復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-27a表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制

周立花,胡 英,鄒 暉

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院生殖科，海南 ?？?570311）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent miscarriage， RM）是妊娠早期的常見并發(fā)癥，在世界范圍內(nèi)，RM影響1%～5%的育齡期女性，且隨著年齡的增加，RM的發(fā)病率明顯升高，研究［1-2］顯示：在45歲及以上女性群體中RM發(fā)病率高達(dá)74.7%。眾所周知，生殖道解剖、遺傳、激素水平的異常、環(huán)境污染、心理創(chuàng)傷、吸煙和飲酒等因素均被認(rèn)為能直接導(dǎo)致RM的發(fā)生。然而，臨床仍有約50%患者的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚［2-4］。妊娠是一個(gè)受到精細(xì)而復(fù)雜調(diào)控的生理過(guò)程，既往有學(xué)者［5］提出：滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡失衡可能是RM的主要病理機(jī)制。其中，微小RNAs（microRNAs， miRNAs）作為一類廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程的非編碼小分子RNA，在胎盤的形成及妊娠的維持中發(fā)揮重要作用［5-6］。miR-27a是miRNAs家族中的重要成員，多項(xiàng)病例對(duì)照研究［7-11］表明：miR-27a在RM患者絨毛組織中的表達(dá)異常升高，且其多態(tài)性與RM發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)有密切關(guān)聯(lián)，提示miR-27a可能參與RM的發(fā)病過(guò)程。然而，關(guān)于miR-27a在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡失衡中的作用尚不明確。為了研究miR-27a在RM中的作用及其相關(guān)機(jī)制，本課題組通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)改變滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)，并通過(guò)生物信息學(xué)鑒定其下游靶基因，以明確在RM中miR-27a是否通過(guò)靶向調(diào)控周期蛋白D1（Cyclin D1）和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）來(lái)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，為miR-27a在RM發(fā)病機(jī)制中作用的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2019年5月—2020年10月在本院輔助生殖門診進(jìn)行流產(chǎn)絨毛組織送檢的17例RM患者作為RM組，平均年齡（28.51±3.67）歲，月經(jīng)周期（30.83±2.09）d。另選同時(shí)期于本院婦產(chǎn)科門診自愿選擇終止妊娠的早孕妊娠婦女17例作為健康對(duì)照組，平均年齡（29.13±4.21）歲，月經(jīng)周期（31.52±3.24）d。2組受試者年齡和月經(jīng)周期比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。RM組納入標(biāo)準(zhǔn)：①連續(xù)2次或2次以上自然流產(chǎn)的婦女；②夫妻染色體核型及流產(chǎn)后絨毛組織取樣正常；③生殖道解剖無(wú)異常；④性激素和甲狀腺功能等內(nèi)分泌功能正常；⑤自身抗體如抗心磷脂抗體、抗核抗體和弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒等檢測(cè)均為陰性；⑥無(wú)生殖道炎癥或全身炎癥反應(yīng)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)自然流產(chǎn)史；②染色體組核型正常。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，并取得所有受試者或家屬的書面知情同意書。收集2組受試者的絨毛組織，無(wú)菌生理鹽水充分洗滌后，取部分組織固定于4%多聚甲醛溶液后石蠟包埋以備后續(xù)病理組織學(xué)檢查，剩余部分于液氮中凍存。

1.2 細(xì)胞系、主要試劑和儀器 人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco公司），100 U·mL—1青霉素/鏈霉素溶液（美國(guó)Invitrogen公司），miR-27a模擬物（miR-27a mimic）、miR-27a抑 制 劑 （miR-27a inhibitor）和miR-27a陰性對(duì)照（miR-NC）序列均是由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）， 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷 （5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）試劑盒和攜帶Cyclin D1-野生型 （WT）/突變型 （MUT） 及 IGF1-WT/MUT的Pmir-REPORTTM熒光素酶載體質(zhì)粒（廣州銳博生物技術(shù)股份有限公司），熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海漢恒生物科技有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒和PI/RNase細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），DAB顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），兔抗Cyclin D1和IGF1多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗GADPH單克隆抗體（美國(guó)Millipore公司），山羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司），RT-qPCR引物由上海生工合成。FACSC Calibar流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo公司），PCR儀和iQ5型RT-qPCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 使用含10%FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HTR-8/SVneo細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取約1×105個(gè)細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)使用Lipofectamin2000和 Opti-MEM 試劑將miR-27a mimic、miR-27a inhibitor和miR-NC分別轉(zhuǎn)染入HTR-8/SVneo細(xì)胞中，終濃度為100 nmol·L－1，并置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。按轉(zhuǎn)染物的不同將細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染）、miR-27a mimic組、miR-27a inhibitor組和miR-NC組。

1.4 RT-qPCR法檢測(cè)2組受試者絨毛組織和各組細(xì)胞中miR-27a、Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol試劑提取受試者絨毛組織或細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量與濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將上述RNA轉(zhuǎn)化為cDNA樣品，參考SYBR green RT-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)上述樣品進(jìn)行mRNA含量檢測(cè)。RT-PCR引物見表1，以U6作為miR-27a的內(nèi)參，以GAPDH作為 Cyclin D1和 IGF1的內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.5 CCK-8法和EdU法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 CCK-8法：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HTR-8/SVneo細(xì)胞，常規(guī)消化后按每孔5×104個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，按“1.3”中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組，在轉(zhuǎn)染12、24、36和48 h時(shí)分別加入10 μL CCK-8試劑，37℃下繼續(xù)孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的吸光度（A）值，并以A值代表細(xì)胞的增殖活性。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。EdU法：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HTR-8/SVneo細(xì)胞按每孔1×105個(gè)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按“1.3”中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組，培養(yǎng)48 h后根據(jù)EdU試劑盒方法每孔加入100 μ L終濃度為20 μmol·L－1的 EdU 試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 4 h，洗滌細(xì)胞后，使用3.7%的多聚甲醛在室溫下固定20 min，0.5%的Triton X-100室溫下透化細(xì)胞20 min，再次洗滌后，加入Click-It反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min后，使用Hoechst33342進(jìn)行染核15 min，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞，其中EdU陽(yáng)性染色為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率 取轉(zhuǎn)染后的各組HTR-8/SVneo細(xì)胞，消化后使用預(yù)冷的75%酒精在－20℃下固定過(guò)夜，離心去除上清液后，PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL終濃度為10 g·L－1的RNase A溶液在37℃的水浴鍋中孵育30 min，隨后加入10 μL終濃度為1 g·L－1的PI溶液，4℃下避光孵育30 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染24 h后的各組HTR-8/SVneo細(xì)胞，常規(guī)消化后，使用200 μL Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液重懸約1×106個(gè)細(xì)胞，加入5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI試劑，充分混勻后，避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 熒光素酶靶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.targetscan.org） 預(yù)測(cè)miR-27a與Cyclin D1和IGF1的3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR） 結(jié)合位點(diǎn)。將構(gòu)建的Cyclin D1和IGF1的3′-UTR野生型質(zhì)粒（Cyclin D1-WT和IGF1-WT）和突變型質(zhì)粒（Cyclin D1-MUT和IGF1-MUT） 在Lipofectamin 2000的作用下轉(zhuǎn)染入HTR-8/SVneo細(xì)胞。同時(shí)，再將轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒后的細(xì)胞分別與miR-27a mimic和miR-NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。48 h后收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞，裂解后采用熒光素酶檢測(cè)試劑盒在光度計(jì)下檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.9 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)2組受試者絨毛組織中Cyclin D1和IGF1蛋白表達(dá)水平 取上述包埋于石蠟中的絨毛組織，制備厚度為3 μm的切片，二甲苯與梯度酒精常規(guī)脫蠟水化，使用pH值為9.0的Tris/EDTA溶液在沸水中進(jìn)行提取抗原修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液洗滌后，5%山羊血清進(jìn)行抗體封閉，隨后加入稀釋后的一抗 Cyclin D1（1∶500） 和 IGF1（1∶300），4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液再次洗滌后加入稀釋后的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶800），DAB試劑進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，最后再次使用二甲苯和梯度酒精水化，顯微鏡下觀察，采用Image J軟件分析，以累積吸光度值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.10 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Cyclin D1和IGF1蛋白表達(dá)水平 采用苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 和 RIPA裂解液對(duì)轉(zhuǎn)染后的各組HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行裂解以提取細(xì)胞中總蛋白，參照說(shuō)明書中的方法使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取約40 μg的蛋白樣品在12%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%的牛血清白蛋白進(jìn)行抗體封 閉， 隨 后 加 入 Cyclin D1（1∶800）、IGF1（1∶800）和GAPDH（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，最后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組絨毛組織和細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平，細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡率和不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，各組組織和細(xì)胞中Cyclin D1和IGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson’s相關(guān)分析法分析miR-27a與Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組受試者絨毛組織中miR-27a表達(dá)水平 與健康對(duì)照組（1.00±0.00）比較，RM組患者絨毛組織中miR-27a表達(dá)水平（8.94±3.17）明顯升高（P＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平 與對(duì)照組（1.00±0.00） 比較，miR-27a mimic組細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平（6.29±1.17）明顯升高（P＜0.01），miR-27a inhibitor組細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平（0.24±0.06）明顯降低（P＜0.01），miR-NC組細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平（0.89±0.03）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組細(xì)胞增殖活性和EdU陽(yáng)性細(xì)胞率 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染24、36和48 h時(shí)，與對(duì)照組比較，miR-27a mimic組細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），miR-27a inhibitor組細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），miR-NC組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EdU法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，miR-27a mimic組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（P＜0.05），miR-27a inhibitor組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高（P＜0.05），miR-NC組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 CCK-8法和EdU法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性和EdU陽(yáng)性細(xì)胞率Fig.1 Proliferation activities and EdU positive cell rates of trophoblasts in various groups detected by CCK-8 assay and EdU method

2.4 各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率 與對(duì)照組比較，miR-27a mimic組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05），S期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05）；miR-27a inhibitor組 G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05），S期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）；miR-NC組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率Fig.2Percentages of cells at different cell cycle in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組（12.48%±4.16%）比較，miR-27a mimic組細(xì)胞凋亡率（29.17%±5.03%） 明 顯 升 高 （P＜0.05），miR-27a inhibitor組細(xì)胞凋亡率（3.36%±1.10%）明顯降低 （P＜0.05），miR-NC組細(xì)胞凋亡率（13.11%±3.84%） 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見圖 3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.6 熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)miR-27a靶向基因miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan結(jié)果顯示：miR-27a與 Cyclin D1和 IGF-1的 3′-UTR均具有潛在結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步采用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-27a與兩者的靶向調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-27a mimic組細(xì)胞中Cyclin D1-WT和IGF1-WT的3′-UTR熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05），Cyclin D1-MUT和IGF1-MUT的3′-UTR熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見圖 4。RT-qPCR法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-27a mimic組細(xì)胞中Cyclin D1和IGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），miR-27a inhibitor組細(xì)胞中Cyclin D1和IGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖5和6。

圖4 miR-27a與Cyclin D1和IGF1的靶向關(guān)系Fig.4 Target relationship between miR-27 and Cyclin D1 and IGF1

圖5 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Cyclin D1(A)和IGF1(B)mRNA表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of Cyclin D1(A)and IGF1(B)in cells in various groups detected by RT-qPCR method

圖6 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Cyclin D1和IGF1蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.6 Electrophoregram(A)and histogram(B,C)of expressions of Cyclin D1 and IGF1 proteins in various groups detected by Western blotting method

2.7 2組受試者絨毛組織中Cyclin D1和IGF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平及Pearson’s相關(guān)分析結(jié)果RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組比較，RM組患者絨毛組織中Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。見圖7。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：Cyclin D1主要在滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而IGF1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。與健康對(duì)照組（1 415.24±377.69和873.51±164.31）比較，RM組患者絨毛組織中Cyclin D1和IGF1蛋白表達(dá)水平（462.10±93.12和173.48±68.19） 明顯降低 （P＜0.05）。見圖 8。Pearson’s相關(guān)分析結(jié)果表明：RM組患者絨毛組織中miR-27a表達(dá)水平與Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－0.214，P＜0.05；r=－0.307，P＜0.05）。見圖9。

圖7 RT-qPCR法檢測(cè)2組受試者絨毛組織中Cyclin D1(A)和IGF1(B)mRNA表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of Cyclin D1(A)and IGF1(B)mRNA in villi tissue of subjects in two groups detected by RT-qPCR method

圖8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)2組受試者絨毛組織中Cyclin D1（A,B）和IGF1（C,D）蛋白表達(dá)情況(×200)Fig.8 Expressions of Cyclin D1（A,B）and IGF1（C,D）proteins in villi tissue of subjects in two groups detected by immunohistochemical staining(×200)

圖9 RM組患者絨毛組織中miR-27a表達(dá)水平與Cyclin D1（A）和IGF1（B）mRNA表達(dá)水平的Pearson’s相關(guān)分析Fig.9 Pearson’s correlation analysis on correlations between expression level of miR-27a and expression levels of Cyclin D1（A）and IGF1（B）mRNA in villus tissue of patients in RM group

3 討 論

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)［12-14］表明：滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力受損和過(guò)度凋亡不僅破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，還加重并導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能損傷，提示滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與凋亡的紊亂是RM發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵事件。深入探討滋養(yǎng)細(xì)胞的基本特性及調(diào)控其增殖和凋亡的相關(guān)因素對(duì)闡明RM的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

miRNAs是一類保守的、由20～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，近年來(lái)由于其在疾病發(fā)展中的重要作用而受到廣泛關(guān)注［6］。同時(shí)，由于miRNAs能夠與一個(gè)或多個(gè)靶基因的序列進(jìn)行特異性結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用，使其在難治性和復(fù)發(fā)性疾病中具有極大的研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用潛力［15］。在病理性妊娠（子癇前期、妊娠期糖尿病和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥）中miRNAs的作用被廣泛研究，但關(guān)于其與RM的關(guān)系尚不清楚［16］。

在既往的研究中，RM患者絨毛組織中miR-27a的表達(dá)水平明顯高于正常孕婦，且miR-27a基因多態(tài)性與罹患RM的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，提示其可能是識(shí)別 RM 風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物［10-11，17］。DING 等［18］發(fā)現(xiàn)：在RM患者絨毛組織中miR-27a明顯上調(diào)，并能夠通過(guò)靶向抑制泛素特異性蛋白酶25的表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，從而參與RM的發(fā)生。在腫瘤領(lǐng)域中，miR-27a不僅能夠參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲，還能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)影響其增殖和凋亡。ZHENG等［19］研究表明：具有抑癌作用的miR-27a能通過(guò)靶向調(diào)控周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)來(lái)抑制膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展和增殖，而該作用能被具有“miRNA海綿”功能的circNR3C1所抵消。miR-27a是否能夠調(diào)控與腫瘤細(xì)胞具有一定相似性的滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和凋亡尚不清楚。本研究首先采用RT-qPCR法驗(yàn)證了miR-27a在RM絨毛組織中的高表達(dá)，繼而通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-27進(jìn)行過(guò)表達(dá)或沉默，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-27a mimic能明顯抑制細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，并促進(jìn)其凋亡；利用miR-27a inhibitor沉默其表達(dá)可明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與周期的進(jìn)展，抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明：miR-27a能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的分布，影響細(xì)胞的增殖和凋亡。本課題組采用生物信息學(xué)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：miR-27a與Cyclin D1和IGF1 mRNA的3′-UTR均具有潛在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果均表明miR-27a能夠靶向抑制Cyclin D1和IGF1的表達(dá)。本研究結(jié)果與miR-27a在其他疾病中的調(diào)控機(jī)制的研究類似。研究［19］表明：miR-27a能夠通過(guò)靶向抑制Cyclin D1的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。在多囊卵巢和牙周韌帶干細(xì)胞研究［20-21］中顯示：miR-27a能通過(guò)調(diào)控IGF1的表達(dá)影響細(xì)胞增殖和凋亡。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外均有研究［22-24］報(bào)道：在RM患者絨毛組織中Cyclin D1和IGF1的表達(dá)均出現(xiàn)異常降低現(xiàn)象，提示miR-27a與兩者存在潛在的調(diào)控關(guān)系。本研究分析了RM患者絨毛組織中miR-27a表達(dá)水平與Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果表明：miR-27a與Cyclin D1和IGF1 mRNA表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)雙方在滋養(yǎng)細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，在RM患者絨毛組織中表達(dá)異常升高的miR-27a可能通過(guò)靶向調(diào)控Cyclin D1和IGF1的表達(dá)，阻滯滋養(yǎng)細(xì)胞的周期進(jìn)展，抑制其增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，miR-27a與其靶基因Cyclin D1和IGF1之間的相互作用有望作為RM的預(yù)后指標(biāo)或潛在治療靶點(diǎn)。