載TGF-β3甲基丙烯?；嗡貙ρ浪韪杉毎晒欠只芰Φ挠绊懠捌錂C制

鄒馨穎,高 爽,趙 紅,劉 新,趙遠航,宋嘉卓,閆琳琳,張志民

（吉林大學口腔醫(yī)院牙體牙髓科，吉林 長春 130021）

頜面部骨缺損包括牙周缺損和廣泛的骨丟失等，可導(dǎo)致周圍結(jié)構(gòu)的破壞、畸形和功能受限［1］。頜面部骨組織缺損的傳統(tǒng)修復(fù)方式包括自體骨移植和異體骨移植等［2］，但其在恢復(fù)頜骨形態(tài)和功能重建方面均有局限性，不能阻止疾病發(fā)展也不能使缺損的組織再生［3］。目前頜面部骨缺損修復(fù)最有效的是組織工程學方法［4］。近年來隨著組織工程學的發(fā)展，種子細胞、生長因子和載體材料成為研究熱點。在未分化的狀態(tài)下，間充質(zhì)細胞增殖和分化能力極強，口腔中牙源性干細胞為種子細胞的主要來源［5］， 其 中 牙 髓 干 細 胞 （dental pulp stem cells，DPSCs）具有自我更新和多向分化為優(yōu)勢種子細胞的潛能［6］。轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor-β， TGF-β）家族是組織工程學中廣泛使用的生長因子之一，其中TGF-β3是在干細胞分化為成骨細胞過程中具有多種功能的多肽類生長因子［7］。 甲 基 丙 烯 酰 化 肝 素 （methacrylamide heparin，HepMA）為雙改建改性肝素，可通過光引發(fā)劑在紫外光照射下凝固成膠，是一種生物源性材料，具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性［8］。HepMA富含易于修飾改性的羥基和羧基，利于生長因子的釋放，近年來被廣泛用于組織工程支架材料研究［9］。TGF-β3 對 DPSCs成骨分化能力的影響目前尚不明確，且尚未有利用HepMA作為TGF-β3載體的研究。本研究旨在探討載TGF-β3的HepMA對DPSCs成骨分化能力的影響，為組織工程學在口腔頜面外科方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、雙抗和PBS緩沖液（中國?？寺」荆?，胎牛血清（美國Gibco公司），肝素、β甘油磷酸鈉、維生素C和茜素紅試劑盒（美國Sigma公司），CCK-8試劑盒（中國新賽美公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CD90、CD105、CD34、CD45抗體和TGF-β3（美國Proteintech公司），實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒和TRIeasyTM總RNA提取試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），流式細胞儀（美國BD公司），掃描電子顯微鏡（德國Semorr公司）。

1.2 人 DPSCs（human DPSCs，hDPSCs）的分離、培養(yǎng)和鑒定 本實驗經(jīng)吉林大學口腔醫(yī)院倫理委員會審批。收集于吉林大學口腔醫(yī)院頜面外科就診的18～23歲患者的第三磨牙，納入標準為牙體完整且無齲壞的第三磨牙。將新鮮的離體牙裝在含10%雙抗的PBS緩沖液中，采用酶消化法和組織塊法提取hDPSCs。超凈臺中將離體牙敲開后，取出牙髓放入裝有含10%雙抗的PBS緩沖液的1.5 mL EP管中，用鑷子夾取牙髓依次在4個含10%雙抗的PBS緩沖液的1.5 mL EP管中洗滌，用眼科剪將牙髓在EP管中剪碎，離心后加入1%膠原酶和1%胰蛋白酶覆蓋過牙髓組織塊，將EP管放置在37℃恒溫箱中30 min，待細胞融合至80%后進行傳代，取第3代細胞進行后續(xù)實驗。胰蛋白酶消化第3代hDPSCs，PBS緩沖液沖洗并重懸，在各管中加入鼠抗人CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC和CD34-FITC抗體吹打混勻，置于4℃冰箱中避光孵育15 min，PBS緩沖液清洗2次，采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達情況。

1.3 材料制備 1%肝素在PBS緩沖液中溶解，每克肝素與10倍摩爾質(zhì)量的甲基丙烯酸酐在4℃的條件下攪拌24 h，并保持反應(yīng)液的pH值為8。光引發(fā)劑為苯基-2，4，6-三甲基苯甲?；⑺徜嚕↙AP），避光條件下將0.05 g LAP加入20 mL無菌PBS緩沖液中，40℃水浴加熱溶解15 min，期間震蕩數(shù)次。所有反應(yīng)溶液用去離子水進行透析，以去除未反應(yīng)的分子，經(jīng)過無菌過濾即得到HepMA水凝膠，4℃避光保存?zhèn)溆?。HepMA水凝膠溶液在405 nm光源下照射10～30 s，制備出光固化HepMA水凝膠。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察材料表面形態(tài)表現(xiàn) 將制備好的HepMA水凝膠樣品凍干，樣品的斷面進行噴金處理，在場發(fā)射環(huán)境中掃描電子顯微鏡下觀察HepMA水凝膠斷面的超微結(jié)構(gòu)，采用Image J統(tǒng)計軟件分析HepMA水凝膠孔徑大小。

1.5 TGF-β3-HepMA制備 在超凈臺內(nèi)將TGF-β3凍干粉溶于無菌去離子水，濃度分別為20、 40、 60、 80 和 100 μg ·L－1， 將 不 同 濃 度 的TGF-β3溶液與無菌的HepMA溶液混合，于波長405 nm光源條件下，照射混合液10～30 s制備出載TGF-β3的HepMA水凝膠，即TGF-β3-HepMA。

1.6 CCK-8法檢測hDPSCs的增殖活性 采用CCK-8法篩選出載TGF-β3最適濃度。將載有不同濃度 （0、20、40、60、80 和 100 μg·L－1） TGF-β3的HepMA分別置于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入900 μL，光固化后，每孔加入3 mL單純培養(yǎng)基，置于恒溫細胞培養(yǎng)箱中24 h。收集各組液體配成含10%血清和1%雙抗的浸提液。按每孔2 000個細胞將hDPSCs鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，按照不同分組方法加入含有相應(yīng)浸提液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、3和5 d后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL不 含 血 清 的 DMEM 培 養(yǎng) 基 和 10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育3 h，采用酶標儀測定波長450 nm處吸光度（A）值，以A值代表各組細胞增殖活性，實驗重復(fù)3次。

1.7 繪制藥物釋放曲線 以HepMA為載體，將“1.6”中檢測的最適濃度TGF-β3加載于未成膠的HepMA中制備 1 mL TGF-β3-HepMA，加入到10 mL離心管中在波長405 nm光源下照射10～30 s使TGF-β3-HepMA成膠，然后向離心管中加入模擬體液3 mL，每隔一段時間（30 min、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、12 d、14 d 和 21 d） 取 100 μL 溶液，并 補加100 μL模擬體液，收集后采用ELISA試劑盒檢測各個時間點TGF-β3濃度，計算各時間點的累計藥物釋放量，并繪制體外藥物釋放曲線。

1.8 ALP染色法觀察各組細胞的ALP染色面積 按照每孔1×104個細胞將hDPSCs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后更換成骨誘導(dǎo)液，分為對照組、HepMA組和TGF-β3-HepMA組，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，更換為含有不同浸提液的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d更換1次，分別誘導(dǎo)7和14 d后，棄掉培養(yǎng)基用去離子水沖洗2次，每次5 min，沖洗后4%多聚甲醛固定30 min，棄液后用去離子水沖洗3次，在室溫避光條件下，按照說明書的步驟配制工作液進行ALP染色，反應(yīng)中止后在顯微鏡下觀察各組細胞ALP染色面積，ALP染色陽性可見細胞質(zhì)呈藍紫色，并且有藍紫色顆粒物。

1.9 茜素紅染色觀察各組細胞鈣結(jié)節(jié)形成情況 按照每孔1×104個細胞將hDPSCs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分為對照組、HepMA組和TGF-β3-HepMA組，置于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，更換為含有不同浸提液的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d更換1次，誘導(dǎo)21 d后，棄掉培養(yǎng)基，去離子水沖洗2次，多聚甲醛固定30 min棄液，去離子水沖洗3次，采用1%茜素紅染液進行鈣結(jié)節(jié)染色，觀察各組細胞礦化鈣結(jié)節(jié)染色情況及面積，礦化結(jié)節(jié)呈紅色斑點狀。

1.10 RT-qPCR法檢測各組細胞中成骨相關(guān)因子mRNA表達水平 按照每孔1×104個細胞將hDPSCs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分為對照組、HepMA組和TGF-β3-HepMA組，每3 d更換培養(yǎng)基，于第7和14天使用Trizol up裂解細胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過RT-qPCR法檢測成骨相關(guān)因子—Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、ALP、骨鈣橋素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型膠原蛋白（collagen type-Ⅰ，COL-Ⅰ）mRNA表達水平。引物序列見表1。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸30 s， 45個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達水平。

表1 RT--qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT--qPCR

1.11 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞增殖率和細胞中成骨相關(guān)因子mRNA表達水平均符合正態(tài)分布，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs的培養(yǎng)和鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的hDPSCs，牙髓組織塊周圍爬出呈長梭形的細胞（圖1），第3代hDPSCs形態(tài)良好（圖2）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：培養(yǎng)細胞中CD90和CD105抗體呈陽性表達，CD34和CD45抗體呈陰性表達，符合hDPSCs表面抗體表達特征，故提取的細胞鑒定為hDPSCs。見圖3。

圖1 原代hDPSCs形態(tài)表現(xiàn)(Bar=500 μm)Fig.1 Morphology of primary hDPSCs(Bar=500 μm)

圖2 第3代hDPSCs形態(tài)表現(xiàn)Fig.2 Morphology of third generation of hDPSCs

圖3 流式細胞術(shù)鑒定hDPSCsFig.3 Identification of hDPSCs by flow cytometry

2.2 掃描電子顯微鏡下觀察HepMA材料表面形態(tài)表現(xiàn) 光照后10 s左右HepMA水凝膠成膠，倒置后成膠的HepMA水凝膠呈半透明的膠凍狀（圖4）。光固化HepMA水凝膠凍干的掃描電子顯微鏡圖像見圖5，經(jīng)Image J軟件分析其孔徑為50～70 μm。

圖4 HepMA水凝膠Fig.4 HepMA hydrogel

圖5 SEM觀察HepMA材料表面結(jié)構(gòu)(Bar=100 μm)Fig.5 Surface structure of HepMA material observed by SEM(Bar=100 μm)

2.3 CCK-8法篩選載TGF-β3最適濃度 在細胞培養(yǎng)第1、3和5天時，培養(yǎng)基中累計釋放TGF-β3濃度為 0、20、40和 60 μg·L－1時 hDPSCs的增殖活性依次增強，與 0 μg·L－1TGF-β3-HepMA 組比較，20、40 和 60 μg·L－1TGF-β3-HepMA 組 hDPSCs增殖活性明顯升高 （P＜0.05），60 μg·L－1TGF-β3-HepMA組hDPSCs增殖活性最高；當TGF-β3濃度繼續(xù)增加至 100 μg·L－1時，hDPSCs的增殖活性逐漸降低，故篩選出載TGF-β3的最適濃度為60 μg·L－1，用于后續(xù)實驗。見圖 6。

圖6 TGF-β3-HepMA中TGF-β3的最適濃度Fig.6 Optimal concentration of TGF-β3 in TGF-β3-HepMA

2.4 藥物釋放曲線 為了驗證60 μg·L－1TGF-β3-HepMA的藥物釋放能力，收集不同時間段細胞上清采用ELISA法檢測細胞上清中TGF-β3的含量，計算 TGF-β3的累計釋放量。TGF-β3-HepMA 體外釋放曲線見圖7，在模擬體液中，藥物釋放經(jīng)歷了2個階段，分別為TGF-β3突釋階段（0～7 d）和 TGF-β3緩釋階段 （8～21 d），之后逐漸達到平衡。

圖7 TGF-β3-HepMA中TGF-β3的釋放曲線Fig.7 Release curve of TGF-β3 in TGF-β3-HepMA

2.5 成骨誘導(dǎo)后各組hDPSCs的ALP染色情況 hDPSCs成骨誘導(dǎo)分化7和14 d后，與對照組和HepMA組比較，TGF-β3-HepMA組hDPSCs中可見大量散在胞質(zhì)內(nèi)的藍紫色顆粒，ALP染色呈陽性，且細胞ALP染色面積最大，14 d時ALP染色面積較7 d時明顯增加。見圖8。

圖8 成骨誘導(dǎo)7 d(A-C)和14 d(D-F)時各組hDPSCs的 ALP染色結(jié)果（×4）Fig.8 ALP staining results of HDPSCs of in various groups at 7 d(A-C)and 14 d(D-F)after osteogenesis induction（×4）

2.6 成骨誘導(dǎo)后各組hDPSCs鈣結(jié)節(jié)形成情況 成骨誘導(dǎo)分化21 d后，各組hDPSCs經(jīng)茜素紅染色均有紅染鈣結(jié)節(jié)形成。與對照組和HepMA組比較， TGF-β3-HepMA組hDPSCs中鈣結(jié)節(jié)面積明顯增加。見圖9。

圖9 成骨誘導(dǎo)21 d后各組hDPSCs鈣結(jié)節(jié)形成情況(茜素紅)Fig.9 Calcium nodule formation of HDPSCs in various groups at 21 d after osteogenesis(Alizarin red)

2.7 各組細胞中成骨相關(guān)因子mRNA表達水平

培養(yǎng)第7和14天時，與對照組比較，HepMA組和 TGF-β3-HepMA組hDPSCs中 Runx2、ALP、OCN和COL-ⅠmRNA表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與 HepMA 組比較，TGF-β3-HepMA組 hDPSCs中 Runx2、ALP、OCN和COL-Ⅰ mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）。培養(yǎng)第14天時各組hDPSCs中上述成骨相關(guān)因子mRNA表達水平較第7天時進一步升高。見圖10。

圖10 培養(yǎng)第7天(A)和第14天(B)時各組hDPSCs中成骨相關(guān)因子mRNA表達水平Fig.10 Expression levels of osteogenic related factors in hDPSCs in various groups on 7th day(A)and 14th day(B)of culture

3 討 論

頜面部骨組織缺損的修復(fù)方式是目前研究的熱點，傳統(tǒng)修復(fù)方式（自體骨移植和異體骨移植）［10］存在許多缺點和不足［11-12］，隨著醫(yī)學的發(fā)展，骨組織工程學聯(lián)合再生醫(yī)學成為骨組織修復(fù)的首選。

大多數(shù)學者在骨組織工程學中采用骨髓間充質(zhì)干細胞，但有研究［13-14］顯示：與骨髓間充質(zhì)干細胞比較hDPSCs具有更好的克隆形成能力、增殖能力和成骨向分化能力，同時hDPSCs起源于神經(jīng)嵴的外胚間充質(zhì)，與頜面部骨組織具有相同的組織來源，因此選用hDPSCs作為頜面骨缺損種子細胞具有更豐富的分化潛能和同源優(yōu)越性。

轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 （transforming growth factor，TGF）家族是再生醫(yī)學領(lǐng)域中經(jīng)典的生長因子家族，作為多功能細胞因子，參與廣泛的生物過程的調(diào)節(jié)，包括細胞增殖和細胞分化等［15］。TGF-β家族包括 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3，能夠促進間充質(zhì)干細胞增殖和早期分化成為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌腱細胞［16］。研究［17-18］顯示：TGF-β3能夠募集內(nèi)源的間充質(zhì)細胞發(fā)起骨再生，誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨形成并完成骨重塑，在成骨過程中發(fā)揮重要作用，是修復(fù)骨組織缺損的選擇性生物活性分子。

組織工程學中要求載體材料具有良好的生物相容性和穩(wěn)定的化學性質(zhì)。肝素是一種糖胺聚糖和硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)類似物，其分子上的負電荷基團能與生長因子等蛋白質(zhì)有較強的靜電相互作用［19］，因此肝素可以吸附生長因子并提高其生物穩(wěn)定性。研究［20］顯示：HepMA為雙鍵改性肝素更利于生長因子的富集和釋放，被廣泛應(yīng)用于組織工程支架和緩釋系統(tǒng)。

本研究以HepMA作為TGF-β3的載體，藥物釋放結(jié)果顯示：將TGF-β3加載到HepMA中緩釋效果極佳；TGF-β3-HepMA中TGF-β3在0～60 μg·L－1累計釋放濃度范圍以劑量依賴的方式促進hDPSCs增殖，當累計釋放濃度大于 60 μg·L－1時促增殖作用開始下降。驗證成骨作用的主要指標為ALP染色、鈣結(jié)節(jié)形成以及成骨相關(guān)因子ALP、COL-Ⅰ、Runx2和OCN等的表達情況。本研究結(jié)果顯示：TGF-β3-HepMA組細胞中ALP染色和鈣結(jié)節(jié)形成明顯高于對照組和HepMA組；同時RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：與對照組和HepMA組比較，成骨誘導(dǎo)7 d時成骨早期的標志因子ALP和Runx2 mRNA表達水平明顯升高，14 d時其他成骨因子COL-Ⅰ和OCN mRNA表達水平也明顯升高。本研究結(jié)果表明：將TGF-β3加載于HepMA中更利于TGF-β3的釋放和發(fā)揮作用，60 μg·L－1TGF-β3-HepMA 對hDPSCs的成骨分化具有更好的促進作用。

綜上所述，TGF-β3-HepMA可以通過促進成骨相關(guān)因子的表達進而提高hDPSCs的成骨分化能力，本研究結(jié)論為利用組織工程學修復(fù)頜面骨組織缺損提供了理論依據(jù)。