補(bǔ)陽還五湯減輕腦缺血再灌注損傷的信號通路研究進(jìn)展

辛紫媛，高維娟，2

(1. 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

清朝王清任著《醫(yī)林改錯》中首先提出了由多草藥復(fù)合而成的經(jīng)典中醫(yī)方劑補(bǔ)陽還五湯，主要由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁七味藥組成，具有補(bǔ)氣推動血行、祛瘀通絡(luò)之效，在抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、興奮性氨基酸的毒性、氧自由基的損傷、炎癥細(xì)胞的聚集等方面發(fā)揮作用，對抗腦血管疾病不良損傷療效顯著[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是參與缺血性腦血管疾病中一系列復(fù)雜生理與病理功能級聯(lián)反應(yīng)的基礎(chǔ),成為缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)治療中亟待解決的關(guān)鍵難點(diǎn)[2]。由于CIRI后導(dǎo)致大量神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞壞死，患者將出現(xiàn)不同程度的局部腦組織功能障礙和神經(jīng)損傷，激活一系列反應(yīng)參與其發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[3]。目前補(bǔ)陽還五湯干預(yù)CIRI取得了一定進(jìn)展，但其機(jī)制尚不完全清楚，本文將對補(bǔ)陽還五湯在CIRI調(diào)節(jié)中的相關(guān)作用通路機(jī)制的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PI3K/Akt通路機(jī)制

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)是在多種細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抵抗凋亡、促進(jìn)增殖等重要生物學(xué)功能的經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路，除被用于研究過度激活可導(dǎo)致腫瘤無限增殖外，還在細(xì)胞的生存、代謝方面發(fā)揮重要作用,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程, 因此成為CIRI的重要參與者[4-5]。

董元等[6]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯改善了腦缺血損傷后大鼠的認(rèn)知能力，明顯縮小腦梗死腦組織的面積，誘導(dǎo)PI3K、p-Akt、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)高表達(dá)，同時抑制下游凋亡促進(jìn)基因Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein，Bax)的表達(dá)水平，保護(hù)海馬的組織結(jié)構(gòu)。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可作用于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)進(jìn)而通過激活PI3K/Akt通路介導(dǎo)下游靶點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，使14-3-3蛋白(14-3-3 protein)與B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動子(Bcl-xL/Bcl-2asociated death promoter，Bad)結(jié)合產(chǎn)生抗凋亡作用，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對CIRI的神經(jīng)修復(fù)作用與EGFR/PI3K/Akt/14-3-3信號級聯(lián)通路調(diào)節(jié)有關(guān)。李峰等[8]發(fā)現(xiàn)腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子Apelin的受體APJ蛋白被Apelin激活后發(fā)揮誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元再生，上調(diào)PI3K表達(dá)水平。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后的腦缺血大鼠中APJ、p-PI3K、p-Akt蛋白及APJ、Apelin mRNA表達(dá)上調(diào)進(jìn)而減輕神經(jīng)損傷。通過使用PI3K選擇性抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin)，可顯著抑制Apelin/APJ的腦神經(jīng)修復(fù)作用[9]。同時，PI3K/Akt通路是抗血小板活化、黏附和聚集的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑[10]。鄭麗嫻等[11]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路下游靶向因子與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1)及Akt蛋白上蘇氨酸Ser473位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)水平，抵抗PI3K/Akt通路激活，降低全血中血小板P-選擇素(CD62P)含量，成為抗血小板活化、抑制血栓形成的關(guān)鍵信號通路之一。

以上研究提示補(bǔ)陽還五湯可通過促進(jìn)PI3K/Akt通路發(fā)揮減輕缺血腦組織的凋亡，抑制其通路抗血小板活化，從而發(fā)揮對CIRI的保護(hù)作用。

2 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路機(jī)制

MAPK是細(xì)胞胞漿內(nèi)普遍存在的由絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)組成的蛋白激酶，在哺乳動物的大多數(shù)細(xì)胞中MAPK通路存在三個主要分支：p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extra cellular signal regulated kinases,ERK1/2)，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)[12]。腦組織缺血時可在應(yīng)激條件下與其下游靶點(diǎn)ERK1/2和p38MAPK發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，使神經(jīng)元中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)發(fā)生磷酸化，參與神經(jīng)再生、炎癥和應(yīng)激等反應(yīng),是參與CIRI調(diào)節(jié)中的重要媒介[13-14]。

孫立倩等[15]發(fā)現(xiàn)腦缺血后海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷明顯，使用補(bǔ)陽還五湯后可抑制磷酸化p38MAPK和神經(jīng)損傷因子環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX2)高表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞損傷后修復(fù)的功能。趙雅寧等[16]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯組大鼠p-p38MAPK和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表達(dá)量顯著低于模型組大鼠，凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。補(bǔ)陽還五湯通過阻斷p38MAPK級聯(lián)反應(yīng)，拮抗大鼠局灶性腦缺血損傷因子的激活，抑制凋亡相關(guān)基因或蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，有效減少神經(jīng)元損傷[15-17]。

Jinglong等[18]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯用藥治療30d后的大鼠，海馬CA1區(qū)ERK2以及ERK2 mRNA的表達(dá)量顯著增加，從而參與缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞生長和分化以及損傷的修復(fù)。Jover-Mengual等[19]發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)和CREB的激活，在去卵巢雌鼠和沙鼠腦缺血損傷中發(fā)揮保護(hù)海馬缺血CA1區(qū)神經(jīng)元的重要作用。黃昕等[20]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能作用在ERK/CREB通路的下游基因p-ERK1/2、p-CREB1蛋白使其表達(dá)上調(diào)，此外應(yīng)用膜性G蛋白耦聯(lián)雌激素受體1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)的特異性阻斷劑G15可拮抗部分神經(jīng)保護(hù)作用，補(bǔ)陽還五湯可發(fā)揮類雌激素作用誘導(dǎo)缺血側(cè)海馬DG區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)再生。

此外，補(bǔ)陽還五湯還可通過調(diào)節(jié)MAPK通路級聯(lián)反應(yīng)，抑制p38MAPK和ERK1/2磷酸化表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞單層跨膜電阻值(TEER)顯著升高，減少細(xì)胞骨架的變化，抑制膜通透性變大，改善細(xì)胞內(nèi)皮損傷而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[21-22]。

以上研究顯示補(bǔ)陽還五湯可通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路激活作用于下游p38MAPK和ERK1/2兩個重要靶點(diǎn)，抑制其通路從而抗凋亡和抗動脈粥樣硬化，促進(jìn)其通路發(fā)揮類雌激素作用的神經(jīng)再生與損傷后修復(fù)，表明補(bǔ)陽還五湯拮抗CIRI的發(fā)生發(fā)展與MAPK信號通路密切相關(guān)。

3 核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路機(jī)制

NF-κB是核因子p65和p50構(gòu)成的同源或異源二聚體復(fù)合物，作為一種參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)蛋白，可發(fā)揮多向性調(diào)控編碼細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子、趨化性因子、生長因子、免疫受體、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子等方面的作用，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和先天性免疫應(yīng)答，是CIRI產(chǎn)生后改善神經(jīng)功能缺損，抑制缺血后腦組織損傷的主要機(jī)制之一[23-25]。

NF-κB信號傳導(dǎo)通路與核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-kappa-B，IκBs)結(jié)合時處于靜息狀態(tài),包括IκBα、IκBβ和IκBε等[26]。郭樂[27]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可通過減少抑制因子IκB降解下調(diào)NF-κB/p65,NF-κB/p50磷酸化，通過調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號通路抑制炎癥因子，參與腦神經(jīng)保護(hù)作用。Jin等[28]發(fā)現(xiàn)給予補(bǔ)陽還五湯后大鼠局灶性腦梗死面積有所恢復(fù)、病理損傷減輕，巢蛋白(Nestin)表達(dá)增加，通過抑制NF-κB和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)活性，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡作用，可明顯改善體內(nèi)大鼠腦缺血再灌注損傷和體外培養(yǎng)的HT22細(xì)胞損傷。高劍峰等[29]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可部分逆轉(zhuǎn)老齡大鼠腦缺血再灌注后有促炎作用的NF-κB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的相對高表達(dá)，拮抗部分神經(jīng)毒性物質(zhì)引起的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的破壞。董志強(qiáng)等[30]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯可下調(diào)炎癥因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用，其機(jī)制與阻礙Toll樣受體4(Toll like receptor4，TLR4)作用于NF-κB中的接頭蛋白髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)。

上述研究從NF-κB通路激活后不同蛋白表達(dá)水平，探討補(bǔ)陽還五湯可通過合理有效抑制其通路的級聯(lián)反應(yīng)參與抗炎癥反應(yīng)、改善細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

4 Notch通路機(jī)制

Notch信號通路是介導(dǎo)鄰近細(xì)胞間短程信號的基本途徑,當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后被激活,廣泛參與神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的維持和神經(jīng)發(fā)生進(jìn)程，是治療CIRI的重要靶點(diǎn)[31-32]。

吳增等[33]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可以抵抗NSCs移植后CIRI大鼠神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)損傷效應(yīng)。周華忠[34]發(fā)現(xiàn)超微粉化后1/3量補(bǔ)陽還五湯可增強(qiáng)Notch受體Notch1與Notch配體Delta1結(jié)合的表達(dá)，反式作用放大Notch通路后誘導(dǎo)缺血側(cè)細(xì)胞增殖，與全量補(bǔ)陽還五湯作用效應(yīng)相同。張紫微等[35]發(fā)現(xiàn)對大鼠施以大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型后用補(bǔ)陽還五湯治療，可作用于其缺血側(cè)腦組織，通過激活Notch通路上調(diào)下游主要靶點(diǎn)Notch1和重要效應(yīng)分子Hes1、Hes5的表達(dá)水平，增強(qiáng)NSCs移植后的腦保護(hù)作用。涂建鋒等[36]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯在CIRI早中期上調(diào)大鼠海馬區(qū)Hes1和Hes5蛋白水平發(fā)揮促進(jìn)NSCs增殖效應(yīng)，而在晚期顯著抑制該表達(dá)水平發(fā)揮促進(jìn)NSCs分化成為神經(jīng)元作用，闡明通過Notch通路動態(tài)影響CIRI產(chǎn)生后內(nèi)源性NSCs增殖水平。

提示補(bǔ)陽還五湯通過對Notch通路動態(tài)變化調(diào)控實(shí)驗(yàn)性大鼠MCAO模型NSCs的增殖和分化，是補(bǔ)陽還五湯作為治療CIRI靶向藥物的作用機(jī)制之一。

5 mTOR通路機(jī)制

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯過程的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，以兩種類型的多蛋白復(fù)合物mTORC1和mTORC2組成[37]。上游靶點(diǎn)可直接磷酸化mTOR或間接失活結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體2(TSC2)增強(qiáng)mTOR的激活[38]。通常在癌癥中被激活，但在缺血性疾病中卻被失活，廣泛涉及內(nèi)源性神經(jīng)損傷和自噬，是導(dǎo)致CIRI產(chǎn)生神經(jīng)疾病的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑[39-40]。

TSC2的缺失可激活mTOR途徑和其下游底物核糖體S6蛋白激酶(ribosomeprotein subunit 6 kinase 1，S6K1)活性，在細(xì)胞生長存活中處于中央調(diào)控位置[40]。和下游底物真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1，4E-BP 1)磷酸化后解離，啟動mRNA蛋白翻譯，促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖[41]。陳博威等[42]研究發(fā)現(xiàn)Cav-1小窩蛋白(caveolin-1, Cav-1)基因影響mTOR通路活性，加重腦缺血后神經(jīng)功能損傷，同時腦缺血后Cav-1敲除小鼠mTOR蛋白及mRNA表達(dá)增加，作用于S6K1、4E-BP1使其磷酸化，而補(bǔ)陽還五湯可顯著增強(qiáng)這種激活的強(qiáng)度，促進(jìn)蛋白合成、抑制細(xì)胞凋亡。周勝強(qiáng)[43]通過調(diào)控細(xì)胞自噬的起始因子unc-51樣激酶1 (unc-51-like kinase 1,ULK1) 蛋白靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)預(yù)先應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯后的小鼠通過正向靶向調(diào)控Cavl/mTOR/ULK1通路活性，提高了缺血腦組織中mTOR Ser2448位點(diǎn)與ULK1的Ser757位點(diǎn)蛋白磷酸化表達(dá)水平，發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。

由此可知，補(bǔ)陽還五湯可通過促進(jìn)mTOR信號通路，抑制缺血半暗帶自噬水平，可明顯改善其神經(jīng)功能缺失癥狀進(jìn)而減輕CIRI。

6 核因子紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路機(jī)制

Nrf2是介導(dǎo)機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2主要通過與啟動子上的抗氧化應(yīng)答元件(anti-oxidant response element,ARE)的結(jié)合,啟動下游蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與內(nèi)源性抵抗氧化應(yīng)激防御機(jī)制[44]。氧化應(yīng)激時會產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)，在CIRI的病理損傷中起著關(guān)鍵作用，此傳導(dǎo)通路與CIRI密切相關(guān)[45]。

朱雪欽[46]發(fā)現(xiàn)大鼠腦CIRI后可激活Nrf2/ARE通路，增加了轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和效應(yīng)蛋白血紅素加氧酶1(HO-1)基因表達(dá)水平，由于其活化程度被限制，不能完全恢復(fù)神經(jīng)損傷，通過補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后促進(jìn)其通路進(jìn)一步被活化，發(fā)揮抗內(nèi)源性氧化應(yīng)激，減少自由基損傷效應(yīng)。佘顏等[47]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯精簡方可通過Nrf2/HO-1通路途徑促進(jìn)Nrf2的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步增加下游基因HO-1的表達(dá)，使腦缺血后血管內(nèi)皮細(xì)胞增多，微血管密度增加，參與調(diào)節(jié)CIRI后血管新生。

因此補(bǔ)陽還五湯通過促進(jìn)對Nrf2通路靶向干預(yù)，提高抗氧化應(yīng)激防御的能力和促進(jìn)血管新生，從而進(jìn)一步改善CIRI。

7 酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tranions, JAK/STAT)通路機(jī)制

JAK/STAT通路是細(xì)胞因子信號下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，將刺激信號由胞外轉(zhuǎn)移到胞核調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。JAK2/STAT3信號通路被普遍認(rèn)為是其通路中重要的一條，在CIRI發(fā)生后JAK2被激活招募STAT3磷酸化進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[48]。

王凱華等[49]發(fā)現(xiàn)CIRI發(fā)生后JAK-STAT通路被激活，其下游靶點(diǎn)p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)上調(diào)，通過給予JAK2抑制劑AG490和補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，抑制其靶點(diǎn)高表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞的缺血后凋亡。

上述研究表明JAK/STAT通路是調(diào)節(jié)CIRI修復(fù)的重要作用靶點(diǎn)，在CIRI發(fā)生后補(bǔ)陽還五湯可抑制該通路參與抗細(xì)胞凋亡作用。

8 Wnt通路機(jī)制

Wnt分子通路是一條廣泛參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡的高度保守信號途徑，其中Wnt分子由細(xì)胞產(chǎn)生后分泌，傳遞給臨近細(xì)胞并激活靶細(xì)胞的信號后，調(diào)控多種機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)，Wnt/β-catenin作為Wnt信號通路的經(jīng)典途徑，對缺血性腦卒中的NSCs增殖、分化具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而有效保護(hù)CIRI后神經(jīng)損傷[50-51]。

羅東[52]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯治療后可激活Wnt/β-catenin通路，增加MCAO小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt1、Wnt3a、β-連接蛋白(β-catenin)等Wnt構(gòu)成因子的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)再生的發(fā)生發(fā)展，同時缺血組表達(dá)同樣上調(diào)但不及用藥組明顯。

表明補(bǔ)陽還五湯可通過進(jìn)一步靶向促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)途徑改善神經(jīng)病理性和功能性損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，成為參與調(diào)控CIRI防治新策略的重點(diǎn)。

9 展 望

針對上述通路進(jìn)行闡明確定補(bǔ)陽還五湯對于改善CIRI具有切實(shí)的效果，使我們能夠?qū)ρa(bǔ)陽還五湯發(fā)揮抗CIRI的作用機(jī)制作出一定解釋。但還存在一些問題：①目前對于補(bǔ)陽還五湯治療CIRI的發(fā)生機(jī)制仍尚未完全明確,研究多呈各個方向分散、實(shí)驗(yàn)研究方法過于單一，隨著高通量測序(high-throughput Sequencing)發(fā)展,實(shí)現(xiàn)從轉(zhuǎn)錄組和基因組水平對各個信號通路的靶點(diǎn)分析，使進(jìn)一步深入探索其作用機(jī)制成為可能。②已有研究表明補(bǔ)陽還五湯在治療CIRI通過抵抗上游PI3K-Akt信號通路，其可能通過磷酸化eNOS產(chǎn)生NO，抑制NO/cGMP/PKG通路的活化，阻礙下游p38MAPK通路進(jìn)而發(fā)揮抗血小板作用[53]。補(bǔ)陽還五湯作用于CIRI作用機(jī)制并非通過單一信號通路實(shí)現(xiàn)，不同的通路之間交織成網(wǎng)絡(luò)相互調(diào)節(jié)的作用尚待研究，可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)更加全面的探索其對CIRI的改善作用并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。中藥補(bǔ)陽還五湯以其多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)作用于CIRI患者后的藥理效應(yīng)具有巨大潛力，構(gòu)建生物機(jī)制網(wǎng)絡(luò)是未來新的研究方向，通過綜合其復(fù)雜的藥效分子機(jī)制研究思路以期為臨床治療提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。