IL-17A在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)VEGF表達(dá)的調(diào)控作用

何程遠(yuǎn),楊紅宇,譚鈺晶,蘇 杭,李泓澍,歷 春

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林省吉林市化工醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132001；3.北華大學(xué)理學(xué)院 吉林省中藥生物技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013）

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC） 占 80%～85%［1］。研究［2-3］表明：慢性炎癥與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，炎性細(xì)胞因子的異常分泌已成為NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要因素。白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）作為促炎性細(xì)胞因子，是輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，不僅參與機(jī)體感染、過敏和自身免疫性疾病，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用［4-5］。最新研究［6-10］顯示：IL-17A在胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，可通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成等多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular en-dothelial growth factor，VEGF）是腫瘤血管生成重要的調(diào)節(jié)因子，以VEGF介導(dǎo)的血管生成為靶點(diǎn)已成為目前治療腫瘤的重要策略之一［11-12］，但腫瘤細(xì)胞中IL-17A對(duì)VEGF的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。

本研究通過檢測(cè)IL-17A在NSCLC組織中的表達(dá)，分析其陽性表達(dá)率與NSCLC患者臨床病理參數(shù)和微血管密度（microvessel density，MVD）的相關(guān)性，同時(shí)采用核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor-κB， NF-κB） 抑 制 劑 BAY11-7082阻斷A549肺癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，觀察IL-17A對(duì)NF-κB和VEGF的調(diào)控作用以及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的影響，以期為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月—2013年12月吉林省吉林市化工醫(yī)院病理科存檔的NSCLC患者術(shù)后石蠟包埋標(biāo)本55例。患者年齡39～78歲，平均年齡（60.5±9.4）歲。年齡≥60歲28例，年齡＜60歲27例；男性35例，女性20例；腫瘤直徑≤3 cm 24例，＞3 cm 31例；組織學(xué)分型：鱗狀細(xì)胞癌35例，腺癌20例；組織病理學(xué)分級(jí)：高-中分化32例，低分化23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例；TNM分期采用國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC） 的國際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)（2009年第7版），Ⅰ期27例，Ⅱ+Ⅲ期28例。所有NSCLC患者術(shù)前均未行放療和化療，均為原發(fā)病灶，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)明確診斷。另取15例肺部良性病變的正常肺組織作為對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人肺腺癌細(xì)胞株A549由北華大學(xué)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，HUVECs購自深圳市華拓生物科技有限公司，IL-17A抗體購自美國Novus公司，CD31抗體購自美國Santa公司，通用型PV9000及DAB試劑盒均購自北京中杉金橋試劑公司，DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，外源性重組人IL-17A（recombinant human IL-17A，rhIL-17A）、MTT試劑盒、BAY11-7082、BCA試劑盒、IL-17受體A（interleukin-17 receptor A，IL-17RA）抗體、P65抗體、磷酸化P65（phosphorylated P65，p-P65）抗體、VEGF抗體和GAPDH抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Western blotting電泳設(shè)備購自美國Bio-Rad公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將A549細(xì)胞和HUVECs分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37℃、5%CO2和相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。A549細(xì)胞分為對(duì)照組（A549）、rhIL-17A組（100 mg·L－1rhIL-17A）、BAY11-7082組（10 mmol·L－1BAY11-7082）和聯(lián)合組（100 mg·L－1rhIL-17A+10 mmol·L－1BAY11-7082），作用 48 h后，分別收集各組細(xì)胞和上清液。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟標(biāo)本重新制備為4 μm厚度的切片，經(jīng)烘烤、脫蠟、脫水后置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中高壓抗原修復(fù)，參照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，PBS緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照。采用雙盲法進(jìn)行評(píng)估，以腫瘤細(xì)胞質(zhì)顯示棕黃色顆粒為陽性染色。IL-17A染色結(jié)果判定，染色強(qiáng)度：無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；陽性面積：陽性面積＜5%計(jì)0分，5%≤陽性面積≤25%計(jì)1分，25%＜陽性面積≤50%計(jì)2分，50%＜陽性面積≤75%計(jì)3分，陽性面積＞75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度與陽性面積相乘得到最終評(píng)分：0～2為陰性，3～5為弱陽性，6～8為中陽性，9～12為強(qiáng)陽性。最后評(píng)分＞2視為陽性［13］。以CD31染色結(jié)果表示MVD，在每個(gè)高倍視野（×200）中血管最多的區(qū)域計(jì)數(shù)陽性染色的血管數(shù)量，以5個(gè)區(qū)域的平均值作為每例患者的MVD；選擇55例NSCLC標(biāo)本的平均MVD值作為分界值，大于或小于平均MVD值為MVD高表達(dá)或低表達(dá)［14］。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組A549細(xì)胞中IL-17A、IL-17RA、p-P65和 VEGF蛋白表達(dá)水平 胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，PBS緩沖液充分洗滌后，置于含RIPA裂解液和抗磷酸化降解的蛋白裂解液中冰上孵育30 min，4℃、15 000 r·min－1離心15 min后收集上清液。采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg，10%SDS-PAGE電泳1 h，濕轉(zhuǎn)法將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入IL-17A、IL-17RA、p-P65、P65和VEGF抗體（濃度均為1∶1 000）4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌PVDF膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，ECL發(fā)光并拍照，以GAPDH作為內(nèi)參。IL-17A、IL-17RA和VEGF蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值，p-P65蛋白表達(dá)水平=p-P65蛋白條帶灰度值/P65蛋白條帶灰度值。

1.6 MTT比色法檢測(cè)各組HUVECs增殖活性 將HUVECs密度調(diào)整為1×104個(gè)/孔，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液200 μL。培養(yǎng)48 h后每孔中加入 MTT 溶液 20 μL （5 g·L－1） 放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清。每孔中加入DMSO 150 μL，震蕩使結(jié)晶溶解并混勻。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A）值，取平均A值表示各組細(xì)胞增殖活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。NSCLC組織和正常肺組織中IL-17A陽性表達(dá)率和不同臨床病理參數(shù)NSCLC患者癌組織中IL-17A陽性表達(dá)率組間比較采用χ2檢驗(yàn)；IL-17A表達(dá)與MVD的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平和增殖活性均符合正態(tài)分布且方差齊性，以±s表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織和正常肺組織中IL-17A陽性表達(dá)率 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：NSCLC組織中IL-17A主要定位于肺癌細(xì)胞的胞質(zhì)，IL-17A陽性表達(dá)率為60.0%，正常肺組織中IL-17A陽性表達(dá)率為33.3%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A和B。

2.2 不同臨床病理參數(shù)NSCLC患者癌組織中IL-17A陽性表達(dá)率 與高-中分化組比較，低分化組NSCLC患者癌組織中IL-17A陽性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05）（圖1C和D）。IL-17A陽性表達(dá)率與NSCLC患者年齡、性別和腫瘤大小等無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)NSCLC患者癌組織中IL-17A陽性表達(dá)率Tab. 1 Positive expression rates of IL-17A in cancer tissue of NSCLC patients with different clinicopathological features[n（η/%）］

圖1 NSCLC組織和正常肺組織中IL-17A的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué),×400)Fig.1Expressions of IL-17A in NSCLC tissue and normal lung tissue（Immunohistochemistry,×400)

2.3 NSCLC組織中IL-17A表達(dá)與MVD的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析顯示：IL-17A表達(dá)與MVD呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.329，P＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 NSCLC組織中IL-17A（A）和CD31（B）的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，×400)Fig.2 Expressions of IL-17A (A)and CD31(B)in NSCLC tissue（Immunohistochemistry,×400)

表2 NSCLC組織中IL-17A表達(dá)與MVD的相關(guān)性Tab. 2 Relationship between expression of IL-17A and MVD in NSCLC tissue

2.4 2組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，rhIL-17A組細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖3和表3。

圖3 Western blotting法檢測(cè)2組A549細(xì)胞中IL-17RA、VEGF和p-P65蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of IL-17RA,p-P65 and VEGF proteins in A549 cells in two groups detected by Western blotting method

表3 2組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平Tab. 3Expression levels of IL-17RA, p- P65 and VEGF proteins in A549 cells in two groups (n=3，±s）

表3 2組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平Tab. 3Expression levels of IL-17RA, p- P65 and VEGF proteins in A549 cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group.

Group Control rhIL-17A VEGF 0.23±0.04 0.37±0.03*IL-17RA 0.36±0.07 0.66±0.06*p-P65 0.54±0.06 0.76±0.07*

2.5 各組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，rhIL-17A組細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），BAY11-7082組 細(xì) 胞 中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；與rhIL-17A組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見圖4和表4。

表4 各組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of IL-17RA, p- P65 and VEGF proteins in A549 cells in various groups (n=3，±s）

表4 各組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of IL-17RA, p- P65 and VEGF proteins in A549 cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05 compared with rhIL-17A group.

VEGF 0.26±0.03 0.37±0.04*0.15±0.01**0.24±0.02△30.345＜0.01 Control rhIL-17A BAY11-7082 Combination FP 0.77±0.08 0.99±0.06*0.12±0.02**0.45±0.08△63.61＜0.01 1.25±0.08 1.53±0.08*0.52±0.07**1.01±0.07△59.09＜0.01 Group IL-17RA p-P65

圖4 Western blotting法檢測(cè)各組A549細(xì)胞中IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophregram of expressions of IL-17RA,p-P65 and VEGF proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

2.6 加入A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液后各組HUVECs增殖活性 與對(duì)照組比較，rhIL-17A組HUVECs增殖活性明顯升高（P＜0.05），BAY11-7082組HUVECs增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與rhIL-17A組比較，聯(lián)合組HUVECs增殖活性明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 加入A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液后各組HUVECs增殖活性Tab. 5Proliferation activities of HUVECs in various groups after treated with A549 cell culture supernatant (n=3，±s）

表5 加入A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液后各組HUVECs增殖活性Tab. 5Proliferation activities of HUVECs in various groups after treated with A549 cell culture supernatant (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with rhIL-17A group.

Proliferation activity 0.887±0.035 0.974±0.036*0.750±0.100*0.851±0.057△Control rhIL-17A BAY11-7082 Combination Group

3 討 論

研究［15］表明：腫瘤微環(huán)境中存在大量的炎癥細(xì)胞因子，其與腫瘤細(xì)胞之間相互作用，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其中，IL-17A作為Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，可通過結(jié)合其受體IL-17RA活化下游信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［16-17］。XU等［18］研究發(fā)現(xiàn)：將過表達(dá)IL-17A的重組腺病毒作用K-ras基因突變的肺癌模型小鼠3周后，小鼠體內(nèi)肺腫瘤數(shù)量明顯增多，表明IL-17A可促進(jìn)肺癌的生長(zhǎng)。目前，IL-17A在腫瘤細(xì)胞中的作用及相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究中，IL-17A在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常肺組織，進(jìn)一步證實(shí)了IL-17A與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)；此外，IL-17A在低分化組NSCLC患者癌組織中高表達(dá)，表明其在NSCLC中發(fā)揮促瘤作用，高表達(dá)IL-17A的肺癌細(xì)胞其惡性程度可能更高，進(jìn)展更快。有研究［9，19］表明：肺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中IL-17A的高表達(dá)與CD31標(biāo)記的腫瘤MVD的升高有密切關(guān)聯(lián)。因此，本研究檢測(cè)了NSCLC組織中IL-17A與CD31標(biāo)記的MVD之間的相關(guān)性，分析結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，提示IL-17A可能在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。

VEGF是腫瘤血管生成過程中最關(guān)鍵的促血管生成因子。研究［9，20-21］顯示：IL-17A可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）信號(hào)通路調(diào)控白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素8（interleukin-8， IL-8）和VEGF的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，可通過STAT3信號(hào)通路和CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）-CXC趨化因子受體2（CXC chemokine receptor 2，CXCR2）途徑調(diào)控VEGF的表達(dá)。NF-κB是聯(lián)系炎癥與腫瘤的關(guān)鍵信號(hào)分子，激活后可通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［22］。研究［23］顯示：NF-κB 信號(hào)通路活化后，可通過上調(diào)P65蛋白的磷酸化水平促進(jìn)VEGF的表達(dá)?；谝陨涎芯勘尘埃疚淖髡咄茰y(cè)，肺癌微環(huán)境中IL-17A可能參與NF-κB信號(hào)通路對(duì)VEGF的表達(dá)調(diào)控。因此，本研究首先檢測(cè)了IL-17A作用肺癌細(xì)胞后IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：IL-17A可明顯上調(diào)IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白表達(dá)水平，表明IL-17A與肺癌細(xì)胞IL-17RA的結(jié)合可激活NF-κB信號(hào)通路和促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-17A調(diào)控VEGF蛋白的表達(dá)是通過NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用，采用BAY11-7082作為NF-κB通路抑制劑阻斷NF-κB信號(hào)通路，檢測(cè)IL-17A和BAY11-7082單獨(dú)或聯(lián)合作用肺癌細(xì)胞后IL-17RA、p-P65和VEGF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：阻斷NF-κB信號(hào)通路可明顯抑制IL-17RA和VEGF的表達(dá)，IL-17A誘導(dǎo)的IL-17RA和VEGF上調(diào)作用在NF-κB通路阻斷后明顯下調(diào)，表明NF-κB信號(hào)通路參與IL-17A對(duì)VEGF的表達(dá)調(diào)控。

研究［24-26］表明：VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的促有絲分裂作用，可通過活化內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究將IL-17A和BAY11-7082單獨(dú)或聯(lián)合處理的肺癌細(xì)胞上清液作用于HUVECs，檢測(cè)HUVECs的增殖情況，結(jié)果顯示：IL-17A作用的肺癌細(xì)胞上清液可明顯促進(jìn)HUVECs增殖，但與BAY11-7082聯(lián)合作用的肺癌細(xì)胞上清液可明顯抑制HUVECs的增殖，表明IL-17A促進(jìn)HUVECs增殖的機(jī)制之一是通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)VEGF的分泌實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，IL-17A在低分化NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，其可通過與IL-17RA結(jié)合活化NF-κB通路調(diào)控VEGF的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)HUVECs的增殖。