zhuǎn)移至鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中避光催芽3d(16℃)[14—16]。3d后，將發(fā)芽的生菜種子移至條件為25℃,16h(光照)和20℃,8h(黑暗)的恒溫光照培養(yǎng)箱中馴化3周,且每周的第3和第7天更換營養(yǎng)液。隨后將生菜移栽至裝有Hoagland營養(yǎng)液的玻璃三角瓶(250 mL)中繼續(xù)馴化一周并選取長勢一致的生菜[株高=(19.27±2.72) cm,根長=(13.77±2.87) cm和鮮重=(0.31±0.06) g]用于涂抹暴露實驗。

涂抹暴露實驗設置空白對照(純水)、1 mg/L nano-Cu(OH)2、50 mg/L nano-Cu(OH)2和50 mg/L Cu2+(CuSO4)處理組(各3個重復)。標記生菜最外層的4—5片老葉并用于涂抹暴露實驗,每天涂抹兩次,每次涂抹兩遍(使用無菌棉簽將上述溶液均勻涂抹在標記葉片的正面)。分別在第7、第14、第21和第28天進行實驗取樣,所有指標測定前均使用10 mmol/L EDTA-2Na清洗實驗樣品,消除樣品表面Cu的殘留對測定結(jié)果的影響。

生物量及酶的測定生菜的株高、根長和鮮重每周測定2次。生菜體內(nèi)(老葉、新葉和根)SOD、POD、CAT和MDA的含量嚴格按照試劑盒提供的方法進行測定。上述酶分別在第7、第14、第21和第28天進行測定(4個平行),并將其結(jié)果匯總用以闡明在整個28d暴露期生菜體內(nèi)抗氧化酶和MDA含量的整體響應水平。

葉綠素含量的測定稱取適量生菜鮮葉[m(鮮重),不含中脈],放入含有1 mL無水乙醇的研缽中研磨。研磨后的樣品用80%丙酮定容(V)并浸提。浸提后的樣品經(jīng)0.22 μm濾膜(醋酸纖維素)過濾后測定其在663和645 nm處的吸光度,根據(jù)Lambert-Beer定律[公式(1)-(3)]計算濾液的葉綠素含量[17]:

Cu含量的測定生菜老葉、新葉和根經(jīng)10 mmol/L EDTA-2Na清洗后置入紙皮袋于80℃烘至恒重。稱取適量樣品[m(干重)]并加入6 mL濃硝酸和高氯酸(3∶1)[18]于消解罐中150℃消解過夜,隨后230℃下趕酸至液體且澄清透明(＜200 μL)。消解后的樣品用～2%硝酸定容(V),經(jīng)0.22 μm濾膜(醋酸纖維素)過濾后使用ICP測定Cu的含量[C(測)],同時設置3個水樣用作空白消除誤差。實驗數(shù)據(jù)代入公式(4)計算生菜根、老葉和新葉中銅的含量:

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準偏差,并采用Sigmaplot 12.5進行單因素方差分析(One-way ANOVA),設顯著水平為*P＜0.05,極顯著水平為**P＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 Nano-Cu(OH)2表征分析

Nano-Cu(OH)2為棒狀,直徑為40—80 nm,長度為1—2 μm (圖1A),與商用信息相吻合。水合粒徑(DLS)測定結(jié)果表明,nano-Cu(OH)2(1 mg/L)在純水中的粒徑為(1084.97±907.29) nm,Zeta電位為(-13.33±0.21) mV。這說明nano-Cu(OH)2在水環(huán)境中具有一定的穩(wěn)定性。

2.2 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露對生菜生物量的影響

與空白對照相比,50 mg/L的Cu2+暴露對生菜的株高產(chǎn)生了一定的抑制作用(圖1B),且其引起的抑制作用在第7至第10天尤為顯著(P＜0.05)。但是,Cu2+對生菜株高的抑制作用在暴露后期逐漸消失(17—28d)。值得注意的是,在暴露初期nano-Cu(OH)2對生菜株高產(chǎn)生了一定的抑制作用但并不顯著(P＞0.05)。相比Cu2+與nano-Cu(OH)2暴露的實驗結(jié)果表明,離子形態(tài)的Cu可能是影響生菜株高的關鍵因素。但李偉琦[19]關于Ag在生菜體內(nèi)富集的研究表明,Ag對生菜的有害作用與施用Ag的形態(tài)無關(AgNPsvs.Ag+)。上述不同點可能是本實驗中nano-Cu(OH)2的粒徑較大不易穿過生菜的細胞壁,而離子形態(tài)的Cu能相對快速與有效地被生菜吸收,進而引起毒害效應。López-Moreno等[20]研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)ZnO NPs暴露后,大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]組織中的Zn以Zn2+而非ZnO NPs形式存在,毒害作用源于ZnO NPs溶出的Zn2+,這與本研究的結(jié)果一致。同對株高的影響相似,50 mg/L Cu2+暴露下的生菜根長(圖1C)與對照組相比有所下降,且在第10天表現(xiàn)出顯著差異(P＜0.05),說明Cu的離子形態(tài)可能也是影響生菜根長的關鍵因素。前期研究也發(fā)現(xiàn),豆瓣綠[Peperomia tetraphylla(Forst.f.)Hook.et Arn.]的營養(yǎng)液中添加外源CuSO4后,它根系的生長受到了抑制[21]。與空白對照相比,1 mg/L nano-Cu(OH)2暴露的生菜鮮重在第28天顯著增加(P＜0.05),但在50 mg/L Cu (nano-Cu (OH)2和Cu2+)暴露條件下,生菜葉片邊緣在第14天暴露期出現(xiàn)干枯泛黃的現(xiàn)象(圖2C和圖 2D),且在第28天,干枯泛黃的葉片受到不可逆的損傷而出現(xiàn)脫落。生菜在暴露初期(0—14d)對Cu2+與nano-Cu(OH)2脅迫具有一定的響應,主要表現(xiàn)為株高、根長和鮮重的下降,在暴露后期(17d)生菜的生長得到一定的恢復。肖夢婷等[22]在研究Cr脅迫對油菜(Brassica napusL.)株高,鮮重實驗中發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象,其原因可能是植物具有自我防御機制,抑制自身對重金屬過多的積累。Nano-Cu(OH)2在28d暴露期符合“低促高抑”的現(xiàn)象,這可能與暴露期間生菜體內(nèi)積累過多的Cu密切相關。

圖1 納米氫氧化銅掃描電鏡圖(A)和Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露28d對生菜株高(B)、根長(C)和鮮重(D)的影響Fig.1 SEM of nano-Cu(OH)2 (A);Effects of nano-Cu(OH)2 and Cu2+ during 28 days exposure of lettuce height (B),root length (C) and fresh weight (D)

2.3 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露過程中生菜體內(nèi)Cu含量的變化

在暴露初期(7d,圖 3A)與空白組相比,生菜老葉、新葉和根中Cu的含量并無顯著性增加(P＞0.05),但是老葉中Cu的含量表現(xiàn)出一定程度富集,這主要因為老葉是直接暴露的器官。在暴露第14天,50 mg/L Cu2+暴露組中老葉Cu的含量有了極顯著的增加(P＜0.01),同時,50 mg/L的Cu [nano-Cu (OH)2和Cu2+]暴露條件下新葉中Cu的含量也有顯著增加(P＜0.05)。這說明暴露初期(0—14d),作為直接暴露器官的老葉在受到一定程度的損傷后,其體內(nèi)Cu的含量出現(xiàn)顯著性的累積效應,這可能是導致老葉邊緣損傷的直接與不可忽視的原因。值得注意的是,在第14天,老葉中的Cu開始向新葉和根中轉(zhuǎn)移,且在新葉中出現(xiàn)了顯著的累積(P＜0.05)。

Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露第21天,與空白組相比,生菜的老葉、新葉和根中Cu的含量均無顯著性變化(P＞0.05)。在第28天的1 mg/L nano-Cu(OH)2和50 mg/L Cu2+暴露組中,根部Cu的含量比空白組有了極顯著的升高(P＜0.01),但老葉中Cu的含量仍舊低于空白對照。這說明生菜受到長期高濃度Cu脅迫時,老葉會受到不可逆的損傷(圖2C和2D),從而阻斷了Cu在老葉中進一步的富集。所以相比第14和第21天(圖3B和3C),Cu在新葉中的有效富集也逐漸消失。有趣的是,高濃度Cu暴露組中,根部Cu的含量有了極顯著地升高(P＜0.01),這可能是因為前期累積在老葉和新葉中的Cu轉(zhuǎn)移到根部。實驗結(jié)果表明,Cu離子可能是nano-Cu(OH)2暴露與累積的有效形態(tài)。與本研究結(jié)果不同的是,Ag[14]在大豆體內(nèi)現(xiàn)出了優(yōu)先向根部轉(zhuǎn)移的特性與規(guī)律,這表明不同的納米材料在植物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運機制不同。

圖2 生菜暴露于nano-Cu(OH)2和Cu2+14 (A、B、C和D)側(cè)視圖和28d (E、F、G和H)俯視圖表觀的特征Fig.2 Side (A,B,C and D) and top (E,F,G and H) view of lettuce after 14d and 28d exposure to nano-Cu(OH)2 and Cu2+

圖3 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露7d(A)、14d(B)、21d (C)和28d (D)生菜體內(nèi)Cu含量的變化Fig.3 The amount of Cu in lettuce after 7d (A),14d(B),21d (C) and 28d (D) exposure to nano-Cu (OH)2 and Cu2+

2.4 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露對生菜葉綠素含量的影響

與空白對照相比,在nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露初期(7—14d),生菜老葉和新葉中葉綠素a(Chl.a)和葉綠素b(Chl.b)的含量均無顯著性變化(P＞0.05),除了50 mg/L nano-Cu(OH)2暴露條件下促進了新葉中Chl.b含量的顯著增加(P＜0.05,圖 4B)。在50 mg/L Cu2+暴露第21天,老葉中Chl.b的含量有了顯著增加(P＜0.05,圖 4C)。在nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露第28天,生菜葉片中葉綠素的含量沒有顯著變化。結(jié)合圖 3C、3D和圖 4D說明:(1)長期高濃度Cu脅迫會抑制生菜老葉中葉綠素的合成,使得老葉受到不可逆的損害而出現(xiàn)失綠脫落等現(xiàn)象;(2)前期生菜老葉中富集的Cu仍舊可以向新葉中轉(zhuǎn)移,彌補了新葉中Cu的缺乏(Hoagland營養(yǎng)液無Cu培養(yǎng)),從而促進了新葉的生長。類似地,隨著AgNPs[14]暴露濃度的升高,大豆葉片中葉綠素的含量呈下降的趨勢(P＜0.05)。在空心菜(Ipomoea aquaticaForsk.)[23]、梭魚草(Pontederia cordataL.)[24]的相關研究中同樣證實低濃度的Cu能促進植株的生長,而高濃度的Cu會降低PSⅡ的反應活性,損傷植物的葉綠體或類囊體等來抑制植株的生長。

圖4 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露7d(A)、14 d (B)、21d (C)和28d (D)對生菜葉綠素含量的影響Fig.4 The content of chlorophyll in lettuce after 7d (A),14d (B),21d (C) and 28d (D) exposure to nano-Cu(OH)2 and Cu2+

2.5 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露對生菜體內(nèi)抗氧化酶和MDA含量的影響

由圖 5A可知,盡管暴露組的老葉、新葉和根中SOD含量與空白組相比均無顯著性變化(P＞0.05),但是50 mg/L nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露組中老葉的SOD含量仍舊分別增加了8%和16%。據(jù)文獻報道,當小麥花藥[25]、菜心(Brassica raga syn.campestrisL.ssp.Chinensis var.utilisTsen et Lee)[26]和水培生菜[27,28]等受到外來脅迫時,它們體內(nèi)會大量生成SOD以歧化脅迫產(chǎn)生的超氧自由基,從而達到保護植株的作用[29,30]。在本研究中,高濃度Cu脅迫下,生菜體內(nèi)SOD含量出現(xiàn)增長趨勢,有利于激發(fā)其保護機制;低濃度Cu暴露下生菜未受影響表現(xiàn)為SOD的含量變化較小。

Cu暴露對生菜老葉、新葉和根中CAT的含量沒有顯著影響(P＞0.05,圖 5B)。與空白對照相比,暴露組生菜根部中CAT含量呈下降趨勢,這可歸因于老葉中積累的Cu向根部轉(zhuǎn)移從而抑制了生菜根部藻類的生長,使得暴露組中根部CAT含量相對較低。類似的,趙蘭枝等[21]研究水培中抑制綠藻生長的方法時發(fā)現(xiàn),低濃度的Cu(CuSO4)會抑制營養(yǎng)液中綠藻的生長,同時促進植物根系的伸長。

與空白對照相比(圖5C),高濃度Cu暴露組[50 mg/L nano-Cu(OH)2和50 mg/L Cu2+]下老葉中POD的含量有極顯著的增加(P＜0.01),說明POD有效地清除了生菜老葉中累積的H2O2,降低自由基的含量減輕膜脂過氧化對老葉的傷害。相關研究也證實,葡萄(Vitis viniferaL.)常溫儲存的過程中POD活性不斷升高用于清除體內(nèi)累積的H2O2[31],Cd脅迫誘導生菜體內(nèi)POD酶基因的大量表達,抵御Cd脅迫的傷害[32]。在本實驗中,Cu脅迫雖然提高了POD的含量,但長期高濃度的Cu脅迫超出了POD清除有害物質(zhì)的負荷,對生菜造成不可逆的損傷(圖2C和2D)。

圖5 Nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露28d對生菜體內(nèi)SOD (A)、CAT (B)、POD (C)和MDA (D)含量的影響Fig.5 Levels of SOD (A),CAT (B),POD (C) and MDA (D) in lettuce during 28 days exposure to nano-Cu(OH)2 and Cu2+

Cu暴露對生菜老葉、新葉和根中MDA含量的變化沒有顯著影響(P＞0.05,圖 5D)。但與空白對照相比,1 mg/L nano-Cu(OH)2暴露條件下老葉中MDA的含量降低了9%,50 mg/L nano-Cu(OH)2、50 mg/L Cu2+暴露條件下MDA的含量分別升高了8%和16%。這說明生菜在1 mg/L nano-Cu (OH)2的暴露下一定程度上促進了生菜的生長,在高濃度的暴露條件下老葉和新葉均受到了不同程度的損傷。老葉中MDA含量上升的趨勢與圖 2C和2D中生菜表觀變化現(xiàn)象相符合。同樣地,孟媛[33]的研究表明,Cd脅迫下生菜、菠菜(Spinacia oleraceaL.)和茼蒿(Chrysanthemum coronariumL.)體內(nèi)MDA含量均呈現(xiàn)升高的趨勢(P＞0.05)。以上結(jié)果表明,低濃度nano-Cu(OH)2暴露可以促進生菜的生長,高濃度nano-Cu(OH)2暴露則會對生菜產(chǎn)生毒害作用,抑制其生長。

3 結(jié)論

綜上所述,與nano-Cu(OH)2相比,Cu2+暴露對生菜產(chǎn)生的毒害作用更為嚴重;nano-Cu(OH)2對生菜的主要致毒機理來源于它溶出的銅離子。在nano-Cu(OH)2和Cu2+暴露初期,Cu會先富集到老葉中(靶器官)且不會對生菜的生長產(chǎn)生顯著影響。隨著暴露時間的延長,低濃度nano-Cu(OH)2促進了生菜的生長;高濃度的nano-Cu(OH)2和Cu2+脅迫對生菜產(chǎn)生不可逆的損傷,表現(xiàn)為生菜葉片干枯變黃脫落,此時生菜主要通過調(diào)控體內(nèi)的SOD和POD等抗氧化酶的含量來抵御Cu的脅迫傷害。