基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討羅布麻葉抗動脈粥樣硬化的作用機制

李富利，張愛文，巨名飛

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種以動脈內(nèi)膜酯質(zhì)斑塊形成為特征的常見疾病，也是目前導致心血管危重癥的常見病因[1-2]。據(jù)統(tǒng)計動脈粥樣硬化的發(fā)病率在我國正呈逐年增高，且發(fā)病年齡逐漸年輕化，這一問題嚴重危害著人類的健康?？茖W有效的預(yù)防和治療動脈粥樣硬化已成為心血管疾病治療的關(guān)鍵[3]。臨床上治療動脈粥樣硬化目前主要應(yīng)用他汀類藥物給予調(diào)脂治療，可是該類藥物的長期應(yīng)用帶來的不良反應(yīng)如肝損害、骨骼肌損害及增加癌癥風險并不能滿足抗動脈粥樣硬化治療的需求。近年研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)中藥對動脈粥樣硬化的治療具有獨特的優(yōu)勢及特色，現(xiàn)代中醫(yī)認為痰濁、瘀血、毒邪阻滯損傷脈絡(luò)是動脈粥樣硬化發(fā)生的基礎(chǔ)[4-5]。羅布麻葉(Apocynum venetum L.)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》 ，為唇形科多年生草本植物羅布麻的干燥葉。其味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效[6]，藥用價值較高，對高血壓，高血脂，動脈粥樣硬化治療均有治療功效。已有研究報告羅布麻葉對心血管疾病功效顯著，但對作用成分和作用機制的研究尚不十分確切[7-8]。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討羅布麻葉抗動脈粥樣硬化的活性成分，研究其作用機制，為羅布麻葉的后期藥理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1篩選羅布麻葉活性成分及預(yù)測其作用靶點 以羅布麻葉為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP)檢索化學成分，設(shè)置條件口服生物利用度≥30%及類藥性≥0.18來篩選羅布麻葉的活性成分。然后在預(yù)測羅布麻葉活性成分的作用靶點，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中(http：//www.uniprot.org)對靶點名稱進行規(guī)范統(tǒng)一。將上述收集到的羅布麻葉活性成分導入Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫，獲得相對應(yīng)的靶點蛋白。

1.2動脈粥樣硬化相關(guān)靶點蛋白篩選 在Genecards (https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫檢索動脈粥樣硬化疾病的相關(guān)靶點，以“atherosclerosis”為檢索詞進行搜索，去重后獲得4 495個疾病靶點蛋白。

1.3羅布麻葉活性成分靶點與疾病靶點交集 將1.1與1.2兩項研究所得的藥物與疾病靶點輸入Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中，繪制韋恩圖后得到82個羅布麻葉與動脈粥樣硬化疾病靶點的交集基因。

1.4藥材-化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 將羅布麻葉與動脈粥樣硬化的交集靶點導入 Cytoscape 3.7.2構(gòu)建藥材-化合物-靶點-疾病通路網(wǎng)絡(luò)，進行拓撲分析。

1.5構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein - protein interactions ，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 將1.3中獲得82個交集靶點輸入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置條件物種選擇為人，相互作用分數(shù)≥0.99，得到羅布麻葉與動脈粥樣硬化疾病靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用 Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化。

1.6GO及KEGG通路結(jié)果分析 將1.3中羅布麻葉與動脈粥樣硬化疾病靶點的82個交集基因基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包進行關(guān)鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結(jié) 果

2.1篩選羅布麻葉活性成分及預(yù)測作用靶點蛋白結(jié)果 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中我們研究得到189個羅布麻葉化合物成分，其中符合口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18的活性成分有6個，該6個活性成分的基本信息見表1。將上述6個羅布麻葉活性成分導入Drugbank數(shù)據(jù)庫，去除重復靶點蛋白獲得97個靶點蛋白。

表1 羅布麻葉中活性成分成分基本信息

2.2動脈粥樣硬化相關(guān)靶點的篩選 在Genecaeds數(shù)據(jù)庫中檢索“atherosclerosis”，獲得動脈粥樣硬化相關(guān)疾病靶點4 495個。

2.3羅布麻葉活性成分靶點與疾病靶點交集 將篩選到的動脈粥樣硬化相關(guān)基因與羅布麻葉活性成分的靶點蛋白基因相匹配，通過韋恩圖的繪制獲得羅布麻葉活性成分和動脈粥樣硬化疾病相關(guān)靶點的交集，得到82個關(guān)于羅布麻葉具有治療動脈粥樣硬化的作用靶點：PGR、NCOA2、NR3C2、PTGS1、SCN5A、PTGS2、HSP90AB1、NOS2、AR、PPARG、DPP4、PRSS1、CHRM1、ACHE、CHRM2、ADRA1B、F7、RELA、IKBKB、AKT1、BCL2、BAX、AHR、TNFAIP6、JUN、CYP1B1、CASP3、MAPK8、SELE 、MMP1、ALOX5、STAT1、CDK1、HMOX1、CYP1A2、CYP3A4、VCAM1、NR1I3、GSTM1、ICAM1、GSTM2、SLPI、HAS2、ESR1、RXRA、CAT、EGFR、VEGFA、CYP1A1、CCND1、GSTP1、BCL2L1、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL10RA、RB1、CDK4、IL6R、TP53、NFKBIA、TOP1、MDM2、APP、PCNA、ERBB2、CASP7、MCL1、BIRC5、IL2RA、CCNB1、TYR、IFNG、IL4、XIAP、CD40LG、SLC2A4、PTGES、MET、 NR1I2。見圖1。

2.4藥材、化合物、靶點與疾病網(wǎng)絡(luò) 見圖2，紫色長方形表示羅布麻葉藥材，綠形三角形表示羅布麻葉活性成分，藍色橢圓形表示羅布麻葉與動脈粥樣硬化的交集靶點，紅色菱形表示動脈粥樣硬化疾病。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點越多，此節(jié)點代表的化合物、靶點和通路越重要。

圖2 藥材-化合物-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖 82個羅布麻葉潛在治療動脈粥樣硬化的作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中進行PPI蛋白互作分析結(jié)果為：共有82個節(jié)點，989條邊，見圖3。運用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析所得關(guān)鍵節(jié)點，再通過degree排序，篩選出分值大于平均分的基因為核心靶點，運用R 3.6.1把前30個靶點繪制條形圖，見圖4。結(jié)果表明該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點包括AKT1、TP53、VEGFA、JUN、MAPK8、CASP3、EGFR、TPGS2、MAPK1、MMP9等，表明羅布麻葉可能通過多個靶點治療動脈粥樣硬化。

圖3 羅布麻葉-動脈粥樣硬化交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 GO功能富集分析用于注釋基因參與的生物學過程，包括分子功能、生物過程、細胞組分三方面。對獲得的82個羅布麻葉潛在治療動脈粥樣硬化作用靶點進行GO功能分析，結(jié)果如圖5所示：上述靶點基因主要參與調(diào)控基因如類泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)等生物學功能。前10個參與相關(guān)生物功能調(diào)控的基因見表2。羅布麻葉抗動脈粥樣硬化的交集靶點GO功能富集主要涉及細胞因子活性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。這表明羅布麻葉通過抑制細胞因子活性和氧化應(yīng)激來達到抗動脈粥樣硬化的作用。

表2 羅布麻葉-動脈粥樣硬化參與相關(guān)生物功能調(diào)控的基因

圖5 羅布麻葉-動脈粥樣硬化潛在作用靶點GO 功能富集分析

2.7羅布麻葉活性成分抗動脈粥樣硬化靶點KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果見圖6及圖7。選取了前 20 條通路進行可視化。圖中氣泡越大代表P值越小，表明通路越重要。可見，這82個靶點主要參與調(diào)控PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)。對羅布麻葉與心肌缺血的共同靶點進行 KEGG 通路富集分析，流體剪應(yīng)力和動脈粥樣硬化(Degree=22)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(Degree=20)、癌癥通路(Degree=18)腫瘤壞死因子信號通路(Degree=14)、白介素-17 信號通路(Degree=14)等。KEGG網(wǎng)絡(luò)圖表明羅布麻通過多條信號通路起到抗動脈粥樣硬化的作用。見圖8、圖9。

圖6 羅布麻葉活性成分抗動脈粥樣硬化靶點KEGG通路富集分析條形圖

圖7 羅布麻葉活性成分抗動脈粥樣硬化靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 P13K-AKT信號通路與動脈粥樣硬化

圖9 細胞流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種以膽固醇脂質(zhì)不斷在動脈壁聚集沉積為特征慢性炎癥性疾病。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制較多，血液循環(huán)中的脂質(zhì)沉積，產(chǎn)生的活性氧致血管內(nèi)皮功能損傷，誘導單核細胞遷移泡沫化，炎性介質(zhì)釋放、內(nèi)膜纖維增生及鈣質(zhì)沉著，形成動脈粥樣斑塊[9-10]。動脈粥樣硬化過程的復雜及多變性給治療帶來了極大挑戰(zhàn)，雖然阿托伐他汀藥物治療是治療動脈粥樣硬化的主要措施，但其作用靶點單一，對肝臟、肌肉及皮膚都存在不可忽視的損害作用[11],近代中藥研究發(fā)現(xiàn)羅布麻具有防治心血管系統(tǒng)疾病的作用，由于其不良反應(yīng)小及作用多層次、多靶點等優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法就羅布麻葉抗動脈粥樣硬化的有效活性成分、可能作用機制進行了探討。

羅布麻葉的主要有效活性成分包括原花青素B1、谷甾醇、木犀草素、山柰酚、兒茶素和表兒茶素。原花青素是天然廣泛存在的一類生物類黃酮化合物的總稱，原花青素B1是原花青素的一種形式，具有抗氧化、清除氧自由基、抗炎、抗動脈粥樣硬化等多種藥理學作用[12]。朱順義等[13]研究原花青素可以通過調(diào)控脊髓Toll樣受體4(TLR4)/p38有絲分裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)/核因子κB(NF-κB)信號通路蛋白表達來降低炎性介質(zhì)的活性，抑制炎性過程。Rong等[14]研究表明原花青素可以降低介導膽固醇生物合成的 3-羥基-3-甲基戊二酰(HMG)-CoA還原酶的mRNA水平，并上調(diào)調(diào)節(jié)膽固醇流出的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白-1的mRNA 表達，可以有效緩解脂質(zhì)紊亂，尤其是高膽固醇血癥和改善動脈粥樣硬化。谷甾醇屬于植物甾醇，有明顯的抗炎、抗氧、抗動脈粥樣硬化等生物學活性[15]。Liao等[16]研究了從辣木中分離的 β-谷甾醇的抗炎活性，結(jié)果顯示β-谷甾醇可抑制巨噬細胞分泌炎癥因子-α、白介素-1β、白介素-6、白介素-8等。此外，谷甾醇能顯著降低巨噬細胞中炎癥小體關(guān)鍵成分 NLRP3 的表達，并抑制家蠶凋亡蛋白酶-1(caspase-1) 的活化從而起到抗炎作用。Gogoi 等[17]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過抑制凝血酶的活性發(fā)揮抗凝作用，防止血栓的發(fā)生。動脈粥樣硬化始于內(nèi)膜的損傷和炎癥，谷甾醇能有效預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。木犀草素和山柰酚均是黃酮類化合物[19]，越來越多的研究證明黃酮類化合物在抗氧化、抗炎、保護心血管方面有著重要的治療和預(yù)防功能，對防治動脈粥樣硬化有一定療效。Ding等[20]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素通過減輕炎癥顯著減輕高脂飲食誘導的 ApoE 缺乏小鼠動脈粥樣硬化，進一步研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過在體外分別抑制信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (STAT3) 來減少氧化低密度脂蛋白誘導的炎癥反應(yīng)而減輕動脈粥樣硬化。山柰酚還可以通過調(diào)節(jié)細胞凋亡信號調(diào)控激酶1(ASK1)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(JNK1/2和p38)和減輕氧化應(yīng)激、抗炎抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生[21]。兒茶素和表兒茶素是天然植物中提取出來的一類酚類活性物質(zhì)，具有降糖、降低血中膽固醇及低密度脂蛋白,并增加高密度脂蛋白、防治心血管疾病等功效[22]。綜合上述研究說明，羅布麻主要六種活性成分皆具有清除氧自由基、抗氧化、抗動脈粥樣硬化的作用，通過多條信號通路作用于不同靶點，從而達到防治心血管疾病的效果。

綜合動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)研究以及對羅布麻葉的網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)構(gòu)分析，本研究結(jié)果認為羅布麻葉抗動脈粥樣硬化可能的機制抑制細胞因子活性、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，主要涉及靶點 AKT1、TP53、VEGFA、JUN、MAPK8、等及磷酸化磷酯酰肌醇3激酶-絲/蘇氨酸激酶(P13K-AKT)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、腫瘤壞死因子信號通路以及白介素-17 信號通路?；诖?，羅布麻葉可通過上述的信號通路來調(diào)控細胞因子活性和氧化應(yīng)激反應(yīng)等起到抗動脈粥樣硬化的作用。其中P13K-AKT信號通路與動脈粥樣硬化通路排首位。作為連接胞外信號與細胞功能效應(yīng)的重要分子，P13K-AKT在一系列上游信號分子的影響下，調(diào)控下游眾多分子信號通路，對細胞的各項功能均起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。同時，P13K-AKT信號通路還參與高血壓、動脈粥樣硬化等病理生理過程[23]。羅布麻葉抗動脈粥樣硬化可能主通過 P13K-AKT信號通路對細胞的增殖、分化、遷移發(fā)揮重要的調(diào)控作用[24-25]。在流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路中，已有研究證實剪切力在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中起到重要作用[26]。動脈粥樣硬化易感區(qū)域的內(nèi)皮細胞對流體剪應(yīng)力具有獨特的反應(yīng)，內(nèi)皮細胞將來自血流的摩擦力(流體剪切應(yīng)力)轉(zhuǎn)化為生化信號，通過專門的機制和途徑調(diào)節(jié)基因表達和細胞行為。表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞的增殖和促炎基因表達的激活，一氧化氮的產(chǎn)生減少，白細胞黏附和滲透性增加[27]，血小板的黏附聚集加強，由此引起血栓的形成，加速動脈粥樣硬化的進程[28-29]。羅布麻葉能夠減輕剪應(yīng)力的異常改變，并且抑制內(nèi)皮細胞的活化，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，達到抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)羅布麻可通過6種主要成分，作用于AKT1、TP53、MAPK8、JUN等30個靶點，并通過調(diào)控 P13K-AKT信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路等發(fā)揮作用。我們運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法分析得出羅布麻葉抗動脈粥樣硬化的主要活性成分、作用靶點和關(guān)鍵通路，羅布麻葉中的多種活性成分可通過多個靶點的不同途徑達到抗動脈粥樣硬化作用。本研究為羅布麻葉抗動脈粥樣硬化機制的后續(xù)研究提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。