丁酸鈉聯(lián)合電離輻射對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

郎慶旭,牛雪霜,楊凱文,張 韌,王思騰,祖米熱提古麗·吾買爾,王珍琦

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130021；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013）

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是引起癌癥患者死亡的主要原因［1-2］。約70%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者確診時為晚期［1，3］，多數(shù)患者確診時難以切除，其治療主要依靠化療與放療相結(jié)合。放射治療是臨床癌癥的主要治療方法之一，但腫瘤的放射抵抗和放射治療的不良反應(yīng)限制了其治療效果和應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用放射增敏劑可提高放射治療的療效。丁酸鈉（sodium butyrate，NaBt）是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor， HDACi），已被證明在多種癌癥中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，延緩腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，包括肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、慢性髓細(xì)胞白血病和肺癌等，但其在很多癌癥中的確切作用尚未闡明［4-10］。 本 課 題 組 前 期 研 究［11］揭 示 了 NaBt對NSCLC A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，并呈濃度和時間依賴性，且NaBt和X射線聯(lián)合應(yīng)用抑制效果明顯優(yōu)于二者單獨應(yīng)用，其機(jī)制可能與二者聯(lián)合引起A549細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)。為了進(jìn)一步揭示NaBt和X射線的聯(lián)合對肺癌A549細(xì)胞的作用及其潛在機(jī)制，本研究探討了二者單獨或聯(lián)合應(yīng)用時對細(xì)胞 凋 亡、 線 粒 體 膜 電 位 （mitochondrial membrane potential， Δψm）、 活 性 氧 （reative oxygen species，ROS）水平和相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，以期為NSCLC的放射治療提供新的策略和實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)。NaBt（美國Sigma公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美國GIBCO公司），胰蛋白酶（上海生物技術(shù)有限公司），Annexin-Ⅴ/FITC凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），羅丹明123試劑盒（北京索萊寶生物科技公司），ROS試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)有限公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測試劑盒（中國Novoprotein公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純。X射線深部輻照儀（X-RAD 320 ix，德國PXI公司），Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司），RT-qPCR儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 實驗分組和照射處理 人A549細(xì)胞分為對照組、NaBt組、4 Gy X射線照射組和NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組。采用X射線深部輻照儀照射，電壓180 kV，電流20 mA，單次源靶距70 cm，劑量率 1.0 Gy·min－1，照 射時間 4 min，照射 劑量4 Gy。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率、Δψm和ROS水平 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h 后加入 NaBt（10 mmol·L－1），作用24 h后給予4 Gy X射線照射，24和48 h后用0.25% 胰酶消化后，1 000 r·min－1離心 5 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次。Annexin Ⅴ/PI雙染色，加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL，室溫避光孵育 10 min，加入 PI（20 mg·L－1）10 μL，室溫避光孵育5 min，尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率以百分率表示。照射后6 h按照上述方法收集細(xì)胞，加入500 μL稀釋后的羅丹明123，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育40 min，重懸細(xì)胞用300目尼龍布過濾細(xì)胞至流式管，立即上機(jī)檢測Δψm，以平均熒光強(qiáng)度（meanfluorescence intesnsity，MFI）表示。照射后6 h，加入適當(dāng)體積的2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸 酯 （2′， 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸液，1 500 r·min－1離心5 min，用PBS緩沖液洗滌1～2次，過濾后上機(jī)檢測ROS水平，以MFI表示。采用CellQuest軟件收集細(xì)胞，ModFit軟件分析結(jié)果，至少收集1×104個細(xì)胞。

1.4 RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平 將經(jīng)NaBt處理和4 Gy X射線照射的A549細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，按照美國Invitrogen公司的TRIzol操作說明書步驟進(jìn)行。用Epoch酶標(biāo)儀測定總RNA濃度和純度，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。制備cDNA，RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平，以GAPDH基因為內(nèi)參。caspase-3， 正 向 引 物 5′-AAGGCAGAGCCATGGACCAC-3′， 反 向 引 物 5′-CTGGCAGCATCATCCACACATA-3′；p21，正向引物 5′-AGGCCAAAGCCTATGGTGGAC-3′， 反 向 引 物 5′-TCTAGCAGGCCGTTGATGGAG-3′；GAPDH，正向引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′， 反 向 引 物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 實 時 定 量PCR反應(yīng)條件：95℃、1 min，95℃、20 s，60℃、20 s，72℃、30 s，共40個循環(huán)。采用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果分析，利用Ct值和相對標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到初始模板量，以目的基因與GAPDH基因初始模板之比表示目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞凋亡率、Δψm、ROS水平和caspase-3及p21 mRNA表達(dá)水平均以±s表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)分布，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率 NaBt單獨或聯(lián)合4 Gy X射線作用A549細(xì)胞24和48 h，與對照組、NaBt組和4 Gy X射線照射組比較，NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。作用48 h，與對照組比較，NaBt組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見圖1和表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of cells in various groups (n=3,±s,η/%）

表1 各組細(xì)胞凋亡率Tab.1 Apoptotic rates of cells in various groups (n=3,±s,η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Apoptotic rate Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation 48 14.33±1.57 79.08±2.56**20.71±7.21 89.29±0.36**△＃＃（t/h） 24 11.51±4.59 25.92±1.92 10.99±4.33 43.60±5.86*△△＃

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of A549 cells in various groups detected by flow cytometry

2.2 各組細(xì)胞Δψm和ROS水平 NaBt單獨或聯(lián)合4 Gy X射線作用A549細(xì)胞6 h后，分別與對照組、NaBt組和4 Gy X射線照射組比較，NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞Δψm均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與對照組比較，NaBt組和NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞ROS水平均升高（P＜0.05）；與4 Gy X射線照射組比較，NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞ROS水平升高（P＜0.05）；與NaBt組比較，NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞ROS水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2和表2。

表2 各組細(xì)胞Δψm和ROS水平Tab.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups(n=3,±s，MFI）

表2 各組細(xì)胞Δψm和ROS水平Tab.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups(n=3,±s，MFI）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation Δψm 14.15±3.85 6.79±0.51 6.94±1.38 2.81±0.79*△＃ROS 2.23±0.90 13.87±4.64*2.65±0.57 16.84±3.06*＃

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞Δψm和ROS水平Fig.2 Levels of Δψm and ROS in cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組細(xì)胞中caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平 NaBt單獨或聯(lián)合4 Gy X射線作用A549細(xì)胞24 h后，與對照組、NaBt組和4 Gy X射線照射組比較，NaBt聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞中caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與對照組比較，NaBt組和4 Gy X射線照射組細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與4 Gy X射線照射組比較，NaBt組細(xì)胞中p21 mRNA表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高 （P＜0.01）。見表3。

表3 各組細(xì)胞中caspase--3和p21mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of caspase -3 and pp2211 mRNA of cells in various groups (n=3，±s）

表3 各組細(xì)胞中caspase--3和p21mRNA表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of caspase -3 and pp2211 mRNA of cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Control NaBt 4 Gy X-ray irradiation NaBt combined with 4 Gy X-ray irradiation P21 1.00±0.16 6.85±0.30*＃＃3.68±0.19*16.09±1.67*△△＃＃Caspase-3 1.00±0.18 1.32±0.10 0.92±0.19 2.75±0.53*△＃

3 討 論

越 來 越 多 的 證 據(jù)［5-7，12-14］表 明 ： HDACi中 的NaBt具有抗腫瘤活性，且HDACi介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡通常是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而凋亡途徑的缺陷和凋亡蛋白的失調(diào)，在癌癥的發(fā)生和治療耐藥中起著決定性的作用［15-16］。

本課題組前期研究［11］顯示：NaBt對NSCLC A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，并呈濃度和時間依賴性，可引起細(xì)胞G1/G0期阻滯。為進(jìn)一步探索其腫瘤抑制機(jī)制，本研究檢測了NaBt作用后A549細(xì)胞凋亡率、ROS水平、Δψm和 caspase-3及 p21 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：NaBt可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，且呈時間依賴性，表明NaBt在A549細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用是通過細(xì)胞凋亡引起的。NATONI等［17］在胰腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)：NaBt通過內(nèi)源性和外源性凋亡途徑致敏。同時，在本研究中，NaBt引起A549細(xì)胞ROS水平升高。ROS積累會導(dǎo)致某些細(xì)胞功能受損并有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用［18］。以往有研究［19］證實：NaBt通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：NaBt作用后，A549細(xì)胞Δψm下降，與ROS水平升高相一致，提示ROS和線粒體膜參與該過程。線粒體是ROS攻擊的靶點之一，ROS可導(dǎo)致Δψm下降［20］。同時，本研究結(jié)果顯示：NaBt作用后，A549細(xì)胞中caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平升高。caspases活性信號分子的功能與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)，其中，caspases-3是凋亡的執(zhí)行者［21］。本研究中caspase-3 mRNA表達(dá)水平升高與凋亡率升高結(jié)果相一致。以上結(jié)果提示：NaBt通過ROS水平升高和線粒體損傷進(jìn)而導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡。p21 mRNA表達(dá)水平升高提示NaBt對細(xì)胞周期的影響。CHEN等［22］發(fā)現(xiàn)：NaBt與多西紫杉醇丙酸鈉聯(lián)合對A549細(xì)胞有增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用。所以NaBt可能是一種有效的NSCLC臨床治療藥物。

本研究同時檢測了4 Gy X射線照射對A549細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示：各組細(xì)胞上述各檢測指標(biāo)均無明顯變化，可能是由于A549細(xì)胞的輻射抗性。而NaBt和4 Gy X射線聯(lián)合作用，則引起A549細(xì)胞凋亡，且呈時間依賴性，細(xì)胞中ROS水平升高，Δψm降低，caspase-3和p21 mRNA表達(dá)水平升高，且二者聯(lián)合作用效果更優(yōu)，表明NaBt通過增加輻射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞線粒體損傷而引起細(xì)胞凋亡增加，與本課題組之前的研究［11］結(jié)果相一致。有研究［23］顯示：HDACi CUDC-101和SAHA在胰腺癌細(xì)胞中可增強(qiáng)輻射引起的細(xì)胞毒作用。HDACi能夠增加甲狀腺癌的輻射敏感性［24］。

綜上所述，NaBt可能是一種有效的NSCLC臨床治療藥物，同時可能有助于提高輻射敏感性。本研究為NSCLC的治療提供了新的策略，對NSCLC患者的治療具有重要的臨床意義。