甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征和BRAF V600E基因突變對其頸部淋巴結轉移的影響

姬 巍,董 健,昌 紅,杜雪梅,彭 洪,謝 洪,趙愛民,閆 巍,白 娟,彭振興,尹金淑

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院耳鼻喉科，北京 100038；2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院放射科，北京 100038；3.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院病理科，北京 100038；4.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院結直腸外科，北京 100038；5.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院肝膽外科，北京 100038）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺最常見的惡性腫瘤，約占所有甲狀腺癌的80%～90%［1-3］。PTC惡性程度相對較低，5年生存率可達90%以上，但少部分侵襲性PTC惡性程度高，容易發(fā)生淋巴結及遠處轉移［3-6］，如何準確診斷頸部淋巴結是否轉移，在PTC患者的分期中具有重要意義［2-3］。BRAF V600E是PTC的原癌基因，約40%～50%的PTC患者可出現(xiàn)該基因的突變［7-9］，BRAF V600E基因突變與頸部淋巴結轉移是否具有關聯(lián)性仍有爭議［4，8-10］。本研究通過回顧性分析321例PTC患者資料，總結其臨床特征、原發(fā)灶和頸部轉移淋巴結的病理特點，同時結合BRAF V600E基因是否突變，以期明確PTC患者頸部淋巴結轉移的危險因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月—2020年12月因甲狀腺惡性占位在本院行手術治療的患者，納入標準：①行甲狀腺腫瘤切除并行頸部淋巴結清掃的初次手術，最終病理結果證實為PTC的患者；②術后行BRAF V600E基因檢測者。排除標準：①其他任何病理類型的甲狀腺占位者；②術前行任何其他PTC占位治療者，包括手術和碘131放射治療等；③PTC伴其他部位轉移而未行手術治療者；④并發(fā)其他甲狀腺疾病者，如結節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進和橋本氏甲狀腺炎等患者。

1.2 數(shù)據(jù)收集 收集入組患者的臨床、病理和基因檢測資料，包括患者年齡，性別，腫瘤部位、大小和病灶數(shù)量，淋巴結轉移的數(shù)量和分區(qū)，BRAF V600E基因檢測結果。PTC手術所得樣本和淋巴結均進行病理學檢查，對腫瘤組織樣本進行常規(guī)制片，應用羅氏HE600染色機及配套染液進行HE滴染后，采用蔡司AX10顯微鏡光鏡進行觀察，放大倍數(shù)為100和200倍。PTC原發(fā)灶的評價指標：原發(fā)灶的位置和最大徑，是否有包膜侵犯，是否有瘤周纖維包裹，是否檢出砂粒體，是否有周圍脈管和神經(jīng)受累。按照原發(fā)灶數(shù)量和位置分為3組：單個原發(fā)灶且位于甲狀腺單側葉，多個原發(fā)灶位于甲狀腺單側葉，多個原發(fā)灶且位于甲狀腺雙側葉。PTC轉移淋巴結的評價指標：轉移淋巴結的位置、分區(qū)和數(shù)目，與原發(fā)灶是否位于同側。當患者甲狀腺雙側葉均有PTC原發(fā)灶，而只有一側淋巴結轉移時，定義為原發(fā)灶與轉移的淋巴結位于同側，進而對PTC原發(fā)灶和轉移淋巴結進行關聯(lián)性分析。

1.3 BRAF V600E基因檢測 采用實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測腫瘤組織中BRAF V600E基因突變。對比HE染色在顯微鏡下標記腫瘤區(qū)域，切片過程中僅選取相關腫瘤區(qū)域，避免選擇出血和鈣化的區(qū)域。切取厚度為5 μm蠟膜5張于潔凈的EP管中，嚴格做到每一個病例應用一個新的切片，并采用乙醇進行相關器具的消毒處理。應用艾德FFPE DNA提取試劑對石蠟組織樣本進行DNA提取。提取后應用紫外分光光度計測量DNA質量和濃度。按照測量的DNA濃度稀釋至5 μg·L－1備用。應用ADx-ARMS-B-RAF檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司），按照試劑盒說明和實驗室標 準 操 作 規(guī) 程 （standard operating procedure，SOP）應用SLAN96全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)對樣本進行BRAF V600E突變基因檢測。反應體系為50 μL，于PCR第3階段60℃時采集FAM及HEX信號。根據(jù)樣本CT值判讀結果。若樣本FAM信號擴增曲線呈S型且CT值≤30，則該樣本為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料（包括患者年齡和腫瘤最大徑）以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料（包括患者性別、被膜侵犯、淋巴細胞漿細胞浸潤、瘤周纖維包裹和BRAF V 600E基因類型構成等）組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。對于淋巴結轉移的相關因素分析，首先篩選出與之相關的因素，進而采用向前逐步回歸法進行多因素Logistic回歸分析，最終結果采用比值比（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）進行描述。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 本研究共收集PTC患者321例，其中男性96例，女性225例，年齡13～73歲，平均年齡（42.3±12.1）歲，PTC最大徑范圍0.1～6.0 cm，平均（1.15±0.91）cm。本組PTC患者中，原發(fā)灶位于甲狀腺一側245例，其中單側單原發(fā)灶者204例，單側多原發(fā)灶者41例，雙側均可見原發(fā)灶者76例。病理學檢測結果：有包膜侵犯者137例，檢出砂粒體者21例，淋巴漿細胞浸潤者77例，原發(fā)灶周圍可見纖維包裹者114例，脈管侵犯者13例，神經(jīng)侵犯者8例。BRAF V600E基因突變者279例（86.9%）。見表1。

2.2 頸部淋巴結轉移陽性組和陰性組PTC患者的臨床和病理特征及BRAF V600E基因檢測結果 根據(jù)是否發(fā)生頸部淋巴結轉移，PTC患者分為頸部淋巴結轉移陽性組和陰性組，頸部淋巴結轉移陽性組和陰性組PTC患者性別、單側葉內(nèi)原發(fā)灶數(shù)量、被膜侵犯、淋巴細胞漿細胞浸潤、瘤周纖維包裹、神經(jīng)侵犯和BRAF V600E基因類型比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而患者發(fā)病年齡、腫瘤最大徑、甲狀腺雙側葉多原發(fā)灶、檢出砂粒體和脈管受侵方面比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 PTC患者臨床病理特征和基因檢測結果Tab. 1 Clinico pathological characteristics and gene detection results in PTC patients [n（η/%）］

2.3 不同數(shù)量和位置原發(fā)灶PTC患者的頸部淋巴結轉移特點 PTC患者按照原發(fā)灶數(shù)量和位置分為3組，包括單個原發(fā)灶位于甲狀腺單側葉者70例，多個原發(fā)灶位于甲狀腺單側葉者19例，多個原發(fā)灶位于雙側葉者40例，各組患者轉移淋巴結數(shù)量、位置和頸部轉移淋巴結分區(qū)結果見表2。各組患者淋巴結轉移數(shù)量和分區(qū)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），淋巴結轉移位置比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 不同數(shù)量和位置原發(fā)灶PTC患者頸部淋巴結轉移特點Tab. 2 Charateristics of cervical lymph node metastasis in PTC patients with different number and locations of primary tumor［n（η/%）］

2.4 PTC患者頸部淋巴結轉移的多因素Logistic回歸分析 采用多因素Logistic回歸分析，以是否發(fā)生頸部淋巴結轉移作為因變量，以PTC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、病灶數(shù)、檢出砂粒體和脈管受侵情況為自變量，通過向前逐步法構建Logistic回歸模型。賦值參照既往文獻［11-12］制定。見表3。

表3 PTC患者各變量定義和賦值Tab. 3Definition and assignment of different variables in PTC patients

多因素Logistic回歸分析結果顯示：PTC患者年齡與PTC發(fā)生頸部淋巴結轉移呈負相關關系（β=－0.316，P=0.001），即隨著年齡增長，發(fā)生淋巴結轉移的風險降低。而腫瘤最大徑（β=0.586，P＜0.01）、 原 發(fā) 灶 數(shù) 量 （β=0.666，P=0.005）、檢出砂粒體 （β=0.947，P=0.042）和脈管受侵（β=2.181，P=0.005）與PTC患者頸部淋巴結轉移呈正相關關系，即腫瘤最大徑、原發(fā)灶數(shù)量、病灶中檢出砂粒體和脈管受侵是PTC發(fā)生淋巴結轉移的影響因素。見表4。

表4 PTC患者頸部淋巴結轉移的影響因素分析Tab. 4 Analysis on influencing factors of cervical lymph node metastasis in PTC patients

3 討 論

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌腫瘤，其發(fā)病率在原發(fā)惡性腫瘤中位于第6位，PTC是其中最常見的病理組織類型，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%［2-3，13］。PTC是一種分化良好的甲狀腺癌，治療方式包括外科手術治療、促甲狀腺激素抑制治療和放射性碘治療［2-3］。PTC治療方式的選擇主要基于臨床危險度分級，其預后則受患者年齡、性別、淋巴結轉移和BRAF V600E基因突變等因素影響［1，6，14］。研究［1，6］表明：對于年齡小于 45歲的PTC患者，如果有頸部淋巴結轉移，其預后往往不佳，建議選擇更積極的治療方式。近年來，隨著PTC發(fā)生率不斷升高，侵襲性PTC逐漸為人們所認知，部分研究者［7，9，15-16］認為：侵襲性 PTC 與BRAF V600E基因突變有關，然而其臨床和病理特點的關聯(lián)性至今仍存在爭議。本研究結果表明：PTC頸部淋巴結轉移主要影響因素包括患者年齡、腫瘤最大徑、原發(fā)灶數(shù)量、病灶中檢出砂粒體和脈管受侵犯。

本研究中，40.2%的PTC患者發(fā)生淋巴結轉移，年齡小于40歲的患者占頸部淋巴結轉移者總數(shù)的57.3%，提示年齡是PTC發(fā)生頸部淋巴結轉移的相關因素之一；將PTC患者按發(fā)病年齡分層，隨著年齡的增加，頸部淋巴結轉移的百分率進行性降低，提示年輕PTC患者更易發(fā)生頸部淋巴結轉移。本研究結果與有關文獻［4-5，8，14，17］報道中，小于45歲的PTC伴頸部淋巴結轉移患者往往腫瘤惡性度高、易于復發(fā)和遠處轉移且需要采用更積極的治療方式等結果相一致，提示年齡是PTC發(fā)生頸部淋巴結轉移的保護性因素。

本研究結果表明：PTC原發(fā)灶的最大徑、數(shù)量、檢出砂粒體和脈管受侵是發(fā)生頸部淋巴結轉移的危險因素，與既往文獻［18］報道相一致。腫瘤的最大徑是重要危險因素之一，本研究將腫瘤最大徑進一步分層，結果表明：隨著腫瘤最大徑的增加，頸部淋巴結轉移率上升。此外，本研究結果顯示：脈管受侵和檢出砂粒體是頸部淋巴結轉移的危險因素，兩者均提示腫瘤的侵襲性更強，發(fā)生頸部淋巴結轉移的比例更高。但本研究中，所得組織樣本中檢出砂粒體的患者僅占6.5%，遠低于有關文獻［19］，需要進一步擴大樣本證實。

PTC原發(fā)灶的位置、數(shù)量與頸部淋巴結轉移有關聯(lián)。本研究結果表明：PTC原發(fā)灶與頸部轉移淋巴結常位于同側，但與淋巴結的具體分區(qū)，如位于頸部中央?yún)^(qū)、側頸區(qū)或兩區(qū)均有，則無明顯關聯(lián)，可能與原發(fā)灶的轉移遵循淋巴引流途徑，傾向于發(fā)生同側頸部淋巴結轉移有關。此外，是否存在頸部淋巴結轉移也與PTC原發(fā)灶數(shù)量有關，大于5個原發(fā)灶的患者發(fā)生頸部淋巴結轉移的比例明顯提高，是頸部淋巴結轉移的影響因素，與既往報道［4-5，17，20-22］一致。

本研究中86.6%的PTC患者出現(xiàn)BRAF V600E基因突變，提示PTC發(fā)生該基因突變的比例非常高，明顯高于既往文獻［4，7-8，10，15，23］報道的 40%～50%。 研 究［15，18，24-25］表 明：BRAF V600E 基 因 是PTC的主要原癌基因，可以發(fā)生在多種腫瘤中，如惡性黑色素瘤、卵巢癌和結直腸轉移癌。BRAF V600E基因突變與腫瘤的惡性程度密切關聯(lián)，如與腺體外浸潤、分期、淋巴結或遠處轉移甚至高死亡率有關［9，16，26-28］，提示本研究中納入的 PTC 樣本腫瘤惡性度高，需采用更積極的治療方式［29-31］。但本研究中BRAF V600E基因突變與頸部淋巴結轉移并無相關性，提示BRAF V600E不是PTC頸部淋巴結轉移的危險因素，需要進一步擴大樣本進行研究。

本研究具有一定的局限性：①本組患者淋巴結轉移的分區(qū)評價并未按照美國甲狀腺協(xié)會指南的頸部淋巴結7分區(qū)法，由于本研究時間跨度過長，部分早期病例中采用的是傳統(tǒng)中央?yún)^(qū)和側頸區(qū)的劃分方法所致；②本研究只針對PTC患者的臨床和病理特征與BRAF V600E基因之間的關系進行研究，并未納入TNM分期、治療方式的選擇和預后評價；③本研究僅納入PTC患者，并未納入并發(fā)其他甲狀腺疾病的患者，如橋本氏甲狀腺炎和結節(jié)性甲狀腺腫等。

綜上所述，PTC患者發(fā)生頸部淋巴結轉移的臨床和病理特征關聯(lián)因素包括腫瘤最大徑、原發(fā)灶數(shù)量、檢出砂粒體和脈管受侵犯。BRAF V600E基因突變與頸部淋巴結轉移之間無關聯(lián)性。多因素Logistic回歸分析表明：PTC患者發(fā)生頸部淋巴結轉移的影響因素包括患者年齡、腫瘤最大徑、原發(fā)灶數(shù)量、檢出砂粒體和脈管受侵。對腫瘤直徑＞1 cm、發(fā)病年齡≤40歲和多個原發(fā)灶的PTC患者，其發(fā)生頸部淋巴結轉移的風險較高，推薦采用更積極的干預措施，降低患者危險因素，改善預后。