CC趨化因子配體20在肝細(xì)胞癌組織中的表達及其在肝細(xì)胞肝癌預(yù)后評估中作用的生物信息學(xué)分析

胡連濤,鄧文俊,鹿士振,孫 躒,李學(xué)斌,黎楚豪,王欣然,張春斌,李 玥,王偉群

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省微生物-免疫調(diào)解網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院免疫科，黑龍江 佳木斯 154007；4.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)教研室/翻譯醫(yī)學(xué)檢測與應(yīng)用技術(shù)協(xié)作創(chuàng)新中心，福建 漳州 363000）

原發(fā)性肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第三大原因，主要分為肝細(xì)胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、膽管細(xì)胞 癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和LIHC-ICC混合型3種，其中LIHC約占所有肝癌病例的90%［1］。LIHC早期無明顯的特異性狀，因此有超過50%的患者在確診時已達到中晚期，受術(shù)后復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，LIHC患者的總體預(yù)后并不理想［2-4］。因此尋找可靠的LIHC生物標(biāo)志物及治療靶點對LIHC患者的臨床診斷和治療具有重要意義。

CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）20被稱為肝活化調(diào)控趨化因子或巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α，是腫瘤微環(huán)境中的一種重要分子［5］。在肝臟和腸道上皮等人體的多個器官和組織中均發(fā)現(xiàn)有 CCL20的表達［6］。研究［6-7］表明：LIHC 患者血清中CCL20的表達水平明顯高于正常人，且LIHC癌組織中CCL20的表達水平也遠(yuǎn)高于癌旁組織和正常組織。GUO等［8］發(fā)現(xiàn)：CCL20表達上調(diào)與腫瘤生長速度、分化程度及腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性。但CCL20表達對LIHC癌患者預(yù)后的影響卻少有報道，其對LIHC患者的臨床診療價值及意義尚未完全闡明。本研究基于生物信息學(xué)方法探討LIHC患者癌組織中CCL20 mRNA的表達，并闡明CCL20 mRNA表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系，初步探討在LIHC中CCL20可能影響的通路及其在遺傳和表觀遺傳學(xué)上的修飾改變，為其在LIHC中的功能和作用機制的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 生物信息數(shù)據(jù) 利用R（4.02）軟件中的“TCGAbiolinks”程序包從癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫［9］（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository） 中下載LIHC組織和癌旁組織的mRNA-seq原始數(shù)據(jù)，從UCSC Xena平臺獲取匹配的臨床數(shù)據(jù)進行整合，最終可獲得369例LIHC和50例癌旁組織樣本。利用“edgeR”程序包對原始計數(shù)數(shù)據(jù)進行規(guī)范化。

1.2 LIHC組織和癌旁組織中CCL20 mRNA的差異表達 采用“l(fā)imma”包和“beeswarm”程序包統(tǒng)計分析整合數(shù)據(jù)中LIHC組織和癌旁組織中CCL20 mRNA的差異表達，并繪制CCL20 mRNA表達蜂群圖；同時通過GEPIA平臺利用GTEx和TCGA聯(lián)合數(shù)據(jù)對上述CCL20 mRNA差異表達結(jié)果進行驗證［10］。

1.3 CCL20 mRNA表達水平與LIHC預(yù)后評估 采用R軟件讀取LIHC患者CCL20 mRNA表達水平和臨床資料數(shù)據(jù)，將樣本中CCL20 mRNA表達水平的中位數(shù)作為分界點，以此將LIHC患者分為高表達組和低表達組，比較分析2組LIHC患者的生存情況。同時，對CCL20 mRNA表達水平、患者年齡、TNM分期和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平等多個臨床因素與總生存期進行單因素和多因素 Cox 回歸分析［11-12］。

1.4 CCL20 mRNA表達水平與LIHC患者臨床診斷的關(guān)系 因AFP水平是臨床診斷LIHC的常用指標(biāo)，故本研究首先檢驗LIHC患者癌組織中CCL20 mRNA表達水平與AFP水平的相關(guān)性；然后利用“ROCR”程序包［13］繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）面積，判斷CCL20 mRNA表達水平在LIHC診斷中的價值；繪制諾謨圖和患者1、3和5年存活校正曲線，以此明確CCL20 mRNA表達水平與患者生存期之間的關(guān)系［14］。

1.5 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）［15］對 LIHC 數(shù)據(jù)進行整理并開展GSEA分析，分析CCL20 mRNA表達水平與LIHC惡性進程相關(guān)信號通路的關(guān)系，并計算P值和假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）。當(dāng)P值和FDR均小于0.05時，表示基因集富集顯著。

1.6 CCL20 mRNA表達水平與LIHC遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的關(guān)系 利用“cgdsr”包［16］獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中CCL20 DNA拷貝數(shù)突變和DNA甲基化數(shù)據(jù)，并分析兩者與CCL20 mRNA表達水平之間的相關(guān)性，從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)角度分析和明確CCL20基因表達變化的機制。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Rstudio（4.03）軟件進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖。TCGA-LIHC中CCL20 mRNA表達水平不符合正態(tài)分布，組間比較采用Wilcoxon檢驗；2組患者總生存期（overall survival，OS） 比較采用Kaplan-Meier生存分析（Log-rank檢驗）；影響肝癌患者預(yù)后的危險因素分析采用單因素和多因素Cox回歸分析。不同DNA拷貝數(shù)突變組樣本中CCL20 mRNA表達水平比較采用單因素方差分析；CCL20 mRNA表達水平與DNA甲基化水平的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，0.1≤|cor|≤1表示有相關(guān)性［17］。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIHC組織中CCL20 mRNA表達水平 與癌旁組織比較，LIHC組織中CCL20 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）。進一步利用GEPIA平臺聯(lián)合GTEx數(shù)據(jù)庫分析，LIHC組織中CCL20 mRNA表達水平亦高于癌旁組織（P＜0.01）見圖1。

圖1 LIHC組織和癌旁組織中CCL20 mRNA表達水平Fig.1 Expression levels of CCL20 mRNA in LIHC tissue and para-cancer tissue

2.2 CCL20 mRNA表達水平與LIHC患者預(yù)后的關(guān)系 應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中CCL20 mRNA高表達組和低表達組患者OS率進行分析，CCL20 mRNA高表達患者的OS率明顯低于CCL20 mRNA低表達組（HR=1.789，P＜0.01），表明CCL20 mRNA表達上調(diào)是LIHC患者預(yù)后的危險因素（圖2）。對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集進行單因素和多因素Cox回歸分析，除TNM分期，CCL20 mRNA表達水平也可作為LIHC患者的獨立預(yù)后因素（表1）。

表1 LIHC患者預(yù)后危險因素Tab.1 Risk factors of prognosis in patients with LIHC

圖2 CCL20 mRNA高表達組和低表達組LIHC患者OS曲線Fig.2 OS curves of LIHC patients in CCL20mRNA high expression group and low expressiongroup

2.3 CCL20 mRNA表達水平在LIHC患者臨床診斷中的價值 TCGA-LIHC數(shù)據(jù)分析顯示：LIHC患者CCL20 mRNA表達水平與AFP水平有明顯相關(guān)性（P＜0.01）（圖3A）。通過ROC曲線計算得出 AUC=0.69（P＜0.01），說明 CCL20 mRNA表達水平在LIHC患者臨床診斷評估中具有一定的參考價值（圖3B）。通過對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的處理構(gòu)建了諾謨圖，校正曲線也表明CCL20 mRNA表達水平對預(yù)測LIHC患者1、3和5年OS率具有較高的準(zhǔn)確性（圖3C和D）。

圖3 CCL20 mRNA表達水平與LIHC患者臨床診斷的關(guān)系Fig.3 Relationship between CCL20 mRNA expression and clinical diagnosis of LIHC patients

2.4 CCL20高表達富集通路 為了明確CCL20在LIHC中的功能，對CCL20基因進行GSEA分析，結(jié)果表明：CCL20主要富集在細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用和核糖體功能實施等過程（圖 4A～C）。相關(guān)信號通路分析結(jié)果顯示：CCL20主要參與趨化因子、NOD樣受體（NOD like receptor，NLR）、過氧化物酶體增殖物激活受體 （peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR） 和 Toll樣受體 （Toll-like receptor，TLR）等腫瘤相關(guān)信號通路（圖4D～G）。

圖4 GSEA分析圖Fig.4 GSEA analysis chart

2.5 CCL20基因DNA拷貝數(shù)突變和甲基化水平 為明確CCL20 mRNA表達變化的原因，本研究從遺傳和表觀遺傳學(xué)的視角檢測CCL20 mRNA表達水平與CCL20 DNA拷貝數(shù)突變和甲基化水平的關(guān)系，結(jié)果顯示：與正常二倍體組比較，拷貝數(shù)丟失組和拷貝數(shù)擴增組樣本中CCL20 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；拷貝數(shù)擴增組樣本中CCL20 mRNA表達水平明顯高于拷貝數(shù)丟失組（P＜0.05），且隨著CCL20 DNA拷貝數(shù)的增加，CCL20 mRNA表達水平呈整體升高趨勢。隨著CCL20 DNA甲基化水平的升高，CCL20 mRNA表達水平逐漸降低（cor=－0.11，P＜0.01）。見圖 5。

圖5 CCL20 mRNA表達水平與CCL20 DNA拷貝數(shù)突變和DNA甲基化的相關(guān)性分析Fig.5 Analysis on correlation between expression level of CCL20 mRNA and DNA copy-number alterations and methylation

3 討 論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對CCL20/趨化因子受體6（chemokine receptor 6， CCR6）軸在LIHC發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機制進行了大量研究。研究［18-19］顯示：在丙型肝炎病毒感染的LIHC患者中，CCL20不僅可通過增強肝炎病毒的復(fù)制能力，誘導(dǎo)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-細(xì) 胞 外 調(diào) 節(jié) 蛋 白 激 酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 通路活化，進一步促進血管生成，還能通過作用于CCR6促進門靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長而加速血管生成。ANNUNZIATO等［20］研究發(fā)現(xiàn)：CCL20/CCR6/輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17， Th17）軸也有促進血管生成的作用。CCL20參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移進程，研究［21-22］證實：在多種腫瘤患者中均可檢測到CCL20表達上調(diào)，且由于CCL20在腫瘤患者的肝臟和腸道組織中表達水平較高，因此其與肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和胰腺癌的肝轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。研究［23］顯示：CCL20可通過結(jié)合CCR6受體激活下游ERK1/2、應(yīng)激活化蛋白激酶（stressactivated protein kinase，SAPK） 和蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）信號通路，進而促進結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移。有報道［24-27］證實：CCL20對乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的遷移及增殖具有明顯的促進作用，且可發(fā)揮免疫抑制活性。CAMPBELL等［28］研究發(fā)現(xiàn)：LIHC患者癌旁組織中有大量FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs） 浸潤，且 CCL2、CCL4、CCL5、CCL6和CCL7等均在Tregs中表達，但僅CCL20蛋白表達水平既高于癌旁組織又高于正常組織［29］。在抑制CCL20的表達后，CD4+CD25+Tregs數(shù)量明顯減少。此外，F(xiàn)UJII等［30］研究發(fā)現(xiàn)：CCL20能夠明顯促進HuH7、HepG2、SMMC-7721和Hep3B等肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。

CCL20可通過多種途徑促進LIHC的發(fā)展和演進，但其在LIHC發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍未完全明確。本研究利用生物信息學(xué)分析了CCL20在LIHC中的表達，并初步評估和探討了其在LIHC患者預(yù)后評估中的作用和診斷價值。本研究結(jié)果顯示：LIHC組織中CCL20 mRNA表達水平明顯升高，且高表達的CCL20 mRNA與LIHC患者的預(yù)后不良有關(guān)聯(lián)；單因素和多因素Cox生存分析表明：CCL20表達可作為LIHC患者的獨立預(yù)后因素，且Pearson相關(guān)分析顯示LIHC患者CCL20 mRNA表達水平與AFP水平有密切關(guān)聯(lián)；同時通過TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集進行的ROC和預(yù)測分析表明：CCL20 mRNA表達水平具有一定的臨床診斷準(zhǔn)確性，且可有效預(yù)測LIHC患者生存率。另外，本研究中GSEA分析顯示：CCL20主要通過趨化因子、NLR、PPAR和TLR等腫瘤相關(guān)信號通路參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用和核糖體功能實施等過程；遺傳和表觀遺傳分析顯示：CCL20 mRNA表達水平與CCL20 DNA拷貝數(shù)突變呈正相關(guān)關(guān)系，與CCL20 DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本研究主要采用生物信息學(xué)分析方法分析了CCL20 mRNA在LIHC患者癌組織中的表達，結(jié)果表明：CCL20可作為LIHC患者的臨床預(yù)后評估和預(yù)測患者生存率的重要指標(biāo)之一，CCL20可通過趨化因子等腫瘤相關(guān)信號通路參與LIHC細(xì)胞的惡性行為。本研究結(jié)果為CCL20作用機制的研究提供了新的依據(jù)。但是，由于上述研究成果均來源于大數(shù)據(jù)分析，因此具有一定的局限性?；诖?，今后需要從臨床樣本和基礎(chǔ)實驗方面進一步驗證和闡述CCL20在LIHC組織中的表達、作用和相關(guān)分子機制，以期補充和完善有關(guān)CCL20的系統(tǒng)研究。