PRKG1在膀胱癌組織中的表達(dá)分析和臨床意義研究

金露 代光成 朱進(jìn) 劉曉龍 薛波新

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，全球范圍內(nèi)每年膀胱癌新發(fā)病例約50～55萬例，因膀胱癌死亡的病例約20萬例[1-2]。近30年來，膀胱腫瘤的臨床治療仍以手術(shù)治療為主，同時(shí)行化療、放療或其他治療。然而，即使進(jìn)行積極的綜合治療，膀胱癌仍有較高的復(fù)發(fā)率。對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者，手術(shù)不能達(dá)到根治切除的目的，包括化療、放療、免疫治療等綜合治療是其主要治療手段，但治療效果仍有限[1,3]。因此，尋找可用于預(yù)測病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物，明確膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，是目前臨床研究的重點(diǎn)之一。

cGMP依賴性蛋白激酶1(protein kinase cGMP-dependent 1, PRKG1)是cGMP信號(hào)通路中重要的作用分子，其在腫瘤中的相關(guān)研究較少[4]，膀胱癌中尚無PRKG1相關(guān)研究。本研究對(duì)在膀胱癌組織中PRKG1蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，并對(duì)其臨床意義進(jìn)行了分析探討。

材料與方法

一、數(shù)據(jù)獲取和臨床信息收集

利用開放和可獲取數(shù)據(jù)的癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)、cBioportal數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org)獲取PRKG1 mRNA在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，最終獲取18對(duì)膀胱癌和癌旁正常組織PRKG1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。收集于2019年1～12月在本院泌尿外科接受治療的膀胱癌患者臨床信息和保存的石蠟標(biāo)本，其中膀胱癌標(biāo)本107例，癌旁正常組織標(biāo)本19例。標(biāo)本收集均已獲得患者同意并簽署知情同意書，本研究項(xiàng)目經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

二、免疫組化檢測

取腫瘤組織石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)等過程，加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，加入一抗，4 ℃孵育過夜(12 h)，通用二抗37 ℃孵育30 min，DAB光鏡顯色，脫水、封片、鏡下觀察后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。蛋白表達(dá)強(qiáng)度采用以下方法計(jì)算[5]：在高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)不連續(xù)視野進(jìn)行觀察，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕色或者棕黃色顆粒多少作為染色強(qiáng)度(0：陰性；1：弱陽性；2：中等陽性；3：強(qiáng)陽性)；計(jì)算陽性染色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，并計(jì)分(0分：0；1分：1%～10%；2分：11%～50%；3分：51%～80%；4分：81%～100%)。每個(gè)切片二者得分相乘得出最終染色強(qiáng)度評(píng)分：0～1分(陰性，以0表示)，2～4分(弱陽性，以+表示)，6～8分(中度陽性，以++表示)，9～12分(強(qiáng)陽性，以+++表示)。

三、細(xì)胞系培養(yǎng)及病毒感染

實(shí)驗(yàn)所用5637細(xì)胞系購自ATCC公司(美國)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2；培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。含PRKG1序列和對(duì)照組的腺病毒載體的構(gòu)建由上海吉瑪公司完成 ，采用熒光法測定病毒滴度。PRKG1過表達(dá)組滴度為1×109TU/ml，對(duì)照組滴度為0.9×109TU/ml。將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)到25%～50%時(shí)，將腺病毒載體加入10 μl DMEM培養(yǎng)液，混勻后加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)8～12 h后更換培養(yǎng)液。2～3 d后收集細(xì)胞，檢測PRKG1表達(dá)。

四、RT-qPCR檢測

收集病毒感染后的細(xì)胞，使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取細(xì)胞總RNA。取2 μg總RNA，使用Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA(反應(yīng)條件：42 ℃，15 min；85 ℃，5 s)，稀釋10倍后保存于-80 ℃條件下。以上述cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑完成RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；然后95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析PRKG1表達(dá)水平。PRKG1上游引物：5′-GAGGGCTGGATGATGT-TTCTA-3′；下游引物：5′-GATGTGCTCCTGCTGTCTTGT-3′。GAPDH上游引物：5′- TGACTT-CAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′- CACCC-TGTTGCTGTAGCCAAA -3′。

五、流式細(xì)胞術(shù)檢測

將感染后的細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，24 h后收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。 然后使用PBS將細(xì)胞重懸，加入5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI溶液，將細(xì)胞在室溫下于細(xì)胞懸液中孵育30 min，然后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

六、MTT檢測細(xì)胞活性

將感染后的細(xì)胞接種到96孔板中，48 h后向各孔加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄去各孔培養(yǎng)液，向各孔內(nèi)加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min。采用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測各孔吸光度(OD)值并做記錄。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分布差異采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、膀胱癌組織中PRKG1的表達(dá)水平

為了確定PRKG1 mRNA和蛋白在膀胱癌和配對(duì)的癌旁正常組織中的表達(dá)水平，本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了膀胱癌PRKG1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，包括298例膀胱癌和19例癌旁正常組織，其中配對(duì)組織中有效的為18對(duì)膀胱癌組織和癌旁正常組織。結(jié)果表明，癌組織中PRKG1 mRNA的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(圖1A)。在18對(duì)配對(duì)組織中，14例癌組織中PRKG1 mRNA的表達(dá)低于癌旁正常組織(圖1B)。石蠟標(biāo)本免疫組化染色可以觀察到類似的結(jié)果，與癌旁正常組織相比，癌組織中PRKG1染色分值較低(圖1C)。在配對(duì)組織中，14例癌組織中的PRKG1蛋白表達(dá)低于癌旁正常組織(圖1D)。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌和癌旁正常組織PRKG1 mRNA表達(dá)；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中18對(duì)膀胱癌及癌旁正常組織PRKG1 mRNA表達(dá)；C：標(biāo)本庫中膀胱癌和癌旁正常組織免疫組化染色PRKG1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D：標(biāo)本庫中膀胱癌及配對(duì)癌旁正常組織PRKG1表達(dá)結(jié)果圖1 PRKG1在膀胱癌組織中的表達(dá)

二、PRKG1表達(dá)與膀胱癌患者臨床特征的相關(guān)性分析

免疫組化結(jié)果顯示，所有癌組織標(biāo)本中共有91例標(biāo)本可檢測到PRKG1蛋白表達(dá)(85.05%)。其中，患有高級(jí)別、較高T分期、肌層浸潤性膀胱癌患者的PRKG1蛋白表達(dá)水平較低(表1)。

表1 PRKG1蛋白表達(dá)水平和標(biāo)本庫患者臨床特征相關(guān)性分析(例)

三、PRKG1調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡

膀胱癌細(xì)胞(5637)過表達(dá)PRKG1后，采用RT-qPCR檢測PRKG1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示PRKG1過表達(dá)組表達(dá)量為對(duì)照組的(328.99±44.81)倍(P<0.001，圖2A)。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)PRKG1后，膀胱癌細(xì)胞增殖明顯抑制[PRKG1過表達(dá)組OD值(0.75±0.15)，對(duì)照組OD值(0.93±0.12)，圖2B]；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)PRKG1后，細(xì)胞凋亡比例明顯增加[PRKG1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率(8.60±0.12)%，對(duì)照組細(xì)胞凋亡(3.85±0.53)%，圖2C]，表明在膀胱癌細(xì)胞中過表達(dá)PRKG1可抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

A：PRKG1過表達(dá)組細(xì)胞PRKG1表達(dá)明顯升高；B：MTT結(jié)果表明PRKG1過表達(dá)組細(xì)胞增殖受到抑制；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明PRKG1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組圖2 PRKG1對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

討 論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，PRKG1在正常平滑肌細(xì)胞中表達(dá)較高，而在多種腫瘤中表達(dá)水平較低[6]。Hou等[6]的研究結(jié)果表明，在肝癌、胰腺癌、睪丸腫瘤、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中PRKG1表達(dá)均有下降。進(jìn)一步的PRKG1在腫瘤中的功能研究表明其對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用[7-8]。結(jié)腸癌中的相關(guān)研究結(jié)果顯示，PRKG1可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制為PRKG1的過表達(dá)可通過MEKK1/SEK1通路激活JNK1，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。在乳腺癌細(xì)胞中，PRKG1可以通過抑制致癌性Wnt/β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)PRKG1在膀胱癌組織中的表達(dá)較正常膀胱組織下降，且臨床標(biāo)本中的檢測結(jié)果顯示低表達(dá)PRKG1患者的腫瘤分期、分級(jí)均較高，表明PRKG1表達(dá)下降和膀胱癌進(jìn)展密切相關(guān)。

膀胱癌的免疫治療和靶向治療是近年來的研究熱點(diǎn)，主要機(jī)制涉及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、改變細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、代謝等[9-11]。Su等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中環(huán)狀RNA circELP3表達(dá)明顯升高，且高circELP3表達(dá)和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧條件可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生circELP3，而敲低circELP3表達(dá)可抑制裸鼠體內(nèi)膀胱癌細(xì)胞移植瘤的生長。另有研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP在膀胱癌組織中表達(dá)下降，且低DAB2IP表達(dá)和較高的腫瘤分期、復(fù)發(fā)具有相關(guān)性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示下調(diào)DAB2IP可能通過激活ERK通路和細(xì)胞EMT發(fā)揮促癌作用[13]。本研究結(jié)果表明過表達(dá)PRKG1具有抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，提示PRKG1可能是膀胱癌生物治療潛在的靶點(diǎn)之一，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。后續(xù)將開展動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討PRKG1作為膀胱癌生物治療靶點(diǎn)的可行性，并分析其具體作用機(jī)制。

目前臨床工作中應(yīng)用的膀胱癌生物標(biāo)志物較少，且特異性不高。本研究發(fā)現(xiàn)，PRKG1蛋白的表達(dá)與腫瘤級(jí)別和肌層浸潤明顯相關(guān)，具有一定臨床意義，但本研究的病例數(shù)較少，且為回顧性研究。后續(xù)將開展前瞻性研究，擴(kuò)大樣本量，納入腫瘤分期、分級(jí)等因素進(jìn)行多因素分析，進(jìn)一步探索PRKG1的臨床意義，分析其用于膀胱癌預(yù)后判斷和病情監(jiān)測的臨床價(jià)值。

總之，PRKG1在膀胱癌組織中表達(dá)下降，與膀胱癌臨床分期、分級(jí)相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明PRKG1可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡。但PRKG1在膀胱癌中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。