丹參酮ⅡA對(duì)缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

張 洋,陳美月,崔 瑩,劉 娜

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部?jī)嚎?，吉?長(zhǎng)春 130031）

缺氧缺血性腦病是一種嚴(yán)重的新生兒腦損傷，由產(chǎn)程中窒息缺乏腦供氧和缺氧而發(fā)生，可導(dǎo)致新生兒過(guò)早死亡或各種終身疾病，包括急性癥狀，如癲癇發(fā)作、意識(shí)改變、呼吸微弱、肌肉張力差和代謝紊亂，以及慢性疾病，如腦癱、癲癇、智力殘疾和行為障礙［1-4］。缺氧缺血性腦病發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）積累、線粒體功能障礙、興奮性毒性和炎癥［5］。目前臨床上唯一被認(rèn)可的治療新生兒缺氧缺血性腦病的方法是降低體溫，但其治療的有效率不超過(guò)50%［6］，所以探索新生兒缺氧缺血性腦病新的治療方法十分必要。丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA，Tan Ⅱ A）是丹參中最豐富的脂溶性成分，Tan Ⅱ A及其衍生物Tan Ⅱ A磺酸鈉已被證明具有抗炎、抗氧化和抗纖維化功能，已在臨床上廣泛應(yīng)用［7-9］。Tan Ⅱ A對(duì)缺氧缺血性腦病的治療作用已在動(dòng)物模型［10］中證明，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不完全明確。微小RNA（microRNA，miRNA）是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)大量靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表達(dá)。miR-132是一種miRNA，其表達(dá)是神經(jīng)元正常發(fā)育、成熟和功能所必需的，其表達(dá)失調(diào)與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。研究［11］表明：miR-132對(duì)缺血性卒中小鼠腦損傷有保護(hù)作用。miR-132上調(diào)可減輕缺血性神經(jīng)元損傷［12］。本研究建立了新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，探討Tan Ⅱ A對(duì)模型大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)的影響，闡明其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 40只SPF級(jí)SD大鼠，7日齡，雌雄不限，體質(zhì)量12～18 g，購(gòu)自遼寧省長(zhǎng)生生物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2019-0001，新生鼠母乳喂養(yǎng)。Tan Ⅱ A注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司），miR-132陰性對(duì)照質(zhì)粒（miR-132 NC）和miR-132抑制劑（miR-132 antagomir）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），BCA試劑盒（美國(guó)Thermo公司），PCR引物［生工生物（上海）股份工程有限公司］，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司），突觸后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD-95）抗體、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 43（growth-associated protein-43， GAP-43）抗體、微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein-2，MAP-2）抗體和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF） 抗 體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），快速高爾基染色試劑盒（美國(guó)FD NeuroTechnologies公司）。－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)和切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），組織研磨儀（北京托摩根生物科技有限公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司），RT-qPCR儀（瑞士Roche公司），普通PCR儀（美國(guó)ABI公司），微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 新生大鼠缺氧缺血性腦病模型建立和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 建立缺氧缺血性腦病模型具體方法如下：將大鼠麻醉后頸正中切開皮膚，分離頸總動(dòng)脈后，用5-0無(wú)創(chuàng)縫合線進(jìn)行雙重結(jié)扎，從結(jié)扎線中間剪斷血管，消毒后縫合，手術(shù)后恢復(fù)2 h，將恢復(fù)后大鼠置于缺氧艙，向艙內(nèi)通入92%氮?dú)夂?%氧氣混合氣體，持續(xù)缺氧2 h［13］。40只新生SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Tan IIA組和miR-132 antagomir組，每組10只。假手術(shù)組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸正中切開皮膚，分離頸總動(dòng)脈后不做處理，消毒后縫合，將恢復(fù)后大鼠置于正常氧艙2 h。模型組、Tan Ⅱ A組和miR-132 antagomir組大鼠建立缺氧缺血性腦病模型。Tan Ⅱ A組大鼠造模成功后腹腔注射Tan Ⅱ A注射液 （24 mg·kg－1體質(zhì)量），雙側(cè)腦室注射2 μg miR-132 NC［11］。假手術(shù)組和模型組大鼠造模成功后腹腔注射與Tan IIA注射液等量的生理鹽水，雙側(cè)腦室注射與miR-132 NC等量的生理鹽水。miR-132 antagomir組大鼠造模成功后腹腔注射Tan Ⅱ A注射液 （24 mg·kg－1體質(zhì)量），雙側(cè)腦室注射 2 μg miR-132 antagomir［11］。各組大鼠連續(xù)注射 7 d。

1.3 RT-qPCR法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平 Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按SYBR試劑盒說(shuō)明書配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃、10 s，60℃、30 s，72℃、10 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，根據(jù)2－△△Ct法計(jì)算miR-132表達(dá)水平。

1.4 熒光原位雜交檢測(cè)各組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)強(qiáng)度 組織標(biāo)本均冰凍切片，室溫干燥，多聚甲醛固定，DEPC-PBS緩沖液洗滌，0.2 mol·L－1鹽酸作用 10 min，蛋白酶 K 工作液孵育 15 min，0.1 mol·L－1三乙醇胺作用 5 min，乙?；?0 min，SCC緩沖液孵育5 min，雜交探針避光42℃過(guò)夜，SCC緩沖液洗滌，DAPI孵育20 min，熒光顯微鏡觀察，miR-132表達(dá)強(qiáng)度通過(guò)Image J軟件計(jì)算，以平均熒光強(qiáng)度表示，miR-132表達(dá)強(qiáng)度=該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積。

1.5 大鼠改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分 各組大鼠處死前進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分［14］，由運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡試驗(yàn)組成，按0～18分進(jìn)行評(píng)分，分值越高，損害程度越嚴(yán)重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：提起鼠尾后前肢屈曲、后肢屈曲和30 s內(nèi)頭部運(yùn)動(dòng)并偏離垂直線大于10°各計(jì)1分；將大鼠置于地板上，頭與身體呈10°角觀察30 s，正常爬行計(jì)0分，不能徑直向前爬行計(jì)1分，向患側(cè)旋轉(zhuǎn)計(jì)2分，向患側(cè)倒下計(jì)3分；大鼠爬至桌邊時(shí)肢體不能收縮或支持身體計(jì)1分；大鼠向桌面邊沿推鼠爪，四肢活動(dòng)躍計(jì)1分；橫梁實(shí)驗(yàn)，正常計(jì)0分，緊抓橫梁邊緣計(jì)1分，緊握橫梁但一只肢體掉下計(jì)2分，緊握橫梁但兩只肢體掉下或在上旋轉(zhuǎn)60 s計(jì)3分，試圖在橫梁上保持平衡但僅能維40 s計(jì)4分，試圖在橫梁上保持平衡但僅能維20 s計(jì)5分，從橫梁上掉下計(jì)6分；刺激耳道后搖頭計(jì)1分；棉絮刺激角膜后眨眼計(jì)1分；聽到突然聲響后運(yùn)動(dòng)或尖叫計(jì)1分；抽搐、肌陣攣張力異常計(jì)1分。

1.6 HE染色觀察各組大鼠海馬組織病理形態(tài)表現(xiàn) 將4%多聚甲醛固定的大鼠海馬組織經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，石蠟包埋，切成5 μm厚的薄片并烘干。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水洗滌。將切片放入蘇木素染色3 min，自來(lái)水洗滌，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染色3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

1.7 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率 應(yīng)用TUNEL試劑盒檢測(cè)大腦海馬組織凋亡率。大腦海馬組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次，梯度乙醇浸泡，加入20 g·L－1無(wú)DNase的蛋白酶K，37℃孵育30 min，PBS緩沖液洗滌。切片后加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育6 min；PBS緩沖液洗滌3次，加DAPI，室溫孵育15 min；PBS緩沖液洗滌3次，用抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。神經(jīng)元凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 ELISA法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠大腦海馬組織勻漿中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平。

1.9 高爾基染色檢測(cè)各組大鼠海馬組織中樹突棘密度 按照快速高爾基染色試劑盒說(shuō)明書操作［15］。取大鼠腦組織置于固定液中固定48 h以上，根據(jù)需要觀察的組織部位將大鼠腦組織切成2～3 mm厚的組織塊，用生理鹽水將腦組織輕輕漂洗幾遍，置于45 mL的圓底EP管中，加入高爾基染液將腦組織完全浸沒(méi)，放置陰涼通風(fēng)處避光處理14 d；蒸餾水浸洗3次，倒入80%冰醋酸浸沒(méi)組織，過(guò)夜，待組織變軟后蒸餾水洗，置于30%蔗糖中；甲切片機(jī)將組織切成100 μm厚的切片，貼在明膠玻片上；將晾干后的組織玻片以濃氨水處理15 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅(jiān)膜定影液處理15 min，蒸餾水洗3 min，晾干，甘油明膠封片。采用Image J軟件計(jì)算大鼠海馬組織中樹突棘密度，樹突棘密度=樹突長(zhǎng)度/樹突棘數(shù)量。

1.10 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中 PSD-95、GAP-43、MAP-2和 BDNF 蛋白表達(dá)水平 使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，將裂解液加入組織中，冰上孵育30 min，勻漿機(jī)勻漿，4℃、12 000 r·min－1離心 20 min，取上清，BCA 法定量蛋白，煮樣，上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平，各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分，各組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率，各組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平，樹突棘密度以及PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey事后檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度 RT-qPCR結(jié)果顯示：假手術(shù)組、模型組、Tan Ⅱ A組和miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中miR-132表 達(dá) 水 平 分 別 為 1.00±0.02、0.27±0.05、0.79±0.11和0.32±0.08。熒光原位雜交結(jié)果顯示：假手術(shù)組、模型組、Tan Ⅱ A組和miR-132 antagomir組大鼠海馬組織miR-132表達(dá)強(qiáng)度分別為 0.85±0.05、0.11±0.01、0.53±0.15和0.14±0.03。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度明顯升高（P＜0.05）；與Tan Ⅱ A組比較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分為0，無(wú)神經(jīng)功能缺失；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分（9.70分±1.16分）明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分（4.20分±0.63分）明顯降低（P＜0.05）；與Tan Ⅱ A組比較，miR-132 antagomir組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分（8.40分±1.51分）明顯升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)表現(xiàn) 假手術(shù)組大鼠海馬組織中神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，核仁清楚，神經(jīng)元無(wú)水腫，無(wú)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹，胞核偏位，排列紊亂，深染，數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生；Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，水腫改善，排列較整齊，膠質(zhì)細(xì)胞增生改善；與Tan Ⅱ A組比較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中神經(jīng)元損傷加重。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.2 Pathomorphology of hippocampus tissue of rats in various groups(HE,×100)

2.4 各組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率 與假手術(shù)組（2.83%±0.74%）比較，模型組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率（48.93%±2.92%）明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率（13.25%±1.95%）明顯降低 （P＜0.05）； 與 Tan Ⅱ A組比 較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡率（35.82%±2.77%） 明 顯 升 高 （P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織TUNEL免疫熒光染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of TUNEL immunofluorescence staining of hippocampus tissue of rats in various groups(×200)

2.5 各組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平明 顯 升 高 （P＜0.05）； 與 Tan Ⅱ A組 比 較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5--羥色胺水平Tab. 1 Levels of noradrenaline, dopamine, and 5-hydroxytryptamine in hippocampus tissue of rats in various groups[n=10,±s, ρB/(μg·L－1)]

表1 各組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素、多巴胺和5--羥色胺水平Tab. 1 Levels of noradrenaline, dopamine, and 5-hydroxytryptamine in hippocampus tissue of rats in various groups[n=10,±s, ρB/(μg·L－1)]

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with Tan Ⅱ A group.

Group Sham operation Model Tan Ⅱ A MiR-132 antagomir 5-Hydroxytryptamine 31.23±2.14 19.82±1.35*28.77±2.01△20.05±1.28#Noradrenaline 16.23±1.77 8.94±0.85*14.82±1.23△9.11±0.91#Dopamine 0.38±0.05 0.14±0.03*0.33±0.07△0.18±0.04#

2.6 各組大鼠海馬組織中樹突棘密度 假手術(shù)組、模型組、Tan Ⅱ A組和miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中樹突棘密度分別為（1.35±0.08）、（0.61±0.05）、（0.98±0.07） 和 （0.65±0.06） μm－1；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中樹突棘密度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中樹突棘密度明顯升高（P＜0.05）；與Tan Ⅱ A組比較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中樹突棘密度明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織高爾基染色結(jié)果（×400）Fig.4 Results of Golgi-cox staining of hippocampus tissue of rats in various groups(×400)

2.7 各組大鼠海馬組織中PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Tan Ⅱ A組大鼠海馬組織中PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與Tan Ⅱ A組比較，miR-132 antagomir組大鼠海馬組織中PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖 5。

圖5 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中PSD-95、GAP-43、MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram (A)and histogram (B)of expressions of PSD-95,GAP-43,MAP-2，and BDNF proteins in hippocampus tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

缺氧缺血性腦病由腦血流中斷和隨后缺氧導(dǎo)致的患病區(qū)域引起，是導(dǎo)致死亡和視力障礙、學(xué)習(xí)障礙、癲癇、智力低下、失明和腦癱等終身殘疾風(fēng)險(xiǎn)增加的主要原因之一。由于大腦含有高濃度的不飽和脂肪酸、高耗氧量、低濃度的抗氧化劑、高含量的金屬催化自由基形成以及大量敏感的未成熟細(xì)胞，大腦需要高水平的氧氣供應(yīng)，因此對(duì)缺氧極為敏感，缺氧缺血事件后，氧化應(yīng)激觸發(fā)氧和氮的釋放、鈣超載、自由基生成、興奮性毒性、酸毒性、離子失衡、炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬和壞死，在發(fā)病機(jī)制中起重要作用［5］。miRNA與正常的大腦發(fā)育有關(guān)，可能參與缺氧缺血性損傷的機(jī)制。研究［11］表明：miR-132對(duì)缺血性卒中小鼠腦損傷有保護(hù)作用。miR-132上調(diào)可減輕缺血性神經(jīng)元損傷［12］。本研究結(jié)果顯示：缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平降低，Tan Ⅱ A可以上調(diào)大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)水平，抑制miR-132表達(dá)可降低Tan Ⅱ A處理的缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織miR-132表達(dá)，表明miR-132可能在Tan Ⅱ A對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病的治療中發(fā)揮作用。

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功能的基本單位，缺氧缺血性腦病發(fā)生后，海馬血供下降，神經(jīng)元線粒體短期內(nèi)能量衰竭，造成神經(jīng)元死亡，神經(jīng)炎癥參與各種細(xì)胞死亡機(jī)制，在急慢性神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用［16］。本研究結(jié)果顯示：缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織損傷加重且神經(jīng)元凋亡率增加，Tan Ⅱ A可以改善大鼠海馬組織損傷，降低神經(jīng)元凋亡率，抑制miR-132表達(dá)可削弱Tan Ⅱ A對(duì)大鼠海馬組織腦損傷的改善作用，增加神經(jīng)元凋亡率，提示Tan Ⅱ A可能通過(guò)上調(diào)miR-132表達(dá)，減輕缺氧缺血性腦病所致的腦損傷，降低海馬神經(jīng)元凋亡率。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是記憶形成及存儲(chǔ)中不可或缺的環(huán)節(jié)之一，主要包括去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺等，腦內(nèi)缺氧缺血時(shí)，腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［17］。本研究結(jié)果顯示：缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，Tan Ⅱ A可以降低新生大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，抑制miR-132表達(dá)可增加Tan Ⅱ A處理后缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中已降低的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，提示Tan Ⅱ A可能通過(guò)上調(diào)miR-132表達(dá)，減輕缺氧缺血性腦病所致的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。

樹突棘是樹突分支上的棘狀突起，是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位，其數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。研究［18］表明：缺血性腦損傷可造成樹突棘數(shù)量減少。突觸可塑性是神經(jīng)元改變突觸結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度的能力，對(duì)于完善神經(jīng)元回路以響應(yīng)發(fā)育過(guò)程中的感官體驗(yàn)及成人的學(xué)習(xí)和記憶形成至關(guān)重要［19］。PSD-95位于突觸后膜，在刺激和維持突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性中起著重要作用［20］，其參與維持正常的突觸功能和可塑性［21］。GAP-43是一種突觸前膜蛋白，參與神經(jīng)元細(xì)胞外生長(zhǎng)和突觸發(fā)育，介導(dǎo)軸突伸長(zhǎng)和改變細(xì)胞形態(tài)［22］。本研究結(jié)果顯示：Tan Ⅱ A可以增加缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中樹突棘密度及突觸相關(guān)蛋白GAP-43和PSD-95蛋白表達(dá)水平，抑制miR-132表達(dá)可降低Tan Ⅱ A處理的新生大鼠海馬組織樹突棘密度及GAP-43和PSD-95蛋白表達(dá)，提示Tan Ⅱ A可能通過(guò)上調(diào)miR-132表達(dá)，增加缺氧缺血性腦病新生大鼠突觸可塑性。

MAP-2是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，主要在神經(jīng)元的胞體和樹突中表達(dá)，具有組裝微管、構(gòu)成并穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和改變突觸可塑性的作用，其表達(dá)水平降低可導(dǎo)致微管變形堆積，影響細(xì)胞骨架完整性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［23］。BDNF已被證明可以保護(hù)缺氧缺血性腦病誘導(dǎo)的腦損傷［24］。本研究結(jié)果顯示：Tan Ⅱ A可以增加缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)水平，抑制miR-132表達(dá)可降低Tan Ⅱ A處理的新生大鼠海馬組織中MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證明了Tan Ⅱ A可能通過(guò)上調(diào)miR-132保護(hù)缺氧缺血性腦病所致的大鼠腦損傷。

綜上所述，Tan Ⅱ A可上調(diào)缺氧缺血性腦病新生大鼠海馬組織中miR-132表達(dá)，改善新生大鼠神經(jīng)功能及海馬組織病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與抑制海馬神經(jīng)元凋亡以及增加海馬神經(jīng)遞質(zhì)水平、樹突棘密度、突觸前蛋白及MAP-2和BDNF蛋白表達(dá)有關(guān)。