炎癥狀態(tài)下人牙周膜成纖維細(xì)胞中SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平及其意義

喬樹偉,李保勝,李效宇,王子璇,李碧榕,董 博,孟維艷

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔種植科，吉林 長春 130021）

牙周膜是位于牙骨質(zhì)與牙槽骨之間的結(jié)締組織，起到連接牙齒與其他牙周組織的重要作用［1］。牙周膜成纖維細(xì)胞 （periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）是牙周膜的主要組成細(xì)胞，對于調(diào)節(jié)炎癥及維持牙周組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［2］。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是牙周炎的主要致病菌，而其膜表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 是主要的致病因子［3］。當(dāng)發(fā)生牙周炎時(shí)，細(xì)菌及其產(chǎn)生的毒力因子會導(dǎo)致PDLFs進(jìn)行性損傷，牙周膜受到破壞［4］；而PDLFs產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（interleukin-6， IL-6） 和 白 細(xì) 胞 介 素 1β（interleukin-1β，IL-1β）會進(jìn)一步造成牙槽骨吸收，最終牙齒脫落［5-6］。但牙周炎的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚。

溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體的核心成分，其按1∶1的比例將胞內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，同時(shí)將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，用 于 谷 胱 甘 肽 （glutathione， GSH） 的 合 成［7］。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）發(fā)揮作用的重要輔助因子，GPX4可以提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)活性 氧 （reactive oxygen species， ROS） 水 平［8］。SLC7A11和GPX4在癌癥、缺血性器官損傷和退行性疾病等方面起著重要作用，并在鐵死亡中扮演重 要 角 色［9-10］。 近 期 有 多 項(xiàng) 研 究［11-13］顯 示：SLC7A11和GPX4與各類炎癥損傷性疾病有關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷和急性肝衰竭。但目前尚未見關(guān)于牙周炎與SLC7A11和GPX4關(guān)系的報(bào)道，因此本研究初步探討在P.g-LPS刺激的炎癥狀態(tài)下，人牙周膜成纖維細(xì)胞（human PDLFs， hPDLFs） 中SLC7A11和GPX4表達(dá)的變化，進(jìn)一步了解P.g-LPS對hPDLFs的影響，并探討其在誘導(dǎo)炎癥方面的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 P.g-LPS（美國Invivogen公司），DMEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液、青霉素鏈霉素雙抗和胰蛋白酶（美國HyClone公司），胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）（以色列BI公司），免疫顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），波形蛋白（Vimentin）抗體和細(xì)胞角蛋白14（cytokeratin 14，CK14）抗體（沈陽萬類生物科技有限公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司），β-actin抗體（美國ProteinTech公司），SLC7A11和GPX4抗體（美國Abcam公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（北 京 索萊寶科技有限公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）和ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光液（蘇州新賽美生物科技有限公司）。Vanox倒置顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司），RT-qPCR儀（美國安捷倫公司），電泳儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 hPDLFs的分離和培養(yǎng) 于吉林大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科門診收集8例患者（15～25歲）因正畸或其他原因拔除的健康第三磨牙，患者無牙周炎和吸煙史。用含10%雙抗的PBS緩沖液沖洗牙齒50次后，去除牙齦組織，刀片刮取牙根中1/3的牙周膜，修剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小的塊狀，均勻接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入4 mL完全培養(yǎng)基（10%FBS、1%雙抗和89%DMEM）后，倒置放入細(xì)胞孵育箱。4 h后翻瓶，5 d后觀察組織塊并換液，之后每2 d換液，直至細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶80%面積時(shí)傳代。第3～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：202144），患者知情同意。

1.3 倒置顯微鏡下觀察hPDLFs形態(tài)表現(xiàn)和免疫組織化學(xué)染色鑒定 倒置顯微鏡下觀察原代和第3代hPDLFs的形態(tài)表現(xiàn)。取第3代hPDLFs制成單細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞爬片上，24 h后PBS緩沖液清洗3次后4%多聚甲醛固定。采用免疫顯色試劑盒和DAB顯色試劑盒對細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，鏡下觀察并拍照。

1.4 細(xì)胞分組 取第3～6代hPDLFs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度為2×105/孔。待細(xì)胞長至80%時(shí)，棄上清，PBS緩沖液清洗，對照組細(xì)胞中加入不含 P.g-LPS（即0 mg·L－1P.g-LPS） 的完全培養(yǎng)基，1和10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中分別加入含 1和10 mg·L－1P.g-LPS的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、SLC7A11和GPX4 mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，測定總RNA濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中SLC7A11、GPX4、TNF-α、IL-6和 IL-1β mRNA表達(dá)水平。以 β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火/延伸30 s，循環(huán)數(shù)為40次。采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。引物序列如下：TNF-α，上游引物 5′-CTGCCTGCTGCACTTTGGAG-3′， 下 游 引 物 5′-ACATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3′； IL-6， 上 游 引 物 5′-AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-3′， 下 游 引 物5′-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3′；IL-1β，上游引物 5′-CAGCAGCATCTCGACAAGAG-3′，下游 引 物 5′-CATCATCCCACGAGTCACAG-3′；SLC7A11， 上 游 引 物 5′-GGTACTGCAATCACAATGCCAGA-3′， 下 游 引 物 5′-GCACATGCATCAAGAGTTTCCATAA-3′； GPX4， 上 游 引 物5′-AAGGACCTGCCCCACTATTTC-3′， 下 游 引物 5′-ACGCTGGATTTTCGGGTCT-3′； β-actin，上 游 引 物 5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′， 下 游 引 物 5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.6 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平 棄去各組細(xì)胞的上清液，冰上用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗1次后加入RIPA裂解液，充分裂解后提取蛋白并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后，盡快進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，并與SLC7A11、GPX4和 β-actin一抗 （1∶1 000） 4 ℃孵育過夜。第2天，洗膜3次后，室溫?fù)u床孵育二抗1 h。洗膜3次后使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.7 2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測各組細(xì)胞中ROS水平 細(xì)胞經(jīng)P.g-LPS刺激24 h后，棄去上清液，PBS緩沖液沖洗，用10 mg·L－1的 DAPI室溫染色 10 min。PBS 緩沖液洗凈 DAPI染液后， 加入 10 μmol·L－1DCFH-DA 37℃避光孵育40 min。用不含血清的DMEM洗滌3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。采用Image J軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，計(jì)算ROS水平。DCFH-DA熒光強(qiáng)度/DAPI熒光強(qiáng)度代表ROS水平，結(jié)果以相對于對照組的倍數(shù)表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraghPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中炎癥因子、SLC7A11和GPX4 mRNA表達(dá)水平，各組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞中ROS水平，均符合正態(tài)分布，以±s表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLFs形態(tài)表現(xiàn)和鑒定 倒置顯微鏡下觀察，5～8 d有條索狀細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，12 d可見大量成纖維細(xì)胞圍繞組織塊呈放射狀生長（圖1A）；第3代細(xì)胞有較強(qiáng)增殖能力，且呈漩渦狀生長（圖1B），細(xì)胞為長梭形或多邊形，單核，核圓形或卵圓形（圖1C），符合hPDLFs形態(tài)學(xué)特征。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：Vimentin蛋白染色陽性（圖2A），胞質(zhì)呈棕黃色；CK14蛋白染色陰性（圖2B），證明其來源于中胚層，而非上皮細(xì)胞，提取的細(xì)胞為hPDLFs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 倒置顯微鏡下hPDLFs的形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Morphological performance of hPDLFs under inverted microscope

圖2 Vimentin和CK14蛋白在hPDLFs中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×100）Fig.2 Expressions of Vimentin and CK14 proteins in hPDLFs（Immunohistochemistry, ×100）

2.2 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，經(jīng)P.g-LPS刺激24 h后，1和 10 mg·L－1P.g-LPS 組細(xì)胞中 TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與 1 mg·L－1P.g-LPS組比較，10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中上述炎癥因子mRNA表達(dá)水平明顯升高（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 各組hPDLFs中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β mRNA in hPDLFs in various groups

2.3 各組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4 mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，1和10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與 1 mg·L－1P.g-LPS組 比 較，10 mg·L－1P.g-LPS 組細(xì)胞中 SLC7A11和 GPX4 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組hPDLFs中SLC7A11和GPX4 mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of SLC7A11 and GPX4 mRNA in hPDLFs in various groups

2.4 各組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平 與對照組比較，1和10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）； 與 1 mg·L－1P.g-LPS 組 比 較，10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組hPDLFs中SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B,C)of expressions of SLC7A11 and GPX4 proteins in hPDLFs in various groups

2.5 各組細(xì)胞中ROS水平 不同濃度P.g-LPS分別作用hPDLFs 24 h后，采用DAPI和DCFH-DA熒光探針分別將細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)的ROS染色，DAPI染色為藍(lán)色，DCFH-DA染色為綠色。與對照組比較，1和10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中ROS水平明顯升高 （P＜0.05）；與1 mg·L－1P.g-LPS組比較，10 mg·L－1P.g-LPS組細(xì)胞中ROS水平明顯升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 DAPI和DCFH-DA熒光探針檢測各組hPDLFs中ROS水平Fig.6 ROS levels in hPDLFs in various groups detected by DAPI and DCFH-DA fluorescence probe

3 討 論

本研究通過免疫組織化學(xué)染色證明所分離的細(xì)胞為hPDLFs。作為體外探索牙周炎發(fā)病機(jī)制的模型細(xì)胞［14-15］，hPDLFs在P.g-LPS刺激的炎癥狀態(tài)下SLC7A11和GPX4表達(dá)下降，為進(jìn)一步闡釋P.g-LPS對hPDLFs的影響并探討其在誘導(dǎo)炎癥方面的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

SLC7A11和GPX4與炎癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。研究［16］顯示：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2處于炎癥狀態(tài)時(shí)，SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)水平降低。另有研究［12］顯示：在大腸桿菌LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，小鼠肺組織中SLC7A11和GPX4表達(dá)水平降低。人支氣管上皮細(xì)胞和滑膜細(xì)胞經(jīng)大腸桿菌LPS刺激后，SLC7A11和GPX4表達(dá)均下調(diào)［11-12］。GPX4作為SLC7A11的下游蛋白，不僅可以減少過氧化氫（H2O2）和一般的小氫過氧化物，甚至還可以減少生物膜和脂蛋白中的氫過氧化物［17］。目前關(guān)于SLC7A11和GPX4與炎癥關(guān)系的探索主要集中在大腸桿菌LPS的研究，未見關(guān)于P.g-LPS及其在牙周炎中作用的相關(guān)報(bào)道。P.g-LPS的致病特性由脂質(zhì)A決定，也正是因?yàn)镻.g-LPS的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)與大腸桿菌LPS的不同，使兩者的作用效果存在差異，因此P.g-LPS對牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中SLC7A11和GPX4的影響尚未明確［18］。本文作者采用P.g-LPS刺激hPDLFs 24 h后，觀察到細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平隨著P.g-LPS濃度的升高而逐漸升高，但SLC7A11和GPX4表達(dá)水平卻逐漸降低，在一定程度上證明本研究P.g-LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)與hPDLFs中SLC7A11和GPX4的下調(diào)有密切關(guān)聯(lián)。

為了進(jìn)一步了解SLC7A11和GPX4與牙周炎的關(guān)系，本研究檢測了hPDLFs中ROS水平，結(jié)果顯示：隨著P.g-LPS濃度升高，hPDLFs中ROS水平逐漸升高，可能是由于GPX4的下調(diào)使得毒性脂質(zhì)過氧化氫被還原成無毒脂醇的能力下降，從而促 進(jìn) 了 ROS 產(chǎn) 生［17，19］。 研 究［20-21］顯 示： 過 量 的ROS一方面可以通過誘導(dǎo)PDLFs中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活，引發(fā)IL-1β成熟；另外還能通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin，mTOR） 信號通路使TNF-α和IL-6表達(dá)水平升高，從而加重炎癥。在本研究中，P.g-LPS可以導(dǎo)致hPDLFs中ROS水平升高，同時(shí)TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平與ROS水平呈正相關(guān)關(guān)系，與以往的研究［20-21］結(jié)論相符合。因此，本文作者推測：P.g-LPS可能通過下調(diào)SLC7A11和GPX4表達(dá)，加劇ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥因子高表達(dá)，從而加重牙周炎。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)在P.g-LPS刺激的炎癥環(huán)境中，hPDLFs中SLC7A11和GPX4表達(dá)水平降低，提示SLC7A11和GPX4與牙周炎的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果為牙周炎發(fā)病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)，為牙周炎治療和預(yù)防提供了一個(gè)新的視角。