懸鉤子根多糖對2型糖尿病小鼠胰腺線粒體功能的改善作用

代敏敏,常 影,許 娜,王 燕,徐 夢,徐文悅,馬佳旺,劉文森,陳正愛

（1.延邊大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室，吉林 延吉 133002；2.吉林醫(yī)藥學院藥學院藥理學教研室，吉林 吉林 132013；3.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130118；4.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 長春 130118）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，DM患病率逐年上升［1］。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會2019年的最新報告，到2045年DM患病人數(shù)將增加至6.93億。在全球范圍內(nèi)，大約每11名成人中就有1例DM患者，其中90% 為 2型 糖 尿 病 （diabetes mellitus type 2，T2DM）［2-3］。持續(xù)的高血糖狀態(tài)會嚴重損害身體各系統(tǒng)，引起各種并發(fā)癥，最終導致死亡。DM已成為危害全球健康的最重要的慢性非傳染性疾病之一［4］。

線粒體是大多數(shù)真核細胞正常功能所必需的，在包括骨骼肌、心肌、大腦、胰腺和肝臟等許多組織中的能量代謝和ATP生成中起著關(guān)鍵作用［5］。當線粒體功能出現(xiàn)障礙時，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生增加，ATP產(chǎn)生不足，進而導致胰腺β細胞功能障礙和胰島素分泌減少，最終導致血糖升高。目前T2DM的發(fā)病機制尚不明確，但是大多數(shù)學者認為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和β細胞功能障礙是其主要發(fā)病機制［6］。研究［7］表明：線粒體功能障礙與IR和β細胞功能障礙的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。隨著線粒體功能障礙與T2DM關(guān)系的深入研究，尋找改善胰腺線粒體功能的藥物將有助于T2DM的臨床防治。

懸鉤子根多糖（Rubus root polysaccharide，RRP）是植物懸鉤子的提取物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降糖、降脂和抗腫瘤等作用［8-10］。研究［11］顯示：在體外實驗中，RRP通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK） 和葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P）的表達水平進而調(diào)節(jié)脂類和葡萄糖代謝。KE等［12］發(fā)現(xiàn)：RRP可通過恢復線粒體功能對棕櫚酸誘導的L02細胞毒性發(fā)揮保護作用。目前尚無RRP在T2DM小鼠模型中對胰腺線粒體功能影響的相關(guān)研究。本研究進一步探討了RRP的降血糖作用，通過檢測小鼠胰腺線粒體功能相關(guān)指標，闡明RRP對小鼠胰腺線粒體功能的改善作用，以期為T2DM的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量（24±2）g，購自遼寧長生生物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001。小鼠在通風良好、12 h晝夜交替、室溫（24±2）℃和相對濕度（50±10）%的條件下標準化分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑和儀器 RRP從懸鉤子根部提取，純度≥85%，提取方法見參考文獻［9］和參考文獻 ［13］。鏈脲佐菌素 （streptozocin， STZ）（美國Sigma公司），二甲雙胍（北京京風制藥有限公司），MIR05-kit（北京華威中儀科技有限公司），葡萄糖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試 劑 盒 （美 國EMD Millipore公司），小鼠胰高血糖素（glucagon，GC）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司），小鼠C肽ELISA試劑盒（武漢Elabscience生物技術(shù)有限公司）。高端多功能酶標儀（奧地利TECAN公司），電子天平（德國多利斯公司），低溫高速離心機（日本三洋公司），超低溫冰箱（中國海爾公司），OROBOROS O2K高分辨率線粒體功能/細胞能量代謝測量系統(tǒng)（北京華威中儀科技有限公司）。

1.3 T2DM動物模型制備、分組和給藥 實驗開始前，70只健康SPF小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機選取10只小鼠作為對照組飼喂標準飼料，其余60只小鼠作為模型制備組飼喂高脂飼料。5周后，模型制備組小鼠單次腹腔注射低劑量STZ（130 mg·kg－1）。腹腔注射 STZ 后 1周，禁食不禁水12 h，檢測小鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG） 水平，F(xiàn)BG≥7.8 mmol·L－1的小鼠被認為造模成功，并繼續(xù)給予高脂飲食。根據(jù)血糖結(jié)果，從52只造模成功的小鼠中隨機選取50只，分為5組：模型組，低、中和高劑量（50、100和200 mg·kg－1） RRP 組 ， 二 甲 雙 胍 （200 mg·kg－1）組，每組10只。對照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)10周。

1.4 各組小鼠血清FBG水平檢測和口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT） 在灌胃后0、30、60、90和120 min采集小鼠血液樣品，采用葡萄糖檢測試劑盒檢測小鼠血清中FBG水平。每4周進行1次OGTT，OGTT測定前禁食不禁水12 h，每組小鼠口服2 mg·kg－1葡萄糖溶液進行OGTT，繪制OGTT的時間-血糖曲線，計算OGTT的時間-血糖曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清中空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、C肽和GC水平 各組小鼠禁食不禁水12 h后，通過尾靜脈收集血液樣品。采用ELISA法檢測各組小鼠血清中FINS、C肽和GC水平。計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR），HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6 計算各組小鼠胰腺指數(shù) 實驗結(jié)束后，記錄小鼠體質(zhì)量，斷髓處死后收集小鼠新鮮胰腺組織，并計算胰腺指數(shù)，胰腺指數(shù)=胰腺質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.7 檢測各組小鼠胰腺組織線粒體功能 各組小鼠胰腺組織解凍后，用預冷的PBS緩沖液清洗3次，根據(jù)胰腺組織質(zhì)量（g）∶PBS緩沖液體積（mL）=1∶9加入預冷的PBS緩沖液，充分研磨后使用OROBOROS O2K高分辨率線粒體功能/細胞能量代謝測量系統(tǒng)檢測各組小鼠胰腺線粒體功能。氧氣校準后，在玻璃腔中加入2 mL MIR05-kit，然后分別加入各種底物、解偶聯(lián)劑和抑制劑等物質(zhì)。通過O2K軟件對數(shù)據(jù)進行分析，實時綜合檢測磷氧比（ADP∶O ratio，ADP/O）、呼吸控制率（respiratory control rate，RCR）和基礎(chǔ)呼吸耗氧量。

1.8 HE染色觀察各組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 胰腺組織樣本固定在4%多聚甲醛中，經(jīng)過一系列酒精脫水，二甲苯清除，石蠟包埋。常規(guī)制備4 μm厚度的胰腺組織切片進行HE染色，光鏡下觀察小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠體質(zhì)量、飲水量和攝食量，血清中FBG、FINS、C肽和GC水平，OGTT的AUC、HOMA-IR和胰腺指數(shù)，線粒體功能相關(guān)指標ADP/O、RCR和基礎(chǔ)呼吸耗氧量符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài) 與對照組比較，模型組小鼠精神萎靡，毛色粗糙，自主活動減少；與模型組比較，各劑量RRP組和二甲雙胍組小鼠精神狀態(tài)、毛色和自主活動在一定程度上有所改善。與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），飲水量和攝食量明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，中和高劑量RRP組及二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），飲水量和攝食量明顯減少（P＜0.05）；低劑量RRP組小鼠體質(zhì)量有升高趨勢，飲水量和攝食量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠一般狀態(tài)Tab.1 General state of mice in various groups(n=3，±s）

表1 各組小鼠一般狀態(tài)Tab.1 General state of mice in various groups(n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Body mass(m/g)30.57±0.47 25.50±1.11*Drinking water(V/mL)5.43±0.75 18.27±0.95*Food intake(m/g)4.67±0.59 7.60±0.40*7.33±0.67 6.20±0.75△5.00±0.89△4.27±0.96△Control Model RRP Low dose Medium dose High dose Metformin 26.50±0.85 27.47±0.74△29.07±1.23△30.77±1.12△16.57±0.99 12.33±1.86△9.37±1.30△6.27±0.61△

2.2 各組小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR 與對照組比較，模型組小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，中和高劑量RRP組及二甲雙胍組小鼠血清中FBG水平、OGTT的AUC和HOMA-IR明顯降低（P＜0.05）；低劑量RRP組小鼠血清中FBG水平和HOMA-IR明顯降低（P＜0.05），OGTT的AUC有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠血清中FBG水平（A）、OGTT曲線（B）、OGTT的AUC（C）和HOMA-IR（D）Fig.1 Serum FBG levels（A）,OGTT curves（B）,AUC of OGTT（C）,and HOMA-IR（D）of mice in various groups

2.3 各組小鼠血清中FINS、C肽和GC水平 與對照組比較，模型組小鼠血清中FINS和C肽水平明顯降低 （P＜0.05），GC水 平明顯升高 （P＜0.05）。與模型組比較，中和高劑量RRP組及二甲雙胍組小鼠血清中FINS和C肽水平明顯升高（P＜0.05），GC水平明顯降低（P＜0.05）；低劑量RRP組小鼠血清中FINS和C肽水平有升高趨勢，GC水平有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清中FINS、C肽和GC水平Tab.2 Levels of FINS,C-peptide,and GC in serum of mice in various groups (n=3，±s）

表2 各組小鼠血清中FINS、C肽和GC水平Tab.2 Levels of FINS,C-peptide,and GC in serum of mice in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model RRP Low dose Medium dose High dose Metformin FINS[λB/(mIU·L－1)]17.09±1.10 11.04±0.93*C-peptide[ρB/(mg·L－1)]2.93±0.38 0.45±0.16*GC[λB/(mU·L－1)]29.35±0.32 60.47±3.47*54.07±5.03 49.23±5.82△33.97±6.69△38.45±1.79△11.35±0.14 13.01±0.47△15.44±0.98△15.40±0.38△0.73±0.21 1.27±0.15△1.90±0.20△1.93±0.38△

2.4 各組小鼠胰腺指數(shù) 與對照組比較，模型組小鼠胰腺指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量RRP組和二甲雙胍組小鼠胰腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠胰腺指數(shù)Fig.2 Pancreatic indexes of mice in various groups

2.5 各組小鼠胰腺線粒體功能 與對照組比較，模型組小鼠胰腺線粒體ADP/O、RCR和基礎(chǔ)呼吸耗氧量均明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，中和高劑量RRP組及二甲雙胍組小鼠胰腺線粒體ADP/O、RCR和基礎(chǔ)呼吸耗氧量均明顯升高（P＜0.05）；低劑量RRP組小鼠胰腺線粒體ADP/O和RCR有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）， 基 礎(chǔ) 呼 吸 耗 氧 量 明 顯 升 高 （P＜0.05）。見表 3。

表3 各組小鼠胰腺線粒體功能Tab.3 Pancreatic mitochondrial function of mice in various groups (n=3，±s）

表3 各組小鼠胰腺線粒體功能Tab.3 Pancreatic mitochondrial function of mice in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group ADP/O RCR Control Model RRP-L Low dose Medium dose High dose Metformin 3.40±0.31 1.43±0.33*2.29±0.32 0.50±0.17*Basal oxygen consumption(pmol/s/x)35.80±2.66 10.37±1.44*15.67±0.71△19.38±1.11△24.70±1.62△27.40±0.36△1.77±0.15 2.13±0.25△2.70±0.20△2.27±0.06△0.71±0.09 1.25±0.09△1.75±0.21△1.66±0.09△

2.6 各組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 與對照組比較，模型組小鼠胰腺組織中胰島形狀不規(guī)則，胰島細胞大小和數(shù)量明顯減少，胰島出現(xiàn)炎性細胞浸潤和變性壞死。與模型組比較，各劑量RRP組和二甲雙胍組小鼠胰腺組織中胰島形狀較完整，胰島細胞大小和數(shù)量不同程度增加，壞死面積減少。見圖3。

圖3 各組小鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.3 Pathomorphology of pancreas tissue of mice in various groups(HE,×200)

3 討 論

T2DM小鼠模型的建立多采用化學藥物誘導的方法，目前常用的誘導劑有STZ和四氧嘧啶［14］。STZ是一種廣譜抗生素，能夠在短時間內(nèi)特異性的損害β細胞，從而導致機體內(nèi)胰島素分泌不足［15］。由于STZ造模穩(wěn)定性好，對機體損傷較小，并且高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ的方法能夠很好地模擬人類DM患者新陳代謝的自然進展和變化，是一種常用的建立實驗性T2DM動物模型的途徑［16-17］。因此本研究采用高脂飼料聯(lián)合腹腔注射低劑量STZ的方法建立T2DM小鼠模型，模型制備組小鼠連續(xù)4周給予高脂飲食，隨后注射STZ，1周后檢測小鼠的FBG，結(jié)果顯示：模型制備組小鼠FBG水平 ≥7.8 mmol·L－1，OGTT 的 AUC 和 HOMA-IR升高，胰腺組織結(jié)構(gòu)被破壞，表明T2DM小鼠模型制備成功。本研究結(jié)果顯示：RRP可明顯降低T2DM小鼠的FBG，改善糖耐量和胰腺組織結(jié)構(gòu)，表明RRP具有明顯的降血糖作用。

胰腺是人體的重要器官，主要分泌胰島素和胰高血糖素來控制機體的葡萄糖代謝。當胰腺功能發(fā)生紊亂時，會導致胰島素分泌異常或胰島素抵抗［18］。為研究RRP對小鼠胰腺的影響，本研究檢測了各組小鼠血清中FINS、C肽和GC水平及胰腺指數(shù)。C肽在等摩爾的基礎(chǔ)上與胰島素共分泌，衡量β細胞功能的金標準是評估血漿中的C肽水平［19］。胰腺指數(shù)在一定程度上可以反映胰島結(jié)構(gòu)是否受損［20-21］。本研究結(jié)果顯示：RRP治療后，T2DM小鼠血清中FINS、C肽水平和胰腺指數(shù)均升高，GC水平降低，表明RRP可以通過改善T2DM小鼠的胰腺功能，促進胰島素分泌，進而調(diào)節(jié)T2DM小鼠的血糖。此外，本研究中小鼠胰腺組織病理學結(jié)果證實：RRP可以改善T2DM小鼠胰腺組織的形態(tài)表現(xiàn)。

線粒體最主要的功能就是通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量，維持機體正常生理活動［22-23］，其功能障礙會導致細胞功能受損。線粒體呼吸是線粒體系統(tǒng)能量代謝過程中最重要的步驟，ADP/O和RCR能夠衡量線粒體功能結(jié)構(gòu)完整程度，反映線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)功能，體現(xiàn)線粒體的能量轉(zhuǎn)化效能［24-25］。本實驗采用ADP/O、RCR和基礎(chǔ)呼吸耗氧量反映線粒體的呼吸功能和ATP的合成能力，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠胰腺線粒體ADP/O、RCR和基礎(chǔ)呼吸耗氧量均明顯降低，且RRP干預10周后可以逆轉(zhuǎn)上述變化，表明RRP可以改善T2DM小鼠的胰腺線粒體功能。

本研究探討了RRP對T2DM小鼠胰腺線粒體功能的改善作用，其改善作用是RRP本身的作用還是其代謝產(chǎn)物的影響，尚需進一步研究。本研究結(jié)果顯示：RRP能夠使T2DM小鼠血清中FBG和GC水平及HOMA-IR明顯降低，血清FINS和C肽水平、ADP/O、RCR、基礎(chǔ)呼吸耗氧量和胰腺指數(shù)明顯升高，同時T2DM小鼠的糖耐量和胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷明顯改善。綜上所述，RRP能夠改善T2DM小鼠胰腺線粒體功能，促進胰島素的分泌，進而調(diào)節(jié)血糖。