殺白細(xì)胞毒素基因陰性金黃色葡萄球菌的基因分型、耐藥性及其生物學(xué)特征

額爾德木圖,王艷艷,呂瑩瑩,陳貴林,王俊瑞

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

金黃色葡萄球菌是一種重要的革蘭陽(yáng)性致病菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA），可引發(fā)多種社區(qū)感染和醫(yī)院獲得性感染，包括皮膚、關(guān)節(jié)、軟組織和骨感染以及心內(nèi)膜炎、敗血癥和中毒性休克等，并且病死率較高［1-5］。國(guó)外報(bào)道［6］提示：醫(yī)院獲得性MRSA（hospital acquired MRSA， HA-MRSA）和社區(qū)獲得性MRSA（community acquired MRSA，CA-MRSA）在流行范圍和生物學(xué)特性（基因分型、毒素分泌及耐藥模式等）方面存在明顯差異，尤其是殺白細(xì)胞素（panton-valentine leukocidin，pvl）基因表達(dá)情況，CA-MRSA的pvl基因表達(dá)多呈陽(yáng)性，而HA-MRSA的pvl基因表達(dá)常呈陰性。pvl基因陰性金黃色葡萄球菌特別是pvl基因陰性MRSA是導(dǎo)致住院患者發(fā)生嚴(yán)重感染的一個(gè)重要病原。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生多種毒力因子是發(fā)揮其致病力的一個(gè)重要方式，毒力因子主要包括 α-溶 血 素 （α-hemolysin， hla）、 腸 毒 素 A（enterotoxin A，sea） 和 殺 白 細(xì) 胞 毒 素 DE（leucocytic toxin DE，luk DE） 等［7-10］。上述毒力因子表達(dá)水平受多個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的影響，特別是輔助基 因 調(diào) 控 子 （adopting accessory gene regulator，agr）群體調(diào)控系統(tǒng)。agr群體調(diào)控系統(tǒng)對(duì)金黃色葡萄球菌有全局性調(diào)控作用，不同agr分型和表達(dá)缺陷菌株的耐藥性、毒力和生物膜形成能力等生物學(xué)特性均存在差異。研究［11］顯示：不同來(lái)源菌株agr-Ⅰ～Ⅳ型基因分布有明顯差異，但是對(duì)于pvl基因陰性金黃色葡萄球菌的agr分型研究甚少。本研究以住院患者分離出的pvl基因陰性金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，對(duì)其耐藥特征、基因分型、毒力基因分布和生物膜形成能力進(jìn)行分析，為臨床更好了解和防治pvl基因陰性金黃色葡萄球菌感染提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2013年9月—2021年2月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診患者臨床標(biāo)本分離的100株金黃色葡萄球菌，剔除同一患者重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，MasterMix和DNA Marker（大連TaKaRa生物工程有限公司）。培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司），VITEK-Ⅱ全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套GP鑒定卡和AST-GP67藥敏卡（法國(guó)梅里埃公司），PCR擴(kuò)增儀（北京領(lǐng)宇科技有限公司），電泳儀和Gel DocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。1.3 細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)（藥敏試驗(yàn)） 所有菌株均由VITEK-Ⅱ全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定，利用AST-GP67藥敏卡檢測(cè)菌株抗菌藥物敏感性，結(jié)果參照CLSIM100-S30文件規(guī)定判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗菌藥物敏感性判讀。

1.4 agr基因分型 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，－20℃條件下保存?zhèn)溆?。引物由北京中美泰和生物公司合成，引物序列和反?yīng)條件參照參考文獻(xiàn) ［11］，agr-Ⅰ型、agr-Ⅱ型、agr-Ⅲ型和agr-Ⅳ型擴(kuò)增片段分別為441、575、323和659 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠，120 V電泳30 min，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，檢測(cè)到相應(yīng)的目的基因長(zhǎng)度的片段為該基因型陽(yáng)性。

1.5 毒力基因檢測(cè) 提取100株金黃色葡萄球菌菌株全基因組（操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)），將提取的DNA于－20℃條件下保存?zhèn)溆?。引物由北京中美泰和生物公司合成，包括黏附因子基因、溶血素基因、腸毒素基因、殺白細(xì)胞毒素基因、表皮剝脫素基因和中毒性休克綜合征毒素基因合計(jì)32個(gè)毒力（黏附因子：fnbA、clfA、clfB、cna、sdrC、sdrD、 sdrE、 ebpS 和 edin； 腸 毒 素 ： sea、 seb、sec、 sed、 see、 seg、 seh、 sei、 sej、 sen、 seo 和sem；毒素休克綜合征毒素：tsst；表皮剝脫毒素：eta和etb；白細(xì)胞毒素：pvl、lukDE和lukM；溶血素：hla、hlb、hld、mpHLG、mpHLG2；agr分型：agr-Ⅰ、agr-Ⅱ、agr-Ⅲ和agr-Ⅳ）?；蛞镄蛄泻头磻?yīng)條件參照文獻(xiàn)［11-12］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠，120 V電泳30 min，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，以檢測(cè)到相應(yīng)目的基因長(zhǎng)度的片段為該基因攜帶陽(yáng)性，未檢測(cè)到相應(yīng)目的基因長(zhǎng)度的片段為該基因攜帶陰性。

1.6 生物膜形成能力檢測(cè) 待測(cè)菌株在含0.25%葡萄糖的TSB液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?（約1.5×108CFU·mL－1），并在含0.25%葡萄糖的TSB中稀釋至最終濃度為1×106CFU·mL－1，置于無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37℃培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌生理鹽水輕輕洗滌3次，用甲醇固定15 min。風(fēng)干后，各孔用0.1%結(jié)晶紫染色5 min，再用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次，自然風(fēng)干，隨后于33%冰乙酸中作用30 min溶解生物膜。在590 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定各培養(yǎng)孔吸光度 （A） 值，平行3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其均值。以未接種菌液的孔作為陰性對(duì)照，A值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，依據(jù)臨界Ac值（Ac是由空白孔的平均值加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差），可將生物被膜分成以下4類：A值≤Ac值為不黏附（0），Ac值＜A值≤2Ac值為弱黏附（+），2Ac值＜A值≤4Ac值為中等黏附（），A值＞4Ac值為強(qiáng)黏附（）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MSSA和MRSA耐藥率和毒力基因攜帶率以百分率（%）表示，2組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌標(biāo)本來(lái)源分布 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌標(biāo)本來(lái)源于5種臨床標(biāo)本，其中主要以痰/支氣管肺泡灌洗液最多（52.0%），其次為分泌物標(biāo)本（32.0%），呼吸道標(biāo)本中MRSA檢出最多，檢出率為80.8%。具體標(biāo)本來(lái)源分布和構(gòu)成比見(jiàn)表1。

表1 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌菌株分離標(biāo)本構(gòu)成比Tab. 1 Constituent ratios of 100 pvl gene-negative samples of Staphylococcus aureus ioslates

2.2 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌臨床科室來(lái)源分布100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌來(lái)源科室廣泛，主要來(lái)源于皮膚科、神經(jīng)外科和呼吸內(nèi)科，分別占19.0%、9.0%和9.0%，除血液科外其他科室均有MRSA檢出。金黃色葡萄球菌臨床科室來(lái)源分布見(jiàn)表2。

表2 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌菌株分離臨床科室分布構(gòu)成比Tab. 2 Constituent ratios of distribution of 100 pvl genenegative Staphylococcus aureus isolates isolated from departments

2.3 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌對(duì)13種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。金黃色葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和奎奴普丁/達(dá)福普丁全部敏感，其中MSSA菌株對(duì)大多數(shù)抗生素敏感，主要對(duì)青霉素、紅霉素和克林霉素3種抗生素耐藥，耐藥率分別為89.5%、71.1%和34.2%；MRSA對(duì)青霉素耐藥率最高，為100.0%，對(duì)其余產(chǎn)生耐藥的抗生素耐藥率均≥50.0%。除紅霉素以外，MRSA對(duì)其他產(chǎn)生耐藥抗生素的耐藥率明顯高于MSSA（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率Tab. 3 Antimicrobial resistance rates of 100 pvl gene-negative Staphylococcus aureus isolates(η/%）

2.4 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌中agr等位基因分布特征 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌agr基因陽(yáng)性率為100.0%。agr-Ⅰ～Ⅳ基因型均在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，其中agr-Ⅰ為主要基因型（79.0%），其次為agr-Ⅱ基因型（16.0%）。MSSA的agr-Ⅱ基因攜帶率明顯高于MRSA（P＜0.01），MRSA的agr-Ⅰ基因攜帶率明顯高于MSSA（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌agr基因分型Tab.4 Arg gene typing of100 pvl gene-negative Staphylococcus aureus isolates(η/%）

2.5 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌中，溶血素基因的陽(yáng)性率較高，在所有菌株中均檢測(cè)到hla和hld基因。黏附素基因fnbA、clfA、clfB、cna、sdrC和sdrE陽(yáng)性率較高，所有菌株均攜帶有至少5種黏附素基因，未檢測(cè)到edin基因。腸毒素基因seh和seo陽(yáng)性率略高，分別占72.0%和51.0%，其余腸毒素基因和表皮剝脫素基因eta、tsst、lukDE和lukM陽(yáng)性率較低，未檢測(cè)到表皮剝脫 素基因 etb和 pvl。MRSA 中 sdrE、sea、seb、seh、tsst、lukDE、lukM、hlb和mpHLG2基因的攜帶率高于MSSA，其中sea和seh基因的攜帶率明顯高于 MSSA （P＜0.05或P＜0.01），而其他18個(gè)基因攜帶率均低于MSSA，其中mpHLG1、seo、sed和sej的攜帶率明顯低于MSSA（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表5。23.7%（9/38）的MSSA同時(shí)攜帶≥15個(gè)毒力基因，明顯高于MRSA（14.5%）。本研究將攜帶≥12個(gè)基因的菌株進(jìn)行分型，分為R1～6型，其中MRSA主要以R6型為主（38.7%），R4型較少（3.2%），未檢出R1和R2型；MSSA中R1～R4基因型分布較均勻，占13.2%～18.4%，R6型較少（2.6%），未檢測(cè)出R5型。見(jiàn)表6。

表5 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌毒力基因攜帶率Tab. 5Carrying rates of virulence genes among 100 pvl gene-negative Staphylococcus aureus isolates(η/%）

表6 同時(shí)攜帶12種以上毒力基因的pvl基因陰性金黃色葡萄球菌菌株分布特征Tab. 6Distribution characteristics of multiple virulence genes (≥12)among Staphylococcus aureus isolates(η/%）

2.6 100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌生物膜形成能力 根據(jù)結(jié)晶紫染色檢測(cè)結(jié)果，100株pvl基因陰性金黃色葡葡球菌中有91株（91.0%）為產(chǎn)膜株，9株（9.0%）為非產(chǎn)膜株。MSSA和MRSA中產(chǎn)膜株分別占100.0%（38/38）和85.5%（53/62），MSSA的生物膜形成能力高于MRSA（P＜0.05）。MSSA中，強(qiáng)產(chǎn)膜菌株、中產(chǎn)膜菌株和弱產(chǎn)膜菌株分別占5.3%（2株）、26.3%（10株）和68.4%（26株）；MRSA中，未檢出強(qiáng)產(chǎn)膜菌株，中產(chǎn)膜菌株和弱產(chǎn)膜菌株分別占14.5%（9株）和71.0%（44株） 。

3 討 論

金黃色葡萄球菌是人類重要的致病菌，常見(jiàn)特點(diǎn)為多重耐藥和高致病性，由于抗生素的廣泛使用，致使在高選擇性壓力下出現(xiàn)大量耐藥菌株，尤其是 MRSA，對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)耐藥［1-2，13-15］。金黃色葡萄球菌的強(qiáng)致病力，主要由于可以產(chǎn)生多種毒素，繼而引起多種形式感染，如局部皮膚軟組織感染、心內(nèi)膜炎、胃腸炎和肺炎，嚴(yán)重的可引起血液感染和膿毒血癥等全身感染，而感染后是否能得到有效治療與其耐藥性有密切關(guān)聯(lián)［14-15］。本研究結(jié)果顯示：MRSA檢出科室分布廣泛，其中呼吸道標(biāo)本中MRSA檢出最多。MRSA作為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，已成為世界范圍內(nèi)耐藥性監(jiān)測(cè)和醫(yī)院感染預(yù)防和控制的重點(diǎn)［16］，而MSSA的耐藥情況并未引起足夠重視。國(guó)內(nèi)研究［17］顯示：MSSA除對(duì)青霉素耐藥較高外，還對(duì)紅霉素和克林霉素等存在不同程度的耐藥。本研究中，38株MSSA菌株中檢出了高比例的多重耐藥菌株（39.5%），提示MSSA的耐藥性不容樂(lè)觀，應(yīng)引起臨床高度重視。

研究［18-19］顯示：agr介導(dǎo)的群體感應(yīng)（quorm sensing system，QS）系統(tǒng)在金黃色葡萄球菌致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，正調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)，而對(duì)細(xì)胞壁表面黏附蛋白表達(dá)和對(duì)抗宿主免疫反應(yīng)呈負(fù)調(diào)控效應(yīng)。目前，根據(jù)agr系統(tǒng)AIP序列和受體多態(tài)性將金黃色葡萄球菌分為4型（agr-Ⅰ～Ⅳ）。本研究中100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌菌株，以agr-Ⅰ型分布為主，其次為agr-Ⅱ型，agr-Ⅲ和agr-Ⅳ型總陽(yáng)性率僅為5.0%；國(guó)外研究［18-20］顯示：金黃色葡萄球菌中以agr-Ⅰ和agr-Ⅲ基因陽(yáng)性率最高，與本研究結(jié)果存在一定差異，可能是由于不同地域分離株基因背景差異，從而導(dǎo)致agr基因型進(jìn)化上出現(xiàn)差異。agr-Ⅱ型基因在國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)分布特征有所不同，國(guó)外研究［21-23］顯示：MRSA株中agr-Ⅱ型基因陽(yáng)性率明顯高于其他3種agr亞型基因。本研究結(jié)果顯示：MRSA中主要以agr-Ⅰ為主，agr-Ⅱ型基因陽(yáng)性率僅為19.7%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道［24］一致，不同地區(qū)分離株agr基因多態(tài)性及其毒力調(diào)控特征需進(jìn)一步探究。

金黃色葡萄球菌中agr是全局性調(diào)節(jié)因子，涉及34個(gè)基因的正調(diào)控和104個(gè)基因的負(fù)調(diào)控［25］。本研究進(jìn)一步對(duì)agr調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的32個(gè)毒力基因在100株pvl基因陰性金黃色葡萄球菌中的分布特征進(jìn)行了分析。金黃色葡萄球菌中溶血素基因高度保守，表現(xiàn)為對(duì)對(duì)宿主細(xì)胞的破壞及多種促炎效應(yīng)［26］。本研究結(jié)果顯示：溶血素基因hla和hld基因全部表達(dá)，與國(guó)內(nèi)一些研究［27-28］結(jié)果一致。黏附素主要負(fù)責(zé)金黃色葡萄球菌與宿主細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行黏附和生物膜的形成，本研究中黏附素基因clfA、clfB和sdrC攜帶率較高，均≥97.0%，與國(guó)外報(bào)道［12］結(jié)果一致；fnbA、cna和sdrE陽(yáng)性率也較高（均≥90.0%），與國(guó)外一些相關(guān)研究［23，29］結(jié)果相近，高于國(guó)內(nèi)另外一些研究［26，30］結(jié)果。

一項(xiàng)針對(duì)金黃色葡萄球菌毒力基因分布研究［29-30］顯示：MRSA比MSSA菌株整體毒力基因攜帶率更高，MRSA攜帶的最常見(jiàn)毒力基因?yàn)閟el、sec和tsst，與本研究結(jié)果存在一定差異。本研究結(jié)果 顯 示 ： MRSA 中 sdrE、 sea、 seb、 seh、 tsst、lukDE、lukM、hlb和mpHLG2基因的攜帶率略高于MSSA，而其他毒力基因攜帶率均低于MSSA，其中23.7%MSSA同時(shí)攜帶≥15個(gè)毒力基因，明顯高于MRSA（14.5%），與國(guó)內(nèi)報(bào)道［31］結(jié)果相一致。由于本研究檢測(cè)毒力基因數(shù)量較多，對(duì)攜帶≥12個(gè)基因的菌株進(jìn)行分型，MRSA主要以R6型為主，未檢出R1和R2型；MSSA中R1～R4基因型均勻分布，R6型占比較少，未檢測(cè)出R5型，結(jié)果提示：不同地區(qū)及不同來(lái)源的金黃色葡萄球菌毒力基因在MRSA和MSSA中的分布存在差異，可能與各地流行菌株的遺傳背景差異有關(guān)。

產(chǎn)生生物膜的微生物可以高效黏附在各種介質(zhì)（黏膜和導(dǎo)管等）表面，引起慢性難治性感染［32］；此外，生物膜的獨(dú)特結(jié)構(gòu)不僅可有效阻擋抗菌藥物的滲透和作用，對(duì)臨床治療此類感染帶來(lái)了更巨大的挑戰(zhàn)［33］。本研究結(jié)果顯示：100株pvl基因陰性金色葡萄菌中產(chǎn)膜菌株占91.0%，明顯高于國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道［32-34］。本研究所選菌株中，生物膜形成相關(guān)關(guān)鍵黏附基因fnbA、clfA和clfB攜帶率均在90%以上。覃金球等［33］研究發(fā)現(xiàn)：與非產(chǎn)膜菌比較，金黃色葡萄球菌產(chǎn)膜株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率整體偏高；但本研究及國(guó)外其他研究［32］顯示：MSSA產(chǎn)膜能力和毒力基因攜帶率明顯高于MRSA，但整體耐藥率低于MRSA。因此，臨床上應(yīng)更加關(guān)注由MSSA引起的侵襲性感染，應(yīng)采取更規(guī)范的治療方案，防止因其高產(chǎn)膜特征演變?yōu)槁噪y治感染。

綜上所述，本研究所選pvl基因陰性MRSA和MSSA在耐藥性、生物膜形成能力和毒力基因攜帶方面存在明顯差異，MSSA中有較高比例多重耐藥株。此外，MSSA毒力因子攜帶率和生物膜形成能力明顯高于MRSA。對(duì)于pvl基因陰性MSSA所致侵襲性感染，臨床醫(yī)師應(yīng)給予更多關(guān)注，特別是多重耐藥MSSA。