藻類連續(xù)培養(yǎng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化及其在產(chǎn)毒和無毒微囊藻競爭中的應(yīng)用

左俊 曾佳穎 楊絲雨 宋立榮 甘南琴

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點實驗室,福建省流域生態(tài)重點實驗室水生態(tài)健康組,廈門 361021;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

藻類培養(yǎng)模式主要包括批次培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。批次培養(yǎng)是指在一個封閉的反應(yīng)器內(nèi)加入一定數(shù)量的培養(yǎng)基后,接種藻種進行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方式,由于批次培養(yǎng)中底物的消耗和代謝廢物的積累,藻類一般表現(xiàn)為S型生長曲線,具有明顯的延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期[1]。半連續(xù)培養(yǎng)主要是在藻類培養(yǎng)過程中,當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定濃度后,收獲一定量的藻液,補充等量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)[2]。半連續(xù)培養(yǎng)有利于藻細(xì)胞保持良好的生長狀態(tài)[3],主要是為了能夠重復(fù)地取得大量均一的培養(yǎng)藻細(xì)胞以供生化研究之用。連續(xù)培養(yǎng)是在藻類的整個培養(yǎng)期間,通過一定的方式使藻類能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。恒化培養(yǎng)是連續(xù)培養(yǎng)的一種類型,它是以恒定的流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持培養(yǎng)物生長速率恒定的方法。這種培養(yǎng)方法常通過控制某種營養(yǎng)物的濃度,使其成為限制因子,而其他營養(yǎng)物均為過量。這樣,培養(yǎng)物的生長速率將取決于限制性因子的濃度。隨著培養(yǎng)物的生長,細(xì)胞密度會隨時間的增長而增高,而限制因子的濃度又會隨時間的增長而降低,兩者相互作用的結(jié)果使得培養(yǎng)物的生長速率恰好與恒速加入的新鮮培養(yǎng)基流速相平衡。目前連續(xù)培養(yǎng)已經(jīng)成為室內(nèi)研究藻類生理特性的重要培養(yǎng)方式。

由于水體富營養(yǎng)化及全球氣候變化,全球范圍內(nèi)水生態(tài)系統(tǒng)藍(lán)藻水華暴發(fā)的頻率、范圍和強度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,這些水華藍(lán)藻能夠產(chǎn)生對人及水生動植物有害的次生代謝物,損害水生態(tài)系統(tǒng)的功能,降低水資源的利用,帶來巨大的健康風(fēng)險[4—7]。在藍(lán)藻水華監(jiān)測和預(yù)警方面,現(xiàn)階段聚焦于外部環(huán)境參數(shù)如理化因子和氣象條件上的變化,忽略了特定藻類在生理生態(tài)學(xué)層面上的動態(tài)響應(yīng)方式,因此難以準(zhǔn)確地預(yù)測預(yù)報[8]。微囊藻水華是我國最為嚴(yán)重的藍(lán)藻水華之一[4,5],亟需通過生理生態(tài)學(xué)方法揭示其水華生消機制[8]。然而在自然水體中,產(chǎn)毒與無毒微囊藻存在競爭關(guān)系,但其驅(qū)動因素尚不明晰。目前有關(guān)產(chǎn)毒與無毒微囊藻競爭的研究主要集中在營養(yǎng)鹽N、P的變化、光照強度和CO2等方面[9]。但這些研究多以批次培養(yǎng)為主,少有連續(xù)培養(yǎng)的報道。在批次培養(yǎng)中,由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有害代謝產(chǎn)物的累積,微囊藻的生長容易受到阻礙。但在天然湖泊等水體中,N、P等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗之后,在生物地球化學(xué)循環(huán)作用下,短期內(nèi)可以迅速恢復(fù)。因批次培養(yǎng)中的營養(yǎng)物與野外水體之間存在顯著的差異,導(dǎo)致批次培養(yǎng)得到的實驗結(jié)果用于解釋野外水體中藍(lán)藻水華發(fā)生的機理時存在局限性。而在連續(xù)培養(yǎng)模式下,微囊藻的生長不會受到營養(yǎng)鹽的限制和有害代謝產(chǎn)物的影響,其生長速度、代謝活性都處于相對恒定的狀態(tài),此時微囊藻生長變化只受到實驗單一或者復(fù)合因子的影響,而不會被其他因子干擾。因此,連續(xù)培養(yǎng)將成為研究產(chǎn)毒和無毒微囊藻競爭的主要培養(yǎng)手段[10,11]。

本研究通過微生物發(fā)酵罐,加裝外置環(huán)形光源,構(gòu)建藻類連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng),并通過優(yōu)化參數(shù),獲得最優(yōu)培養(yǎng)條件,為室內(nèi)開展藻類競爭試驗提供合適的培養(yǎng)模式。在此基礎(chǔ)上開展光強對產(chǎn)毒微囊藻與無毒微囊藻影響的試驗,為探究產(chǎn)毒微囊藻與無毒微囊藻的競爭演替機制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

本實驗所用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC 7806及其突變株P(guān)CC 7806mcyBmutant,由法國巴斯德藍(lán)藻藻種庫(Pasteur Culture collection of Cyanobacteria,PCC,France)提供。兩株藻種都是無菌株,前者是野生型產(chǎn)毒株,后者是人工無毒突變株。藻種培養(yǎng)條件為:溫度25℃,光強35 μmol/(m2·s)(冷光源),光暗比12h∶12h,M9培養(yǎng)基(改良自BG11[12])。M9培養(yǎng)基中除了NaNO3和NaHCO3外,其他成分同BG11。M9培養(yǎng)基配制時,不添加NaHCO3,滅菌后通過無菌濾器過濾除菌后,將NaHCO3加入滅菌后的培養(yǎng)基中。最后補加400 μL已用無菌濾器除菌的1 mol/L的HCl溶液,使得M9最終pH為8.5。

1.2 基本構(gòu)造

實驗室開展的連續(xù)培養(yǎng)在BioFlo/CelliGen 115發(fā)酵罐(Eppendorf,EP)和BLBIO-5GJL發(fā)酵罐(百倫,上海)中進行。發(fā)酵罐主要包括罐體、檢測探頭、控制臺、循環(huán)水浴及樣品處理組件等(圖1)。EP罐體為3 L,百倫罐體為5 L,實驗時培養(yǎng)液占比在0.6(v/v)左右。發(fā)酵罐在攪拌和通氣作用下,使培養(yǎng)液不斷混勻。發(fā)酵罐溫度由溫度探頭實時測定,并經(jīng)控制臺調(diào)配罐底的加熱裝置和外部夾套的冷卻循環(huán)水來達(dá)到平衡。罐體還有溶氧探頭、pH探頭和消泡探頭。補料泵A和出料泵B都由發(fā)酵罐主機控制,以恒定的速率泵入或泵出培養(yǎng)物。通過設(shè)置補料泵A的工作效率,如一個周期為60s,工作10s,停50s,從而達(dá)到控制泵入體積的目的(泵入體積=恒速泵速率×工作時間×工作效率)。新鮮培養(yǎng)基進入培養(yǎng)系統(tǒng)后,培養(yǎng)罐體內(nèi)的液面會上升,當(dāng)液面上升接觸到液位探頭后,觸發(fā)液位探頭啟動出料泵B,將培養(yǎng)液從發(fā)酵罐底部泵出培養(yǎng)體系。這樣通過補料泵A的持續(xù)泵入和出料泵B的自動泵出,達(dá)到平衡,保持培養(yǎng)體積恒定。稀釋率為每天泵入的新鮮培養(yǎng)基體積與培養(yǎng)體系總體積的比值。通過設(shè)置補料泵A的工作效率,調(diào)整泵入的體積,進而實現(xiàn)對稀釋率的精確調(diào)控。當(dāng)藻細(xì)胞比生長速率與連續(xù)培養(yǎng)稀釋率相等時,培養(yǎng)系統(tǒng)進入穩(wěn)定狀態(tài),此時細(xì)胞密度保持恒定。

圖1 發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of continuous culture

1.3 培養(yǎng)條件和參數(shù)設(shè)置

連續(xù)培養(yǎng)溫度設(shè)置為25℃,光照35 μmol/(m2·s),光暗比為12h∶12h,培養(yǎng)基為M9。EP發(fā)酵罐培養(yǎng)體積為1.8 L,百倫發(fā)酵罐培養(yǎng)體積為3 L。發(fā)酵罐的稀釋率為0.075或0.15/d,通氣量為0.4 L/min,攪拌速度為50 rpm。起始接種量為(2—4)×106cells/mL,首先進行4d的預(yù)培養(yǎng),然后在第4天開始連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基。

1.4 實驗設(shè)計

通過優(yōu)化補加培養(yǎng)基的時間、接種密度和稀釋率對連續(xù)培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。起始按1∶1的比例接種產(chǎn)毒藻株P(guān)CC 7806和無毒藻株P(guān)CC 7806mcyB-,在選定天數(shù)取樣,測定細(xì)胞密度。連續(xù)培養(yǎng)條件優(yōu)化共設(shè)計3個實驗。實驗一:起始接種密度為2×106cells/mL,稀釋率為0.15/d時,設(shè)置了3個補加培養(yǎng)基的時間:分別在第4、第6和第7天開始通入新鮮培養(yǎng)基。實驗二:起始接種密度為4×106cells/mL,稀釋率為0.15/d時,設(shè)置了2個補加培養(yǎng)基的時間:分別在第0和第4天開始通入新鮮培養(yǎng)基。實驗三:起始接種密度為4×106cells/mL,在第4天開始連續(xù),設(shè)置2個稀釋率分別是0.075/d和0.15/d。

隨后開展了長周期和短周期培養(yǎng)過程中PCC 7806與PCC 7806mcyB-mutant競爭實驗。長周期實驗培養(yǎng)70d,短周期實驗培養(yǎng)22d。通過測定細(xì)胞數(shù)變化和無毒株比例變化,評價優(yōu)化后短周期培養(yǎng)下的實驗結(jié)果。通過條件優(yōu)化和競爭實驗結(jié)果分析最適培養(yǎng)體系。

在優(yōu)化出最適培養(yǎng)體系后,我們還探索了不同光強在連續(xù)培養(yǎng)條件下對產(chǎn)毒藻和無毒微囊藻競爭的影響。實驗一共設(shè)置了4組光強,分別為5、15、35和80 μmol/(m2·s)。實驗周期為16d,每隔2天取樣,樣品備測。

1.5 細(xì)胞計數(shù)

每份初始藻液取1 mL加入10 μL魯哥試劑進行固定,設(shè)置3個平行。固定的樣品經(jīng)振蕩混勻后,吸取10 μL加到血球計數(shù)板(上海求精)計數(shù)室,在普通光學(xué)顯微鏡(Eclipase E200,Nikon,Japan)下計數(shù)。每個樣品計數(shù)3次,每次均記錄上下2個計數(shù)室計數(shù)結(jié)果,樣品中藻細(xì)胞濃度由6次記錄的數(shù)據(jù)平均值計算得到。初始藻樣中細(xì)胞密度通過3個樣品平行計算平均值得到。

1.6 DNA提取

藻樣過0.2 μm的碳酸徑刻蝕膜(Nuclepore Track-Etch Membrane,Whatman,GE,USA),收集細(xì)胞,并立即存放在-20℃冰箱,用于后續(xù)DNA提取。用MP FastDNA SpinDown Kit(MP Biomedicals,LLC,France)提取基因組DNA,操作流程參照試劑盒說明書。DNA的濃度和純度使用超微分光光度計(NanoDrop 8000,Thermo Fischer Inc.,USA)進行測定。

1.7 標(biāo)曲制備

以PCC 7806mcyB-mutant的基因組DNA作為定量產(chǎn)毒微囊藻和總微囊藻的標(biāo)準(zhǔn)。通過已知的DNA數(shù)量(以細(xì)胞數(shù)目來表示)與qPCR得到的Ct值(達(dá)到的閾值所需要的循環(huán)數(shù))進行線性回歸,得到回歸曲線(標(biāo)曲)[13]。將10 mL細(xì)胞密度為3.4×107cells/mL的PCC 7806mcyB-mutant抽濾到0.2 μm的碳酸徑刻蝕膜上,隨后提取基因組DNA。將提取的DNA進行10倍的梯度稀釋,得到7個(含原液)不同梯度的DNA樣品,細(xì)胞密度分別為3.4×106到3.4 cell/μL。qPCR生成的數(shù)據(jù)由iQ5(version 3.0,Bio-Rad,Hercules,CA)軟件通過最大相關(guān)系數(shù)方法計算得到Ct值,即軟件自動選取閾值,使得標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)最大。

1.8 雙通道qPCR測定

Dittmann等在產(chǎn)毒銅綠微囊藻PCC 7806的mcyB基因中插入氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance cassette,Cm),獲得了無毒的PCC 7806mcyB-突變體[14]。在雙通道熒光定量qPCR測定中,通過PC(PC-IGS,藻藍(lán)蛋白基因 PC中兩個蛋白亞基之間的基因間隔區(qū)域)和Cm分別定量競爭體系中總微囊藻和無毒微囊藻的數(shù)量,得到無毒微囊藻的比例。其中定量PC的探針序列是CY-5-5′-CCGCTG CTGTCGCCTAGTCCCTG-3′BHQ-2,正向引物序列是PC188F:5′-GCTACTTCGACCGCGCC-3′,反向引物序列是PC254R:5′-TCCTACGGTTTAAT TGAGACTAGCC-3′[15]。而定量Cm的探針序列為FAM-5′-ACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAG GC-3′-TAMRA,正向引物序列為5′-GTTTATTGA CTACCGGAAGCAGTG-3′,反向引物序列為5′-CACGGGGAGAGCCTGAGC-3′[16]。

PCR反應(yīng)在伯樂熒光定量PCR儀(Bio-Rad,Hercules,CA)上進行,該儀器配備有iQ5實時熒光檢測系統(tǒng)和處理軟件,能夠支持多通道熒光檢測。PCR反應(yīng)總體系是20 μL,在96孔板(Bio-Rad)中進行。總體系包括10 μL 2×iTaq Universal Probes Supermix(Bio-Rad)預(yù)混液,1 μL BSA(牛血清蛋白,3 mg/mL),2 μL DNA樣品,0.4 μLPC的正反向引物和0.2 μLCm的正反向引物,最后補充無菌水至20 μL。PCR程序先在95℃預(yù)變性5min,隨后進行40個循環(huán):95℃,15s;62℃下退火1min;72℃,30s。每個PCR樣品均設(shè)置3個平行,并添加不含DNA的無菌去離子水作為陰性對照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用PASW Statistics 18.0(SPSS Inc,USA)進行統(tǒng)計分析,圖片使用Origin 2019b(Origin-Lab,USA)繪制。

2 結(jié)果

2.1 微囊藻連續(xù)培養(yǎng)條件的構(gòu)建與優(yōu)化

培養(yǎng)基補料時間的優(yōu)化起始接種密度為2×106cells/mL,稀釋率為0.15/d時(如圖 2A),在細(xì)胞接種后,經(jīng)過短時間的適應(yīng)后,細(xì)胞數(shù)快速增加。不同處理下連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進入穩(wěn)定期的細(xì)胞密度無顯著差異,但進入穩(wěn)定期的時間有顯著差異。第4天開始補加培養(yǎng)基最先達(dá)到穩(wěn)定,在第14天進入穩(wěn)定期;第6天補料組在第16天進入穩(wěn)定期,而第7天補料組在第18天才進入穩(wěn)定期。這表明培養(yǎng)基補加時間越晚,連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進入穩(wěn)定期的時間就越慢。

圖2 連續(xù)培養(yǎng)中不同補料時間處理下微囊藻細(xì)胞的生長曲線Fig.2 Growth curves of Microcystis when supplemented with medium on different days under continuous culture

起始接種密度為4×106cells/mL,稀釋率為0.15/d時(圖2B),第0天開始補加培養(yǎng)基的實驗組,在第14天進入穩(wěn)定期,且細(xì)胞密度為3×107cells/mL;而第4天補料組在第10天就達(dá)到穩(wěn)定,穩(wěn)定期的細(xì)胞密度在4.3×107cells/mL。這表明,接種時就開始補加培養(yǎng)基,會推遲連續(xù)培養(yǎng)進入穩(wěn)定期的時間,而且穩(wěn)定期細(xì)胞密度比較低。比較培養(yǎng)基不同補加時間的結(jié)果表明,第4天開始補充新鮮培養(yǎng)基到連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)較為合適。

藻種起始接種密度的優(yōu)化第4天開始補加培養(yǎng)基,稀釋率為0.15/d時(圖3A),起始接種密度為4×106cells/mL的處理組在第12天進入穩(wěn)定期,而起始接種密度為2×106cells/mL的處理組在第16天才達(dá)到平衡。不同接種密度的處理組進入穩(wěn)定期后的細(xì)胞密度無顯著差異。

圖3 連續(xù)培養(yǎng)中不同接種密度處理下微囊藻細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curves of Microcystis with different inoculum densities under continuous culture

第6天開始補加培養(yǎng)基,稀釋率為0.15/d時(圖3B),起始接種密度為1×106cells/mL的處理組在第20天進入穩(wěn)定期,而起始接種密度為2×106cells/mL的處理組在第16天進入穩(wěn)定期。兩個處理組在穩(wěn)定期的細(xì)胞密度無顯著差異。不同起始接種密度結(jié)果表明,較低的接種密度會推遲連續(xù)培養(yǎng)進入穩(wěn)定期的時間,但過高的接種密度需要大量藻種。綜合來看,起始接種密度為4×106cells/mL時比較合適。

稀釋率的優(yōu)化起始接種密度為4×106cells/mL,培養(yǎng)基在第4天補加時(圖4),稀釋率為0.075/d時,細(xì)胞生長緩慢,連續(xù)培養(yǎng)在20d后逐漸進入穩(wěn)定期,細(xì)胞密度僅2.2×106cells/mL,而稀釋率為0.15/d時,細(xì)胞生長較快,在第10天就進入穩(wěn)定期,穩(wěn)定期細(xì)胞密度在4.3×106cells/mL。在連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定時,細(xì)胞比生長速率等于稀釋率。當(dāng)稀釋率較低時,細(xì)胞生長較慢,在達(dá)到穩(wěn)定時,細(xì)胞密度也較低。當(dāng)稀釋率過高時,細(xì)胞比生長速率低于稀釋率,會導(dǎo)致系統(tǒng)無法進入穩(wěn)定期。

圖4 連續(xù)培養(yǎng)中不同稀釋率處理下微囊藻細(xì)胞的生長曲線Fig.4 Growth curves of Microcystis with different dilution rates under continuous culture

2.2 連續(xù)培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒與無毒微囊藻混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化

混合培養(yǎng)中產(chǎn)毒與無毒微囊的定量測定產(chǎn)毒株P(guān)CC 7806與無毒株P(guān)CC 7806mcyB-在混合培養(yǎng)過程中的比例通過雙通道探針法qPCR來測定。如圖 5所示,在雙通道競爭PCR中,PC和Cm基因與細(xì)胞數(shù)之間均具有極顯著的相關(guān)性,兩者的回歸曲線分別為:y=-3.336 lg(x)+40.425(R2=0.999,n=3,P＜0.001)和y=-3.537 lg(x)+40.165(R2=0.997,n=3,P＜0.001)。式中x表示樣品中 DNA 的量(以細(xì)胞數(shù)的對數(shù)值表示),y表示樣品的Ct值。兩者的擴增效率E分別為99.4%和91.8%。在所有的樣品測定過程中,PC和Cm基因的擴增效率在91%—102%,擴增曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995,表明雙通道探針法qPCR可以用來定量和區(qū)分產(chǎn)毒株P(guān)CC 7806和無毒株P(guān)CC 7806mcyB-。

圖5 雙通道qPCR中無毒株P(guān)CC 7806 mcyB- PC和Cm基因擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves for PC and Cm genes based on predetermined concentrations of DNA (given as log10 cell number equivalents)of the non-toxic Microcystis strain PCC 7806 mcyB-,amplified by multiplex real-time PCR

產(chǎn)毒株與無毒株在長周期培養(yǎng)下的競爭狀況長周期培養(yǎng)在第6天開始持續(xù)、恒定補充新鮮M9培養(yǎng)基到發(fā)酵罐中。初始接種密度為1.0×106cells/mL。在接種后,總細(xì)胞數(shù)快速增加,在20d左右達(dá)到最大值,其后近40d培養(yǎng)中,細(xì)胞數(shù)目一直維持在4.5×107cells/mL左右,沒有顯著變化(圖6)。產(chǎn)毒株比例在接種后逐漸降低,最后穩(wěn)定在15%左右,而無毒株比例則逐漸上升,最后穩(wěn)定在85%左右。細(xì)胞比例變化在20d左右達(dá)到平衡,隨后一直保持不變。這說明在連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定后,細(xì)胞密度在較長時間內(nèi)維持不變,而且產(chǎn)毒株與無毒株以不同優(yōu)勢共存,兩者比例也長時間保持不變。

圖6 長周期的連續(xù)培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒微囊藻(PCC 7806)與無毒微囊藻(PCC 7806 mcyB-)中細(xì)胞比例變化和總細(xì)胞數(shù)變化Fig.6 Percentages of the toxic Microcystis (PCC 7806) and nontoxic Microcystis (PCC 7806 mcyB-) and total cell density in competition under continuous culture for a long time

產(chǎn)毒株與無毒株在短期培養(yǎng)下的競爭狀況當(dāng)初始接種密度為1.0×106cells/mL時,連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)在20d左右才達(dá)到平衡。為了縮短實驗周期,在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下進行競爭實驗。接種密度為4.0×106cells/mL,并在第4天開始補充培養(yǎng)基。如圖 7所示,在改變初始接種量后,競爭體系在第10天左右就達(dá)到了穩(wěn)定,此后細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)都沒有顯著變化。在達(dá)到穩(wěn)定后,產(chǎn)毒株比例維持在20%左右,無毒株比例維持在80%,這與長周期培養(yǎng)下的結(jié)果一致。這說明連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定后,產(chǎn)毒與無毒株競爭格局不再隨時間發(fā)生變化。

圖7 短周期連續(xù)培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒微囊藻(PCC 7806)與無毒微囊藻(PCC 7806 mcyB-)競爭中細(xì)胞比例變化和總細(xì)胞數(shù)變化Fig.7 Percentages of the toxic Microcystis (PCC 7806) and nontoxic Microcystis (PCC 7806 mcyB-) and total cell density in competition under continuous culture for a short time

產(chǎn)毒株與無毒株競爭過程中溶解氧和pH變化如圖 8所示,在光照周期為12h∶12h作用下,溶氧(DO)呈現(xiàn)明顯的周期變化,白天(照光時)升高,晚上(黑暗時)降低,開始補充培養(yǎng)基之前,DO呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,在第5天開始補充新鮮培養(yǎng)基后,DO開始下降,隨后趨于穩(wěn)定,從10天左右開始,其波動范圍不再顯著改變。pH變化在光合作用影響下,也呈現(xiàn)出周期性波動,變化趨勢和DO一致,即pH先升高,在第5天通入新鮮培養(yǎng)基后開始下降,隨后趨于穩(wěn)定,從第10天左右開始pH變化維持在9.3—9.5,不再顯著改變。DO和pH變化表明,連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進入穩(wěn)定期后,二者隨光周期變化保持周期性變動,其變化范圍保持不變。

圖8 連續(xù)培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒微囊藻(PCC 7806)與無毒微囊藻(PCC 7806 mcyB-)競爭中pH(A)和溶氧(B)變化Fig.8 Variations on pH (A) and DO (B) in competition between toxic Microcystis PCC 7806 and non-toxic Microcystis PCC 7806 mcyB- under continuous culture

綜合長周期和短周期培養(yǎng)實驗結(jié)果及胡麗麗[17]的實驗數(shù)據(jù),我們將連續(xù)培養(yǎng)的初始接種量設(shè)定為(3.0—4.0)×106cells/mL,稀釋率為0.15/d。新鮮培養(yǎng)基在第4天加入,此時連續(xù)培養(yǎng)在10d左右就可以達(dá)到平衡。當(dāng)競爭體系達(dá)到穩(wěn)定后,細(xì)胞比例不再變化,因此,在后期開展的實驗中,將實驗周期設(shè)定為14—16d。

2.3 光照對產(chǎn)毒與無毒微囊藻競爭態(tài)勢的影響

在建立連續(xù)培養(yǎng)體系后,我們探究了不同光強對產(chǎn)毒和無毒微囊藻競爭的影響(圖9)。在35 μmol/(m2·s)的光照(對照組)下,無毒株比例逐漸增加,隨后穩(wěn)定在80%左右,而產(chǎn)毒株比例則下降至20%左右。在高光下[80 μmol/(m2·s)],仍然是無毒株占據(jù)80%左右比例。在低光[15 μmol/(m2·s)]和弱光[5 μmol/(m2·s)]下,無毒株和產(chǎn)毒株都維持在初始比例,沒有發(fā)生顯著改變,但在弱光下,無毒株比例有下降的趨勢。綜合來看,光充足時,無毒株占絕對優(yōu)勢,而光限制時,無毒株和產(chǎn)毒株無明顯差異。雖然在不同光強處理下,無毒株比例變化有明顯差異,但是在所有處理組中,無毒株和產(chǎn)毒株仍舊以不同優(yōu)勢共存,沒有出現(xiàn)消亡現(xiàn)象。

3 討論

藻類生理生態(tài)學(xué)研究對于揭示藍(lán)藻水華暴發(fā)、維持及衰亡機制具有重要意義。傳統(tǒng)的批量培養(yǎng)模式往往會受到營養(yǎng)鹽消耗和有害代謝物質(zhì)積累等的影響,而連續(xù)培養(yǎng)更接近于野外水體營養(yǎng)的變動,減少其他非控制因素對藍(lán)藻細(xì)胞生長產(chǎn)生的影響。本研究利用發(fā)酵罐構(gòu)建了一套藻類連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。以產(chǎn)毒微囊藻PCC 7806及其無毒突變株P(guān)CC 7806mcyB-為培養(yǎng)材料,對連續(xù)培養(yǎng)的各項參數(shù)進行了優(yōu)化。在藻種接種到培養(yǎng)基后,需要短暫的適應(yīng)過程,因此起始補料時間會影響培養(yǎng)系統(tǒng)進入穩(wěn)定期的時間。過短,如第0天,或者過長,如第7天,都會延遲系統(tǒng)進入穩(wěn)定期的時間(圖2),而第4天開始進行補料比較合適,此時培養(yǎng)系統(tǒng)能夠較快進入穩(wěn)定期。起始接種密度優(yōu)化結(jié)果表明,提高接種密度,可以加快培養(yǎng)系統(tǒng)進入的時間(圖3),但過高的接種密度需要消耗大量的藻種,結(jié)合本研究結(jié)果,4×106cells/mL的起始接種密度較為合適。在系統(tǒng)進入穩(wěn)定期后,藻細(xì)胞的比生長速率與稀釋率相等,所以稀釋率不僅影響系統(tǒng)進入穩(wěn)定期的時間,還決定了穩(wěn)定期的細(xì)胞密度。稀釋率較低時,系統(tǒng)進入穩(wěn)定期較慢,且穩(wěn)定期時細(xì)胞密度也比較低;而提高稀釋率時,系統(tǒng)可以較快進入穩(wěn)定期(圖4)。藻類在一定稀釋率范圍內(nèi)進行連續(xù)培養(yǎng)時,生物量(穩(wěn)定期時的細(xì)胞密度)會隨著稀釋率的增加而增加,而當(dāng)稀釋率超過臨界值之后,藻細(xì)胞未能充分生長便被帶出培養(yǎng)系統(tǒng),生物量反而會隨著稀釋率的增加而下降。大量研究表明,藻類連續(xù)培養(yǎng)時都存在一個最佳稀釋率,例如杜氏鹽藻(Dunaliella salina)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的最佳稀釋率為0.15/d,而柵藻為0.31/d,藻細(xì)胞在最佳稀釋率下培養(yǎng)時,系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定后的生物量明顯高于其他稀釋率下的生物量[18—21](圖4)。綜合補料時間、起始接種密度和稀釋率,我們得到了連續(xù)培養(yǎng)的最適培養(yǎng)條件:第4天開始補料,起始接種密度為4×106cells/mL,稀釋率為0.15/d。

建立連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)并優(yōu)化后,我們探究了產(chǎn)毒與無毒微囊藻在連續(xù)培養(yǎng)下的競爭格局。但產(chǎn)毒微囊藻與無毒微囊藻混合培養(yǎng)后,傳統(tǒng)方法無法將其區(qū)分。而qPCR定量方法,可以針對特異性序列對靶基因進行定量。因此,我們采用了雙通道探針法qPCR來測定無毒微囊藻和總微囊藻。該方法通過特異性探針來監(jiān)測PCR反應(yīng)進程,與傳統(tǒng)染料法相比,大大提高了特異性,而且縮短了時間和人力成本,僅需一次測定就可以得到無毒株和產(chǎn)毒株的比例;而且已經(jīng)被證明可以精確定量室內(nèi)培養(yǎng)和野外樣品中產(chǎn)毒微囊藻的比例[9]。本研究中PC和Cm基因的擴增曲線顯示雙通道探針法qPCR可以精確定量產(chǎn)毒和無毒微囊藻(圖5)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,探針合成成本逐漸降低,熒光定量PCR儀也將更加普及,未來雙通道qPCR定量檢測產(chǎn)毒藍(lán)藻將成為主流。

測試了qPCR定量產(chǎn)毒和無毒微囊藻效果后,我們開展了產(chǎn)毒微囊藻PCC 7806及其無毒突變株P(guān)CC 7806mcyB-的競爭實驗。在長周期(70d培養(yǎng))的培養(yǎng)中,系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定后,產(chǎn)毒株與無毒株的比例不再發(fā)生變化,并且可以長時間維持穩(wěn)定(圖6)。為了縮短連續(xù)培養(yǎng)周期,我們在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下,開展了短周期的競爭實驗,此時連續(xù)培養(yǎng)在10d左右就進入了穩(wěn)定期,而且穩(wěn)定期時產(chǎn)毒株和無毒株比例與長周期一致(圖6—7),這表明優(yōu)化后的實驗競爭體系可以表征產(chǎn)毒與無毒微囊藻的競爭格局。后續(xù)競爭實驗在此條件下,只需要進行14—16d即可。

利用優(yōu)化的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng),我們開展了不同光強對產(chǎn)毒與無毒微囊藻競爭影響的實驗。在35和80 μmol/(m2·s)光強下,無毒株占據(jù)優(yōu)勢;而在15和5 μmol/(m2·s)光強下,無毒株和產(chǎn)毒株沒有優(yōu)勢差異(圖9)。Kardinaal等[22]發(fā)現(xiàn)在25 μmol/(m2·s)光強下,無毒株占據(jù)優(yōu)勢,甚至能夠替換產(chǎn)毒株,但Van de Waal等[10]則發(fā)現(xiàn)在25 μmol/(m2·s)光強下,產(chǎn)毒株占據(jù)明顯優(yōu)勢。由于Kardinaal等[22]的研究和本研究中用到的藻株都出現(xiàn)在Van de Waal等[10]的研究中,因此產(chǎn)毒株和無毒株在不同光強下競爭的差異,不能簡單歸因于藻株差異。PCC 7806mcyB-突變株是在mcyB片斷插入氯霉素抗性基因[14],從而使得mcyB基因失活,不能合成微囊藻毒素,其他的遺傳基因保持不變。Hesse等[23]分析PCC 7806及其突變株P(guān)CC 7806mcyB-的差異,發(fā)現(xiàn)不同光照強度下兩株藻生長的生長并沒有顯著性差異,只是突變株相對野生型PCC 7806而言,其色素的含量有所下降。雖然微囊藻毒素合成被認(rèn)為是耗能過程,但是這部分耗能可能相對比較低[24],而且PCC 7806mcyB-突變株雖然不能合成毒素,但是mcyABC等基因的轉(zhuǎn)錄過程不受影響[25],這部分活動也需要能量。因此,產(chǎn)毒株因為合成MCs耗能而在各種限制條件下相對于無毒株占據(jù)優(yōu)勢的假說也無法解答光限制下的差異。通過更多藻株進行實驗可能有助于解答產(chǎn)毒株與無毒株在競爭中的差異。

圖9 在連續(xù)培養(yǎng)條件下不同光強處理中產(chǎn)毒微囊藻(PCC 7806)與無毒微囊藻(PCC 7806 mcyB-)細(xì)胞比例的變化Fig.9 Percentages of the toxic Microcystis (PCC 7806) and non-toxic Microcystis (PCC 7806 mcyB-) in competition under continuous culture when treated with different lights

綜上所述,在不同因素作用下,產(chǎn)毒與無毒微囊藻競爭的結(jié)果往往存在巨大差異,這可能和藻株差異有關(guān),而其實質(zhì)是微囊藻屬基因組具有很強的柔性和可塑性。比較基因組學(xué)研究表明銅綠微囊藻擁有一個巨大的,開放的泛基因組,核心基因組約占到每個基因組大小的(48.4±4.6)%[26]。不同微囊藻藻株基因組在基因組成、數(shù)目與排列等方面都有較大差異,每株微囊藻均包含有數(shù)百至上千個藻株特有基因,而各藻株的核心基因數(shù)目只有2100個左右,少于各藻株基因總數(shù)目的1/2,這些結(jié)果可能解釋微囊藻不同藻株間的表型多樣性[27]。基于此,開展室內(nèi)產(chǎn)毒與無毒微囊藻競爭實驗時,選取多株藻株進行實驗,可能得到更科學(xué)的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究利用發(fā)酵罐構(gòu)建了藻類連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。通過對補料時間、起始接種密度和稀釋率的優(yōu)化,得到了最優(yōu)培養(yǎng)條件。在光照為35 μmol/(m2·s)的連續(xù)培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒微囊藻PCC 7806及其無毒突變株P(guān)CC 7806mcyB-以1∶1接種后會達(dá)到平衡,但兩者以不同的優(yōu)勢度(即無毒株占據(jù)優(yōu)勢)長期穩(wěn)定共存,而且通過優(yōu)化后的培養(yǎng)體系,可以表征產(chǎn)毒與無毒微囊藻的競爭格局。在優(yōu)化的連續(xù)培養(yǎng)條件下,當(dāng)光充足時[35和80 μmol/(m2·s)],無毒株在連續(xù)培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢;而光限制時[15和5 μmol/(m2·s)],無毒株和產(chǎn)毒株維持初始接種比例不變。