基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析Holliday交叉識(shí)別蛋白在膀胱癌中的表達(dá)以及與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系

劉宏偉 朱奕 李世豪 柳建軍 許志堅(jiān)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示有573 278例膀胱癌初診病例和212 536例膀胱癌死亡病例[1]。多數(shù)膀胱癌是由于癌基因的激活或抑癌基因的失活導(dǎo)致的，因此有必要探尋潛在的差異表達(dá)基因，對(duì)進(jìn)一步探討膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制具有重要的意義。

Holliday交叉識(shí)別蛋白(holliday junction recognition protein, HJURP)基因位于2號(hào)染色體，通過(guò)與著絲粒蛋白A結(jié)合調(diào)控染色體的穩(wěn)定性[2]。有研究顯示沉默HJURP表達(dá)可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]，但HJURP基因在大樣本膀胱癌標(biāo)本中的表達(dá)及其與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系尚不明確。本文擬通過(guò)Oncomine、基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)、Kaplan-Meier以及腫瘤免疫評(píng)估資源(tumor immune estimation resource, TIMER)數(shù)據(jù)庫(kù)分析HJURP基因在不同膀胱癌標(biāo)本中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與預(yù)后及腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、數(shù)據(jù)提取

登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/main.html)，設(shè)定篩選條件：①基因：HJURP；②分析類型：癌組織與正常組織分析；③癌癥類型：膀胱癌；④設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)：P值<1E-4，差異倍數(shù)>2倍，基因排名位于前10%。

登錄GEPIA網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)，搜索HJURP，分析其在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的差異表達(dá)情況，結(jié)果以柱狀圖形式展現(xiàn)。設(shè)置截?cái)嘀禐橹形粩?shù)，分析HJURP與膀胱癌患者總生存率以及無(wú)病生存期的關(guān)系。

登錄https://kmplot.com/analysis/，分析HJURP與膀胱癌患者總生存率以及無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系，設(shè)置截?cái)嘀禐椤白詣?dòng)選擇最佳截?cái)嘀怠保浑S訪閾值設(shè)定為“全部”。

登錄TIMER網(wǎng)站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，分析HJURP表達(dá)量與膀胱癌組織中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)浸潤(rùn)水平的相關(guān)性，并探討這些細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用t檢驗(yàn)分析HJURP在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)差異。采用Pearson相關(guān)性分析膀胱癌組織中HJURP表達(dá)量與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。通過(guò)Kapan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)推斷HJURP表達(dá)與膀胱癌患者總生存率、無(wú)病生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存率以及膀胱癌組織中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與膀胱癌患者累積存活率的關(guān)系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HJURP在膀胱癌中的總體表達(dá)情況

通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，共檢索到383個(gè)有關(guān)HJURP基因在不同類型癌組織與正常組織差異表達(dá)的分析結(jié)果(圖1A)，其中有2項(xiàng)研究涉及HJURP基因在膀胱癌組織和正常組織中的表達(dá)，分別為L(zhǎng)ee等[4]和Sanchez-Carbayo 等的研究[5]。在所有差異表達(dá)基因中，HJURP基因的中位數(shù)排名43，P=1.21E-19(圖1B)，說(shuō)明與正常膀胱組織相比，HJURP在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯升高。

二、HJURP在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的差異表達(dá)情況

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析Lee等[4]的基因芯片數(shù)據(jù)提示HJURP mRNA在62例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著高于68例正常膀胱組織，在所有高表達(dá)基因中位列前1%，差異倍數(shù)為2.483，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A，t=7.989，P=6.49E-13)。Sanchez-Carbayo等[5]的基因芯片數(shù)據(jù)顯示HJURP mRNA在28例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)明顯高于48例正常膀胱組織，差異倍數(shù)為5.646，在所有高表達(dá)基因中位列前8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B，t=8.582，P=5.21E-12)；HJURP mRNA在81例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著高于48例正常膀胱組織，差異倍數(shù)為5.582，在所有高表達(dá)基因中位列前1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C，t=11.055，P=1.21E-19)。進(jìn)一步通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)HJURP在膀胱癌組織中的表達(dá)水平亦顯著高于正常膀胱組織(圖2D)。

A：HJURP在不同癌組織與正常組織中的差異表達(dá)，紅色代表升高，藍(lán)色代表降低；B：HJURP在膀胱癌研究中的匯總表達(dá)情況圖1 HJURP在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌的表達(dá)

A：HJURP mRNA在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌與正常膀胱組織中的差異表達(dá)(Lee等的基因芯片數(shù)據(jù))；B：HJURP mRNA在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌與正常膀胱組織中的差異表達(dá)(Sanchez-Carbayo等的基因芯片數(shù)據(jù))；C：HJURP mRNA在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌與正常膀胱組織中的差異表達(dá)(Sanchez-Carbayo等的基因芯片數(shù)據(jù))；D：HJURP在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的差異表達(dá)(GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù))圖2 HJURP在不同研究中膀胱癌組織與正常膀胱組織中的差異表達(dá)情況

三、HJURP表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

我們通過(guò)GEPIA和Kaplan-Meier分析HJURP表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示HJURP高表達(dá)組患者的總生存率高于低表達(dá)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、B，P>0.05)。HJURP高表達(dá)組患者的無(wú)病生存期明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C，P=0.03)。HJURP高表達(dá)組患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于低表達(dá)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3D，P=0.44)。以上結(jié)果表明HJURP高表達(dá)可能與膀胱癌患者的無(wú)病生存期縮短有關(guān)，而與總生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率無(wú)明顯相關(guān)性。

A：HJURP表達(dá)與膀胱癌患者總生存率的關(guān)系(GEPIA)(TPM:每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本)；B：HJURP表達(dá)與膀胱癌患者總生存率的關(guān)系(Kaplan-Meier)；C：HJURP表達(dá)與膀胱癌患者無(wú)病生存期的關(guān)系(Kaplan-Meier)；D：HJURP表達(dá)與膀胱癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系(Kaplan-Meier)圖3 HJURP與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

四、HJURP表達(dá)與膀胱癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

我們進(jìn)一步通過(guò)TIMER網(wǎng)站分析膀胱癌中HJURP表達(dá)量與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示HJURP表達(dá)量與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與腫瘤純度、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)水平無(wú)明顯相關(guān)性(圖4A)。進(jìn)一步分析這些腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，Kaplan-Meier曲線顯示高表達(dá)CD8+T細(xì)胞組患者的累積生存率明顯低于低表達(dá)組(P=0.006)，而其它腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與膀胱癌患者的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性(圖4B)。

A：膀胱癌中HJURP表達(dá)量與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性；B：腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系圖4 HJURP與膀胱癌浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系

討 論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)深入分析了HJURP在大樣本膀胱癌組織中的表達(dá)情況，有效避免因樣本量差異及研究方法等導(dǎo)致的結(jié)論偏差。Oncomine 4.5是目前腫瘤研究領(lǐng)域比較成熟的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)以及整合數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，我們首先通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HJURP在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示Lee等和Sanchez-Carbayo等的基因芯片數(shù)據(jù)提示HJURP在膀胱癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常膀胱組織。我們進(jìn)一步通過(guò)GEPIA再次證實(shí)HJURP基因在膀胱癌組織中高表達(dá)，表明HJURP可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

近年來(lái)研究表明HJURP在人類多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用[6-10]，例如HJURP通過(guò)調(diào)控MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[6]，通過(guò)上調(diào)SPHK1的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。此外，HJURP高表達(dá)與前列腺癌無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率降低有關(guān)[8]，與結(jié)直腸癌、胰腺癌患者的總生存率下降相關(guān)[9-10]。目前HJURP在膀胱癌中的研究較少，有一項(xiàng)研究提示沉默HJURP表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及活性氧產(chǎn)生，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[3]。

既然HJURP在膀胱癌組織中高表達(dá)，那么HJURP表達(dá)是否與患者的預(yù)后相關(guān)尚不清楚，我們進(jìn)一步通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，生存分析提示HJURP高表達(dá)組患者的無(wú)病生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于低表達(dá)組，但HJURP高表達(dá)組的總生存率反而高于低表達(dá)組(P>0.05)，我們認(rèn)為患者的預(yù)后與多種因素有關(guān)，很難憑單一基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估患者的預(yù)后。HJURP表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系有待通過(guò)大數(shù)據(jù)臨床樣本驗(yàn)證。

免疫治療是近年來(lái)腫瘤領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，但HJURP是否與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)尚不清楚。TIMER是一款非常強(qiáng)大的腫瘤免疫浸潤(rùn)在線分析平臺(tái)，不僅可以預(yù)測(cè)不同腫瘤樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，而且可以分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤樣本的表達(dá)譜，將基因表達(dá)量與腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，操作方便實(shí)用。該網(wǎng)站主要提供了B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等6種腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，本研究表明HJURP表達(dá)量與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，說(shuō)明HJURP可能參與了膀胱癌的免疫調(diào)控。

綜上所述，本研究通過(guò)Oncomine和GEPIA在線分析平臺(tái)深入分析了HJURP基因在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的差異表達(dá)情況，證實(shí)HJURP在膀胱癌組織中顯著上調(diào)，進(jìn)一步通過(guò)TIMER網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)HJURP表達(dá)量與多種腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平有關(guān)。但由于本研究只是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HJURP mRNA的表達(dá)水平，存在一定的局限性，本課題組擬在后續(xù)研究中對(duì)HJURP蛋白水平進(jìn)行分析，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確HJURP的促癌作用并探討其作用機(jī)制。