二氧化鈦納米粒子聯(lián)合LED光照射對口腔變異鏈球菌的抑制作用及其機(jī)制

閆琳琳,朱 琳,趙遠(yuǎn)航,宋嘉卓,鄒馨穎,劉 新,趙 紅,張志民,張 紅

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科，吉林 長春 130021；2.吉林省口腔生物醫(yī)學(xué)國際聯(lián)合研究中心，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué) 超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林 長春 130012）

齲病是一種以特定細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物為首要原因引起的多因素慢性感染性疾病，會造成牙體硬組織脫礦和漸進(jìn)性破壞［1］。變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是革蘭陽性細(xì)菌，是公認(rèn)的引起齲病的主要細(xì)菌，可通過代謝碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸，并對低pH值環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)能力［2］。變異鏈球菌還能夠產(chǎn)生葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases， GTFs）， 促 進(jìn) 胞 外 多 糖（extracellular polysaccharides，EPS）的合成，造成細(xì)菌在牙齒表面有效定植，從而形成有較強(qiáng)致齲性的菌斑生物膜［3］。因此，抑制變異鏈球菌是預(yù)防和控制齲病的有效方法［4］。

目前，納米技術(shù)推動了納米抗菌材料的快速發(fā)展，納米材料具有較大比表面積，能明顯提高材料表面的化學(xué)反應(yīng)性［5］。金屬和金屬氧化物納米顆粒作為有效的新型抗菌劑越來越受到重視［6］，其中二氧 化 鈦 （TiO2） 納 米 粒 子 （TiO2nanoparticles，TiO2NPs）具有較好生物安全性、較低成本、豐富產(chǎn)量和優(yōu)越的化學(xué)性能，尤其因具備較好的光催化殺菌活性而引起廣泛關(guān)注［7］。TiO2是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的材料，在光照下可持續(xù)發(fā)揮抗菌作用，在消毒、清潔水、除臭和控制污染等方面廣泛應(yīng)用。然而，由于TiO2禁帶較寬，通常只有紫外光照射才能將其激發(fā)。為了減少紫外光帶來的危害，研究者通過摻雜技術(shù)成功將TiO2改性，使其吸收波長擴(kuò)大至可見光范圍［8］。IBRAHIM 等［9］制備了銀摻雜的TiO2（Ag-TiO2）薄膜，結(jié)果表明：Ag-TiO2能有效滅活大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。ZANE等［10］合 成 了 氮 （nitrogen， N） 摻 雜 的TiO2（N-TiO2），其在藍(lán)光照射60 min后對大腸桿菌有明顯的抗菌效果。雖然上述研究確定了金屬摻雜TiO2和非金屬摻雜TiO2有明顯的抗菌作用，但尚無研究明確金屬與非金屬共摻雜TiO2聯(lián)合LED光照射對變異鏈球菌有抑制作用。本實(shí)驗采用六水合硝酸鋅和氨水分別作為鋅（zinc，Zn）和N的來源，通過溶膠-水熱法對TiO2進(jìn)行共摻雜，制備了新型Zn和N共摻雜TiO2NPs（Zn-N-TiO2nanoparticles，Zn-N-TiO2NPs），在牙科發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）光固化燈光照激發(fā)Zn-N-TiO2NPs的條件下，明確其對變異鏈球菌的抑制作用，并初步探討其抗菌機(jī)制，以期為Zn-NTiO2NPs在預(yù)防齲病領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

變異鏈球菌（UV159，中國科學(xué)院），BHI培養(yǎng)基（英國Oxoid公司），瓊脂（德國BioFroxx公司），N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和1，3-二 苯 基 異 苯 并 呋 喃 （1，3-diphenylisobenzofuran，DPBF）（上海Aladdin公司），鈦酸丁酯（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），無水乙醇、六水合硝酸鋅和氨水（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），去離子水（實(shí)驗室自制）。磁力攪拌器（河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），超聲儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），真空干燥箱（上海森信實(shí)驗儀器有限公司），馬弗爐（安徽省合肥科晶材料技術(shù)有限公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），牙科LED光固化燈（瑞士義獲嘉偉瓦登特公司），Cure Rite輻 射 儀 （美國DENSPLY公司），X射線多晶衍射儀（德國布魯克公司），掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（日本日立公司），LabRAM ARAMIS智能拉曼光譜儀（法國HORIBA Jobin Yvon公司），紫外可見分光光度計（南京菲勒儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek儀器公司）。

1.2 納米粒子的制備

采用溶膠-水熱法制備TiO2NPs，具體方法如下：取5 mL鈦酸丁酯和5 mL無水乙醇混合得A溶液，取20 mL無水乙醇、5 mL水和1 mL濃硝酸混合得B溶液，將A溶液緩慢滴加進(jìn)入劇烈攪拌的B溶液。滴加完成后，繼續(xù)攪拌混合溶液120 min得到淡黃色透明溶膠。將溶膠移至水熱釜中，160℃條件下加熱360 min后，將產(chǎn)物浸泡于無水乙醇中超聲震蕩處理30 min，高速離心10 min，抽真空60℃條件下將離心后的產(chǎn)物干燥24 h獲得TiO2NPs前驅(qū)體，將前驅(qū)體置于馬弗爐內(nèi)450℃焙燒120 min得到TiO2NPs。

根據(jù)設(shè)計摻雜比例分別添加適量六水合硝酸鋅和氨水至B溶液，使Zn與鈦（titanium，Ti）的摩爾比分別為1%∶1、3%∶1、5%∶1和7%∶1，N與Ti的摩爾比為3%∶1，其他實(shí)驗條件不變，得到不同摻雜濃度的Zn-N-TiO2NPs：1%Zn-3%NTiO2NPs（Zn1）、 3%Zn-3%N-TiO2NPs（Zn3）、5%Zn-3%N-TiO2NPs （Zn5） 和 7%Zn-3%NTiO2NPs（Zn7）。

1.3 納米粒子的表征

1.3.1 X射線衍射法（X-ray diffraction，XRD）和拉曼光譜檢測納米粒子的晶體結(jié)構(gòu)和粒徑 采用XRD法分析合成的TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs的晶體結(jié)構(gòu)。根據(jù)Scherrer公式計算TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs晶體粒徑，D=Kλ/Bcosθ（D 為晶體粒徑，K為謝樂常數(shù)，λ為X射線波長，B為半峰高寬度，θ為布拉格角），分別取適量TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs置于清潔的石英玻璃片上，在氦氖（He-Ne）激光器激發(fā)波長633 nm激光線和10 s/次條件下采集拉曼光譜。

1.3.2 SEM觀察納米粒子的形態(tài)和分布 取適量TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs分別溶解于無水乙醇中，超聲儀超聲震蕩處理溶液30 min后，取10 μL溶液滴加于硅片表面，待自然干燥后采用SEM進(jìn)行掃描觀察。

1.3.3 紫外-可見光吸收光譜（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis）檢測納米粒子對可見光吸收度值 采用丙二醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為0.02%的丙二醇/TiO2NPs和丙二醇/Zn-N-TiO2NPs懸濁液，置于紫外-可見分光光度計內(nèi)，設(shè)置光照射波長范圍為250～800 nm，增量為2 nm，檢測納米粒子對紫外-可見光的吸收度，即吸光度（A）值。

1.4 采用Cure Rite輻射儀檢測LED光固化燈的功率密度

檢測前先將固化時間設(shè)置為20 s。打開光固化燈靜置10 s后將光導(dǎo)棒放置于感光窗，穩(wěn)定后記錄輻射儀數(shù)值。間歇60 s后按照以上操作繼續(xù)讀取數(shù)值，測試3次后取均值作為LED光固化燈的功率密度值。

1.5 平板菌落計數(shù)法檢測納米粒子聯(lián)合LED光照射抑制變異鏈球菌實(shí)驗中各組平板菌落數(shù)

采用滅菌環(huán)挑取變異鏈球菌單個菌落接種于BHI培養(yǎng)液，37℃厭氧條件下孵育24 h，采用分光光度計測定菌液濃度，配置2×107CFU·mL－1濃度實(shí)驗菌液待用。實(shí)驗分組為空白對照組、單獨(dú)LED光照組、TiO2NPs組、Zn1組、Zn3組、Zn5組和Zn7組。用BHI培養(yǎng)液將TiO2NPs、Zn1、Zn3、Zn5和 Zn7配制為濃度 4.0 g·L－1納米粒子溶液待用。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入50 μL上述各組納米粒子溶液，每孔再加50 μL實(shí)驗菌液，使每組納米粒子終濃度均為2.0 g·L－1，變異鏈球菌濃度為1×107CFU·mL－1。搖勻后，采用牙科LED光固化燈（波長385～515 nm，光導(dǎo)棒有效工作面積63.5 mm2）對每組液體進(jìn)行照射，照射時間分別為1、3和5 min，為使樣本均勻需確保LED燈頭始終與96孔細(xì)胞培養(yǎng)板平齊。單獨(dú)LDE光照組：配制同空白對照組菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后LED光分別照射1、3和5 min；空白對照組：取50 μL實(shí)驗菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后加入50 μL BHI培養(yǎng)基。以上各組菌液均在37℃厭氧條件下避光培養(yǎng)24 h。將各孔菌液梯度稀釋，取100 μL均勻涂布于BHI平板，37℃厭氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.6 采用DPBF探針檢測各組納米粒子活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放量

取DPBF溶液1 mL，加入Zn3配制濃度為2.0 g·L－1的Zn3-DPBF溶液，混合均勻后分別取100 μL移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，設(shè)置4孔。用LED光分別照射0、1、3和5 min，每組光照結(jié)束后采用多功能酶標(biāo)儀以2 nm為增量檢測300～600 nm波長范圍內(nèi)各組溶液的A值，并觀察在波長410 nm處A值峰值變化，此波長處A值越小表示ROS釋放量越大。

1.7 采用平板菌落計數(shù)法檢測加入NAC后各組變異鏈球菌菌落數(shù)

采用平板菌落計數(shù)法檢測加入ROS清除劑NAC和LED光照射5 min后，各組變異鏈球菌的生長情況。實(shí)驗分為對照組、NAC組、Zn3組和NAC+Zn3組。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置4孔，每孔加50 μL實(shí)驗菌液，第1孔加入BHI培養(yǎng)液50 μL，第2孔加入5 mmol·L－1NAC和BHI培養(yǎng)液50 μL，第 3孔加入 4.0 g·L－1Zn3 溶 液 50 μL， 第4孔加入 5 mmol·L－1NAC和 4.0 g·L－1Zn3溶液50 μL。各組混勻后LED光照射5 min，避光培養(yǎng)24 h后將各孔菌液梯度稀釋，取100 μL均勻涂布于BHI平板，37℃厭氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組變異鏈球菌菌落數(shù)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 納米粒子的XRD譜

TiO2NPs、Zn1、Zn3、Zn5和 Zn7的 XRD譜見圖1。參照PDF標(biāo)準(zhǔn)卡片，圖譜中均對應(yīng)為銳鈦礦相TiO2的衍射峰，并未見新的晶相。根據(jù)Scherrer公式計算TiO2NPs、Zn1、Zn3、Zn5和Zn7的平均晶體粒徑分別為15.6、11.3、9.8、9.4和7.3 nm。

圖1 TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs的XRD譜Fig.1 XRD spectra of TiO2NPs and Zn-N-TiO2NPs

2.2 納米粒子的拉曼光譜

450℃處理溫度下TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs的拉曼光譜見圖2。在144、396、517和639 cm－1附近出現(xiàn)典型銳 Ti礦相 TiO2拉曼峰［11］，其中144 cm－1附近的峰強(qiáng)度最大，是Eg對稱類型，屬于O-Ti-O變角振動峰。

圖2 TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of TiO2NPs and Zn-N-TiO2NPs

2.3 納米粒子的形態(tài)和分布

在SEM下觀察，制備的TiO2NPs和Zn-NTiO2NPs為分布均勻的球形納米顆粒。見圖3。

圖3 SEM觀察TiO2NPs和Zn-N-TiO2NPs的形態(tài)和分布(Bar=500 nm)Fig.3 Morphology and distribution of TiO2NPs and Zn-N-TiO2NPs observed by SEM(Bar=500 nm)

2.4 納米粒子的UV-vis譜

與TiO2NPs比較，在設(shè)置的波長范圍內(nèi)Zn-N-TiO2NPs的A值明顯升高，其中Zn3組在400～500 nm波長范圍內(nèi)A值最高。見圖4。

圖4 TiO2NPs和 Zn-N-TiO2NPs的UV-vis譜Fig.4 UV-vis spectra of TiO2NPs and Zn-N-TiO2NPs

2.5 LED光固化燈的功率密度值

通過Cure Rite輻射儀測試得出LED光固化燈的平均功率密度值為1 167 mW·cm－2，參考LED光照射樣品時間為1、3和5 min，按照公式：功（J·cm－2） = 功 率 密 度 （W·cm－2） × 照 射 時 間（s），計算每組光照時間對應(yīng)的作用功分別為70、210 和 350 J·cm－2。

2.6 納米粒子聯(lián)合LED光抑制變異鏈球菌實(shí)驗中各組變異鏈球菌菌落數(shù)

LED光照時間分別為1、3和5 min時，空白對照組、單獨(dú) LED光照組、TiO2NPs組、Zn1組、Zn5組和Zn7組變異鏈球菌菌落數(shù)明顯高于相同光照時間Zn3組（P＜0.05）。Zn1組、Zn3組、Zn5組和Zn7組隨著LED光照時間增加，各組變異鏈球菌菌落數(shù)均呈逐漸下降趨勢。與空白對照組比較，除單獨(dú)LED光照組光照時間為1 min時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組變異鏈球菌菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與相同照射時間單獨(dú)LED光照組比較，TiO2NPs、Zn1、Zn3、Zn5和Zn7組變異鏈球菌菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 納米粒子聯(lián)合LED光照射抑制變異鏈球菌實(shí)驗中各組變異鏈球菌菌落數(shù)Tab.1 Number of colonies of Streptoccus mutans in various groups in experiment of nanoparticles combined with LED lightillumination in inhibiting Streptococcus mutans (n=3，±s）

表1 納米粒子聯(lián)合LED光照射抑制變異鏈球菌實(shí)驗中各組變異鏈球菌菌落數(shù)Tab.1 Number of colonies of Streptoccus mutans in various groups in experiment of nanoparticles combined with LED lightillumination in inhibiting Streptococcus mutans (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with Zn3 group；△P＜0.05 compared with blank control group；＃P＜0.05 compared with LED illumination group.

Number of colonies Group Blank control LED illumination LED 1 min LED 3 min LED 5 min TiO2NPs LED 1 min LED 3 min LED 5 min Zn1 LED 1 min LED 3 min LED 5 min Number of colonies 530.00±17.80*525.33±16.68*483.67±7.72*△444.00±13.14*△18.67±3.30△＃7.67±2.05△＃3.00±1.63△＃248.33±15.52*△＃193.67±13.47*△＃157.67±11.90*△＃97.67±4.92*△＃66.00±3.74*△＃43.33±4.64*△＃44.67±4.78*△＃38.00±3.74*△＃25.33±7.76*△＃Group Zn3 LED 1 min LED 3 min LED 5 min Zn5 LED 1 min LED 3 min LED 5 min Zn7 LED 1 min LED 3 min LED 5 min 131.00±3.56*△＃116.33±3.09*△＃106.33±4.99*△＃

2.7 各組納米粒子ROS釋放量

DPBF屬于ROS檢測探針，在410 nm處達(dá)到吸收峰值，DPBF與ROS反應(yīng)后410 nm處A值降低。利用DPBF探針檢測ROS釋放實(shí)驗結(jié)果見圖5。隨著LED光照射時間的延長，溶液在410 nm處的A值逐漸降低，表明各組納米粒子溶液的ROS釋放量隨光照時間延長而逐漸增加。

圖5 牙科LED光照射不同時間后TiO2NPs的DPBF吸收曲線Fig.5DPBF absorption curves of TiO2NPs after dental LED light illumination for different time

2.8 加入NAC后各組變異鏈球菌菌落數(shù)

與Zn3組比較，NAC+Zn3組變異鏈球菌菌落數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見圖6。

圖6 加入NAC后各組變異鏈球菌菌落數(shù)Fig.6Number of colonies of Streptococcus mutans in various groups after added with NAC

3 討 論

變異鏈球菌是引起齲病的主要細(xì)菌之一，開發(fā)新型有效抗菌劑抑制變異鏈球菌對降低齲病發(fā)病率具有重要意義［12］。在眾多納米抗菌劑中，因TiO2NPs有較好生物安全性和抗菌性等優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注［13］。

根據(jù)晶型TiO2分為銳鈦礦相、金紅石相和板鈦礦相［14-15］。本研究中XRD結(jié)果與TiO2的XRD標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDSNo.99-0008比較可知：在2θ=25.3°時出現(xiàn)了很明顯的衍射峰，對應(yīng)于銳鈦礦相（101）晶面［16］，說明本研究所得產(chǎn)物均為銳鈦礦相TiO2，且未觀察到金紅石相和氧化鋅相，說明Zn和N摻雜未使TiO2晶型發(fā)生變化，分析其原因為Zn和N摻雜濃度較低，或Zn和N元素均勻的分布于TiO2晶體表面；另外隨著摻雜濃度的提高，TiO2晶粒尺寸不斷減小，提示Zn和N的摻入可抑制TiO2晶粒粒徑增大。本研究采用拉曼光譜觀察Zn和N摻雜對TiO2NPs拉曼譜峰的影響，結(jié)果顯示：Zn和N摻雜后的TiO2拉曼譜峰位置未產(chǎn)生明顯變化，說明Zn和N的摻入對TiO2晶格畸變影響較??；但144 cm-1附近處拉曼峰強(qiáng)度卻隨著摻雜元素濃度的增加而逐漸減弱，分析其原因為Zn和N摻入引起了晶格常數(shù)改變所致。

銳鈦礦相TiO2在適當(dāng)光能和波長條件（波長385 nm、3.2 eV）下與光產(chǎn)生作用后，價帶中的基態(tài)電子將被激發(fā)進(jìn)入導(dǎo)帶，價帶產(chǎn)生帶正電的電子空穴。自由電子和電子空穴可遷移至TiO2表面參與氧化還原反應(yīng)，進(jìn)一步產(chǎn)生ROS［17］。由光催化原理可知，由于禁帶寬度較大，TiO2只有在紫外光照射時才能產(chǎn)生ROS［18］。但紫外光占太陽光不到5%［19］，故在可見光條件下TiO2難以發(fā)揮最大的抗菌作用。為了提高可見光利用率，擴(kuò)大TiO2可用范圍，研究者［7］采用向TiO2中摻雜金屬元素［鐵（Fe）、銅（Cu）和鈰（Ce）等］和（或）非金屬元素［N、硫（S）和氟（F）等］以達(dá)到縮小TiO2禁帶寬度和促進(jìn)TiO2對可見光吸收增強(qiáng)的目的。研究［20］表明：用金屬元素和非金屬元素對TiO2共摻雜后，由于金屬粒子與非金屬粒子間的協(xié)同改性效應(yīng)，共摻雜TiO2光催化效果比單摻雜TiO2更好，故本研究選用Zn和N元素對TiO2進(jìn)行共摻雜。為了考察Zn和N摻雜對TiO2NPs光學(xué)性能的影響，本研究進(jìn)行了UV-vis吸收光譜的檢測，結(jié)果顯示：在可見光波長400～500 nm范圍內(nèi)，摻雜后的TiO2NPs光吸收強(qiáng)度明顯提高，并且在此波長范圍內(nèi)Zn3組的光吸收強(qiáng)度最高。分析其原因為，在摻雜過程中，由于N原子半徑與O原子半徑相近且Zn離子半徑與Ti離子半徑相近，N取代了TiO2晶格中部分O，Zn取代了TiO2晶格中部分Ti，從而縮小禁帶寬度，抑制晶粒尺寸增大，增加比表面積，提高了TiO2對光的吸收強(qiáng)度［21-22］。

根據(jù)本研究中Zn-N-TiO2NPs結(jié)合LED光抑制變異鏈球菌實(shí)驗的菌落計數(shù)結(jié)果推斷：Zn-NTiO2NPs產(chǎn)生抗菌作用的主要原因是其在LED光照條件下產(chǎn)生了ROS。ROS攻擊微生物膜表面多不飽和磷脂后進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)和電子介質(zhì)變性，進(jìn)而細(xì)胞膜破壞，胞質(zhì)泄露，細(xì)胞死亡［23］。同時本研究結(jié)果顯示：當(dāng)Zn∶Ti≤3%∶1時，隨著Zn摻雜濃度的提高，平板菌落計數(shù)逐漸下降；當(dāng)Zn∶Ti＞3%∶1時，隨著Zn摻雜濃度的提高，平板菌落計數(shù)逐漸升高。分析其原因為，當(dāng)Zn摻雜濃度較低時，自由電子與電子空穴未產(chǎn)生有效分離，導(dǎo)致TiO2的光催化活性較低；當(dāng)Zn的摻雜濃度逐漸增加，Zn成為了自由電子和電子空穴的復(fù)合中心，提高了電子-空穴復(fù)合率，造成TiO2光催化活性下降；當(dāng)Zn摻雜濃度適宜時，電子-空穴的分離與復(fù)合之間產(chǎn)生平衡，此時Zn-N-TiO2NPs光催化活性最強(qiáng)。上述原因引起各組Zn-N-TiO2NPs產(chǎn)生的ROS釋放量發(fā)生變化，進(jìn)一步引起菌落計數(shù)結(jié)果的變化。

根據(jù)光催化原理，TiO2需在適當(dāng)光源條件下才能有效發(fā)揮抗菌作用，然而本實(shí)驗菌落計數(shù)結(jié)果表明：TiO2NPs也具有一定的抗菌效果。研究［24-25］表明：黑暗條件下TiO2也會對細(xì)菌產(chǎn)生毒性作用，TiO2NPs通過疏水效應(yīng)及自身電荷與細(xì)菌表面電荷相互吸引，從而黏附于細(xì)菌表面改變其胞膜通透性，同時在細(xì)菌表面重新排列，進(jìn)一步使胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生聚集，出現(xiàn)細(xì)菌生長延遲和失活現(xiàn)象［26-27］，該結(jié)論也是本研究中TiO2NPs具備一定抗菌作用的原因。同時有研究［28］結(jié)果顯示：藍(lán)光照射本身對細(xì)菌也有抑制作用，該現(xiàn)象在本實(shí)驗中也有所體現(xiàn)，但其抗菌能力較微弱。

本研究選用的牙科LED光固化燈（Bluephase N型）是在口腔臨床操作過程中樹脂材料固化步驟的必須設(shè)備。將Zn-N-TiO2NPs與牙科LED光固化燈聯(lián)合使用，可結(jié)合兩者優(yōu)勢提高設(shè)備利用率和Zn-N-TiO2NPs的抗菌性能，為Zn-N-TiO2NPs的應(yīng)用提供必要條件。

為了明確納米粒子聯(lián)合LED光能否產(chǎn)生ROS以明確其抗變異鏈球菌機(jī)制，本研究采用DPBF檢測ROS釋放量，結(jié)果顯示，光照1 min組、3 min組和5 min組DPBF-Z3溶液在410 nm處的峰值逐漸下降，說明納米粒子聯(lián)合LED光可產(chǎn)生ROS，且隨著光照時間延長，ROS釋放量逐漸增加。

NAC是一種強(qiáng)抗氧化物質(zhì)，能夠干擾ROS生成和清除ROS［29］。為了進(jìn)一步明確Zn3聯(lián)合LED光在抗變異鏈球菌過程中的作用機(jī)制，本研究選用NAC對菌落計數(shù)最少組（Zn3組）進(jìn)行處理，結(jié)果顯示：加入NAC后平板菌落計數(shù)明顯增加，驗證了在ROS釋放實(shí)驗中Zn3在LED光照條件下可產(chǎn)生ROS的結(jié)論。此外，LED光照時間（5 min）相比實(shí)際的牙科樹脂固化時間略長，在今后的研究中本課題組將在縮短LED光照時間方面進(jìn)行深入研究，以更有利于實(shí)際的臨床操作。

綜上所述，本實(shí)驗制備的3%Zn-3%NTiO2NPs能夠在LED光照射下通過光催化作用有效抑制變異鏈球菌的生長。