HPLC法同時測定胡頹子葉中3種成分的含量*

楊 玲，付志麗，熊 燕，趙 坤，楊 滔，何 利

(1.貴州護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

胡頹子葉(folium elaeagni)為胡頹子科胡頹子屬植物胡頹子(ElaeagunsPungengsThunb)的干燥葉，完整葉呈橢圓形，兩端鈍或基部圓形，上表面黃綠色，下表面銀白色，葉片常向背面反卷[1]。胡頹子葉性溫，味酸澀，主產(chǎn)于陜西、云南、福建、貴州等地。胡頹子葉在我國應(yīng)用歷史悠久，具有斂肺、止咳平喘、活血、緩解支氣管痙攣等功效[2-3]，主治肺虛、支氣管哮喘、慢性氣管炎、哮喘性支氣管炎、風(fēng)濕骨痛等癥[4-6]。另外，胡頹子葉也是定喘靈、消炎止咳片、海珠喘息靈等多種中成藥配方中的主要成分之一[7-8]。迄今為止，文獻(xiàn)報道胡頹子屬植物的主要化學(xué)成分包括黃酮類化合物、萜類和甾體、脂肪酸、生物堿、鞣質(zhì)、木脂素、有機(jī)酸、糖苷等，其中對黃酮類化合物的研究較多，而對胡頹子葉中黃酮類化合物的研究以山柰酚、槲皮素、銀鍛苷、異鼠李素等為主[9-10]。藥理研究表明，從胡頹子葉的乙醇提取物中分離得到的槲皮素、山柰素苷、葛花苷等化合物對人胃癌SGC-7901細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞的體外增殖有顯著的抑制作用[11]。目前對于胡頹子葉中化學(xué)成分的含量測定鮮有報道，嚴(yán)重制約了其開發(fā)與利用，因此，對胡頹子葉的研究有待進(jìn)一步深入。為了更好地利用胡頹子葉的藥用價值，解決其用藥安全、有效和可控性，亟需一種科學(xué)、合理的胡頹子葉的質(zhì)量控制方法。本研究建立了高效液相色譜(HPLC)法同時測定胡頹子葉中槲皮素、銀鍛苷和山柰酚3種成分含量的測定方法，此方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為胡頹子葉相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)，同時為胡頹子資源的深度開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 Agilent 1260型HPLC儀(包括四元泵，在線脫氣機(jī)，自動控溫自動進(jìn)樣，柱溫箱，DAD檢測器，色譜工作站)，十萬分之一天平(FA2004N型，上海菁海儀器有限公司)，KQ-3000型數(shù)控超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司，300 W)，SB-2000型水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)。

1.1.2藥材與試劑 胡頹子葉購買于藥材市場和采自貴州不同地區(qū)。槲皮素對照品(生產(chǎn)批號：100081-201610)、山柰酚(生產(chǎn)批號：110861-201611)均購于中國食品藥品檢定研究院；銀鍛苷對照品(生產(chǎn)批號：20316-62-4)購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純(Merck Millipore)，液相用水為超純水。制樣所用試劑甲醇、乙醇、磷酸、鹽酸均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備 精密稱取對照品槲皮素、銀鍛苷、山柰酚，置于容量瓶內(nèi)，甲醇定容，得到濃度分別為52.2、105.1、104.8 μg/mL的槲皮素、銀鍛苷、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2供試品溶液的制備 精密稱取胡頹子葉樣品粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加入80.0 mL乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)，稱定質(zhì)量，加熱回流提取4 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾[12-13]，即得。

2.3色譜條件 色譜柱：Kromasil Eternity-5C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；流動相：以甲醇作為A相，0.05%磷酸-水溶液作為B相，A-B(54∶46)等度洗脫，進(jìn)樣量5 μL，洗脫時間30 min[14]。HPLC圖見圖1。

A.對照品；B.供試品。1.槲皮素；2.銀鍛苷；3.山柰酚。圖1 HPLC圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”項下對照品儲備液進(jìn)行不同比例稀釋，制得5個不同濃度對照品。精密吸取10 μL分別注入HPLC儀，測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明各成分在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 線性關(guān)系試驗考察

2.4.2精密度試驗 精密吸取槲皮素、銀鍛苷、山柰酚的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果槲皮素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.73%，銀鍛苷峰面積的RSD為0.61%，山柰酚峰面積的RSD為0.65%。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.69%，銀鍛苷峰面積的RSD為0.62%，山柰酚峰面積的RSD為0.63%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗 精密稱取胡頹子葉樣品6份各1.0 g，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果槲皮素的平均含量為336.0 μg/g，RSD為1.21%；銀鍛苷的平均含量為217.0 μg/g，RSD為1.18%；山柰酚的平均含量為704.0 μg/g，RSD為1.17%。

2.4.5回收率試驗 取同一批次已知含量的胡頹子葉藥材粉末9份，各0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，然后分別加入80%、100%、120% 3個水平的槲皮素(A)、銀鍛苷(B)和山奈酚(C)對照品溶液，各平行3份，在“2.3”項下色譜條件下測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.5樣品含量測定 精密稱取不同產(chǎn)地的胡頹子葉樣品粉末1.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項下色譜條件下進(jìn)樣，記錄各色譜峰面積，計算各樣品中槲皮素、銀鍛苷、山柰酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果(mg/g)

2.6試驗條件的選擇 試驗以綜合評分為考察指標(biāo)，乙醇-15%鹽酸比、提取時間(h)、提取溫度(℃)、料液比等影響因素進(jìn)行了單因素考察，其中綜合評分=槲皮素含量×0.4+銀鍛苷含量×0.2+山柰酚含量×0.4。

2.6.1不同濃度的溶劑與15%鹽酸比的選擇 精密稱取胡頹子葉樣品粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50 mL甲醇-15%鹽酸(3∶1、3.5∶1、4∶1)、50 mL乙醇-15%鹽酸(3∶1、3.5∶1、4∶1)，稱定質(zhì)量，在80 ℃條件下回流提取2 h，冷卻，補重，濾過，用0.45 μm微孔濾膜過濾，并按“2.3”項下色譜條件對供試品進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明，乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)提取時綜合評分最高，見圖2，故選擇乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑與15%鹽酸比對提取工藝的影響

2.6.2料液比的選擇 精密稱取胡頹子葉樣品粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入20、40、60、80、100倍量的乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)，稱定質(zhì)量，在80 ℃條件下回流提取2 h，冷卻，補重，濾過，用0.45 μm微孔濾膜過濾，并按“2.3”項下色譜條件對供試品進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明，料液比為1∶100時綜合評分趨于穩(wěn)定，見圖3。故選料液比為1∶80的乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)。

圖3 料液比對提取工藝的影響

2.6.3提取時間的考察 精密稱取胡頹子葉樣品粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80 mL乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)，稱定質(zhì)量，在80 ℃條件下回流提取1、2、3、4 h，冷卻，補重，濾過，用0.45 μm微孔濾膜過濾，并按“2.3”項下色譜條件對供試品進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明，提取時間為4 h時，綜合評分下降，見圖4。故3 h作為提取時間。

圖4 提取時間對提取工藝的影響

2.6.4提取溫度的考察 精密稱取胡頹子葉樣品粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80 mL乙醇-15%鹽酸(3.5∶1)，稱定質(zhì)量，在70、80、90 ℃條件下回流提取3 h，冷卻，補重，過濾，用0.45 μm微孔濾膜過濾，并按“2.3”項下色譜條件對供試品進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明，提取溫度到90 ℃時，綜合評分不增加，見圖5。故優(yōu)選80 ℃作為提取溫度。

圖5 提取溫度對提取工藝的影響

2.6.5正交試驗設(shè)計 經(jīng)單因素試驗考察，對主要影響胡頹子葉藥材提取的因素：乙醇-15%鹽酸比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)和料液比(D)進(jìn)行考察，每個因素3個水平，進(jìn)行L9 (34)正交試驗，篩選最佳工藝條件，因素水平見表4，正交試驗結(jié)果見表5。

表4 L9 (34)正交試驗設(shè)計因素水平

表5 L9 (34)正交試驗結(jié)果

2.6.6正交試驗結(jié)果與分析 通過直觀分析，影響因素的主次為乙醇-15%鹽酸比>料液比>提取溫度>提取時間，最佳提取條件為：A2B3C2D2，即乙醇-15%鹽酸比3.5∶1，提取時間為4 h，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶80。驗證分析結(jié)果，即對正交試驗結(jié)果進(jìn)行了方差分析見表6。結(jié)果表明，乙醇-15%鹽酸比對提取工藝有顯著性影響，與直觀分析結(jié)果相符。

表6 方差分析結(jié)果

3 討 論

黃酮類化合物具有保護(hù)消化系統(tǒng)、心血管、肝損傷，抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[15-17]。胡頹子葉的化學(xué)成分槲皮素、銀鍛苷和山柰酚均屬于黃酮類化合物，其中槲皮素具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘、降血壓、增強毛細(xì)血管抵抗力等作用[18]；銀鍛苷具有顯著的降血糖、抗氧化等藥理作用[19]；山柰酚具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[20]。對胡頹子葉中的槲皮素、銀鍛苷及山柰酚進(jìn)行含量測定可以更好地利用其藥用價值。本試驗建立了胡頹子中槲皮素、銀鍛苷、山柰酚含量測定的HPLC方法，以這3種成分的含量為綜合指標(biāo)，選取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度進(jìn)行正交試驗，通過正交試驗優(yōu)化，確定最佳提取工藝為乙醇-15%鹽酸比為3.5∶1，提取時間為4 h，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶80。在此條件下3種成分均具有較高的含量。本試驗為完善胡頹子葉的質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)，為胡頹子藥材的綜合開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。