兔脫細胞軟骨基質(zhì)顆粒復(fù)合SD大鼠脂肪干細胞對軟骨內(nèi)成骨的促進作用

邊東瀟,包幸福,胡 敏

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021）

牙槽骨缺損是常見的牙周疾病之一，可造成牙齒的松動甚至脫落，產(chǎn)生美學(xué)和功能上的損害［1］。臨床上常采用移植自體骨或骨粉以增加骨量，但自體骨骨移植創(chuàng)傷較大且價格昂貴，患者接受度低［2］；利用骨粉可快速增加骨量，但不能有效建立血供進行骨改建且存在術(shù)后骨吸收的可能［3］。上述2種方法均存在不足之處，因此開發(fā)新的促進骨再生的修復(fù)方法具有重要意義。

骨組織工程中支架材料的重要特性是其體內(nèi)高降解率和高組織替代率，以及促進成骨和血管生成能力［4］，常用的支架材料包括羥基磷灰石、生物活性玻璃、水凝膠和金屬鈦等［5］。越來越多的研究［6-9］顯 示： 脫 細 胞 軟 骨 基 質(zhì) 顆 粒 （acellular catilage matrix，ACM）可以作為組織工程的支架材料，ACM通過脫去軟骨組織的蛋白和核酸，減少宿主的炎癥反應(yīng)和免疫排斥。常見的種子細胞包括骨髓基質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞和脂肪干細胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）等。常用的骨髓基質(zhì)干細胞從骨髓中獲得，取材過程痛苦，患者接受率低，以上缺點限制了骨髓基質(zhì)干細胞在牙周再生治療中的臨床應(yīng)用。ADSCs可通過微創(chuàng)的方式獲得，與獲取其他干細胞比較更易被患者接受且來源廣泛［10］。

以往的研究多集中于將ACM與同種屬的干細胞復(fù)合進行骨再生［11］。研究［12-13］顯示：ACM不僅可以提供三維立體結(jié)構(gòu)以供細胞以及血管生長，還可提供生物信號以決定細胞行為。研究［14］顯示：將ACM與同種屬來源的骨髓基質(zhì)干細胞共同植入軟骨缺損處獲得了軟骨再生。將ACM與同種屬骨髓基質(zhì)干細胞植入骨缺損可獲得血供良好的新生骨組織［12］，通過成軟骨誘導(dǎo)對骨髓基質(zhì)干細胞進行軟骨內(nèi)成骨獲得了骨組織再生［15］。將ACM與不同種屬來源的干細胞共培養(yǎng)通過軟骨內(nèi)成骨方式獲得骨再生的研究目前尚未見報道。本研究創(chuàng)新性地將SD大鼠ADSCs與兔ACM在成軟骨誘導(dǎo)條件下進行復(fù)合培養(yǎng)，以期得到更好的成軟骨誘導(dǎo)分化，為臨床上利用異種ACM支架進行骨再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 雄性SD大鼠，體質(zhì)量約為200 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001；3月齡新西蘭白兔，購自長春市隆盛實驗動物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2018-0006。75%乙醇購于山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，雙抗、L-DMEM和磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購于美國Thermo公司，胰蛋白酶和CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于蘇州新賽美公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，β-甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸、核酸酶、吲哚美辛、Ⅰ型膠原酶、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 （3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX） 和甲苯胺藍染液購于美國Sigma公司，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒購于日本W(wǎng)AKO公司，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 購于中國 PeproTech公司，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（insulintransferrin-selenium，ITS）購于上海愛必信生物科技有限公司，茜素紅染液、油紅O染色試劑盒、阿爾辛藍色試劑盒和Trition-X 100購于北京索萊寶科技有限公司，抗CD9抗體、抗CD54抗體、抗CD90抗體和抗CD45抗體購于北京Biolegend公司，總RNA提取試劑盒購于成都Foregene公司，羥脯氨酸含量檢測試劑盒購于南京建成科技有限公司，4%多聚甲醛溶液購于上海源葉生物科技有限公 司， 鈣 黃 綠 素/碘 化 丙 啶 （Calcein-AM/propidium iodide，PI）細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SDS、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix和MagicSYBR Mixture購于北京CWBIO公司。超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備公司，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱和倒置熒光顯微鏡購于日本SANYO公司，多功能臺式離心機購于上海安亭離心機械廠，流式細胞儀購于美國Beckman公司，電子分析天平購于上海精密儀器儀表有限公司，高壓蒸汽滅菌鍋購于重慶雅瑪拓科技有限公司，電熱恒溫水浴鍋購于上海博訊實業(yè)有限公司，場發(fā)射掃描電子顯微鏡購于北京捷歐路科貿(mào)有限公司，酶標儀購于美國BioTek公司。

1.2 原代SD大鼠ADSCs的提取 選取體質(zhì)量約為200 g雄性SD大鼠，脫頸處死后75%酒精浸泡中15 min，取大鼠睪丸周圍游離脂肪，用含2%雙抗的PBS緩沖液沖洗3次，將筋膜和血管剝離，剪碎后加0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化30 min。加入完全培養(yǎng)基，200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r·min－1離心5 min。去上清，用含 20%FBS和 1% 雙抗的L-DMEM重懸細胞，5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)，第3天換液，用含10%FBS和1%雙抗的L-DMEM培養(yǎng)，每3 d換液。細胞生長至80%時傳代，采用第3代細胞進行實驗。

1.3 ADSCs的干性檢測 為了檢測細胞成骨能力，成骨誘導(dǎo)液（H-DMEM，10%FBS，1%雙抗，10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉，50 mg·L－1L-抗壞血酸）誘導(dǎo)ADSCs 21 d后進行茜素紅染色，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)ADSCs 7 d后進行ALP染色。為了檢測細胞成脂能力，ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)液A液（H-DMEM，10%FBS，1% 雙抗，0.5 mmol·L－1IBMX，10 μmol·L－1胰島素，200 μmol·L－1吲哚美辛）誘導(dǎo)3 d、成脂維持液B液（H-DMEM，10%FBS，1% 雙抗，0.01 U·mL－1胰島素）誘導(dǎo)2 d，交替誘導(dǎo)共25 d后進行油紅O染色。為了檢測細胞成軟骨能力，成軟骨誘導(dǎo)液（H-DMEM，10%FBS，1% 雙 抗，37.5 mg·L－1L-抗 壞 血 酸，1 μg·L－1TGF-β1，1∶100 ITS） 誘導(dǎo) ADSCs 21 d后進行阿爾辛藍染色和甲苯胺藍染色。

為了鑒定ADSCs特定的細胞表面分子，ADSCs經(jīng)胰蛋白酶消化，計數(shù)8×106個細胞，PBS緩沖液沖洗2次，用700 μL PBS緩沖液重懸并分成5管，隨后除空白組以外各管分別與抗CD9（1∶ 100）、 抗 CD54 （1∶ 100）、 抗 CD90（1∶100）和抗CD45（1∶100）單克隆抗體在4℃下孵育1 h，采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子陽性表達率。

1.4 ACM的制備 取3月齡雌性新西蘭白兔，耳靜脈空氣栓塞處死，剪下雙耳，去皮毛筋膜血管等組織，剪碎凍干，研磨成粉末狀，過40目鋼篩，PBS 緩沖液浸泡 30 min，2 000 r·min－1離心 3 min，去上清，換1%SDS浸泡72 h，每24 h換液，Trition-X 100浸泡24 h，核酸酶浸泡12 h。PBS緩沖液清洗過濾3次，將顆粒置于含75%乙醇培養(yǎng)皿中紫外線照射過夜。次日PBS緩沖液清洗3次，凍干，于－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 采用羥脯氨酸檢測試劑盒檢測ACM中羥脯氨酸含量 利用試劑盒中的堿性水解液將未脫細胞的軟骨基質(zhì)顆粒（cartilage matrix particles， CM）和ACM水解，加入酸堿指示液，調(diào)pH值至中性，檢測在波長550 nm處CM和ACM的吸光度（A）值。通過羥脯氨酸標準液和空白對照組A值定量計算水解液羥脯氨酸含量。計算公式：羥脯氨酸含量=（測定A值－空白A值）/（標準A值－空白A值）×標準含量×水解總體積/組織濕質(zhì)量。

1.6 掃描電子顯微鏡觀察ACM和ACM上ADSCs的超微形態(tài)表現(xiàn) 將凍干的ACM用含10%FBS的L-DMEM浸泡30 min，再將消化下來的ADSCs種植到ACM上即ADSCs與ACM共培養(yǎng)組，1 h后補滿完全培養(yǎng)液，ACM組不加細胞。3 d后去培養(yǎng)液，10%戊二醛固定液4℃過夜，梯度酒精脫水，六甲基二硅氮烷（hexamethyldisilazane，HMDS）置換酒精并風(fēng)干。噴金后于5 kV電壓下掃描電子顯微鏡觀察ACM組和ADSCs與ACM共培養(yǎng)組的超微形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 Calcein-AM/PI熒光染色法觀察ADSCs在ACM上的生長情況 將第3代ADSCs與ACM在含8%FBS和1%雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)，3 d后去培養(yǎng)液并用PBS緩沖液沖洗3次，用Calcein/PI緩沖液避光孵育30 min后在熒光顯微鏡下觀察ADSCs在ACM上的生長情況。Calcein-AM對活細胞進行綠色熒光標記（Ex=490 nm，Em=515 nm），PI對死細胞進行紅色熒光標記（Ex=535 nm， Em=617 nm）。

1.8 采用CCK-8法檢測2組ADSCs增殖活性 將0.1 g凍干ACM浸泡在5 mL含8%FBS和1%雙抗的L-DMEM完全培養(yǎng)基中并置于孵箱，48 h后取上清用0.22 μm濾器過濾，于4℃保存。取第3代ADSCs分為對照組和實驗組，以5 000/孔密度鋪于96孔細胞培養(yǎng)板，在含8%FBS和1%雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中孵箱貼壁過夜，24 h后對照組換液為含8%FBS和1%雙抗的L-DMEM完全培養(yǎng)基，實驗組換液為ACM浸提液。分別于1、3和7 d將 10 μL CCK-8試劑加入 100 μL 培養(yǎng)基中，37℃孵育4 h，采用酶標儀檢測450 nm激發(fā)波長處A值，以A值表示細胞增殖活性。實驗重復(fù)3次。

1.9 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測 2組 ADSCs中成軟骨相關(guān)基因mRNA表達水平 將ADSCs分為對照組和實驗組（ADSCs與ACM共培養(yǎng)），分別與成軟骨誘導(dǎo)液體外共培養(yǎng)7和14 d，檢測細胞中成軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原（type Ⅱ collagen，COL-Ⅱ）、Ⅹ型膠原（type Ⅹ collagen，COL-Ⅹ）、SRY相關(guān)HMG盒9（SRY-related high mobility group-box 9，SOX-9）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn) 錄 因 子 2（Runt-related transcription factor-2，RUNX-2） mRNA表達水平。所有引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物序列見表1。采用總RNA提取試劑盒從ADSCs中提取RNA， 使 用 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix根據(jù)說明書進行cDNA合成，采用MagicSYBR Mixture進行PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為20 μL，在冰上完成。反應(yīng)程序：95℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。采用 2－ΔΔCt法計算各組ADSCs中成軟骨相關(guān)基因mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。

表1 成軟骨相關(guān)基因引物序列Tab.1 Primer sequences of chondrogenic related genes

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。CM和ACM中羥脯氨酸含量，2組 ADSCs增殖活性，2組 ADSCs中 COL-Ⅱ、COL-Ⅹ、SOX-9、VEGF、ALP和RUNX-2 mRNA表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的表征 倒置顯微鏡下觀察可見ADSCs呈現(xiàn)典型的干細胞紡錘形態(tài)（圖1A），約6 d傳代1次，達到一定密度后有成團生長的趨勢。成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅S染色，鈣化的鈣結(jié)節(jié)呈紅色（圖1B）。成骨誘導(dǎo)7 d行ALP染色，細胞基質(zhì)由于ALP的存在呈藍紫色（圖1C）。成脂誘導(dǎo)25 d行油紅O染色，細胞內(nèi)可見被染成橘紅色的圓形脂滴（圖1D）。成軟骨誘導(dǎo)21 d甲苯胺藍染色，蛋白多糖呈現(xiàn)紫色（圖1E）；阿利新藍染色，細胞內(nèi)的硫酸軟骨素呈藍色（圖1F）。

圖1 ADSCs的形態(tài)表現(xiàn)和分化能力Fig.1 Morphology and differentiation ability of ADSCs

采用流式細胞術(shù)檢測原代ADSCs表面標記物的表達，CD9（90.02%）、CD54（90.82%）和CD90（93.88%）呈陽性表達，CD45（0.93%）呈陰性表達（圖2）。

圖2 流式細胞術(shù)檢測ADSCs表面標記物的表達Fig.2 Expressions of surface markers in ADSCs detected by flow cytometry

2.2 ACM的表征 經(jīng)過脫細胞過程后的ACM呈乳白色（圖3A），凍干后呈乳白色顆粒狀（圖3B）。檢測CM和ACM中羥脯氨酸含量，與脫細胞前的CM （2 692.0 mg·g－1±107.9 mg·g－1） 比較，經(jīng) 過脫細胞處理后ACM中羥脯氨酸含量（2 368.0 mg·g－1±107.7 mg·g－1） 明顯降低 （P＜0.05）。掃描電子顯微鏡下觀察：ACM組支架呈多孔結(jié)構(gòu)，顯示出更大的表面積，孔內(nèi)沒有細胞存在；ADSCs+ACM共培養(yǎng)組中ADSCs可以在ACM上黏附生長，伸出偽足樣結(jié)構(gòu)，且ACM表面存在基質(zhì)樣物質(zhì)。見圖4。

圖3 濕潤的ACM(A)和凍干的ACM(B)Fig.3 Wet ACM(A)and freeze-dried ACM(B)

圖4 掃描電子顯微鏡下觀察ACM和ADSCs的超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructures of ACM and ADSCs observed under scanning electron microscope

2.3 2組ADSCs的增殖活性 在第1、3和7天時，與未加入ACM浸提液的對照組比較，加入ACM浸提液的實驗組中ADSCs增殖活性明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 不同時間2組ADSCs的增殖活性Fig.5 Proliferation activities of ADSCs in two groups at different time

2.4 ADSCs與ACM共培養(yǎng)時ADSCs生長情況采用Calcein-AM/PI染色法觀察ADSCs與ACM共培養(yǎng)時ADSCs的生長情況，ADSCs在ACM支架上能更好地黏附生長，并且細胞基本存活。見圖6。

圖6 ADSCs與ACM共培養(yǎng)3 d時ADSCs生長情況（Calcein-AM/PI熒光，×40）Fig.6 Growth status of ADSCs at 3 d of ADSCs and ACM co-culture（Calcein-AM/PI fluorescence,×40)

2.5 2組ADSCs中成軟骨相關(guān)基因mRNA表達水平 成軟骨誘導(dǎo)7 d時，與對照組比較，實驗組ADSCs中VEGF、ALP和RUNX-2 mRNA表達水平 明 顯 升 高 （P＜0.05）， COL-Ⅱ、 SOX-9和COL-ⅩmRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；成軟骨誘導(dǎo)14 d時，與對照組比較，實驗組ADSCs中VEGF、ALP和RUNX-2 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），COL-ⅩmRNA表達水平降低（P＜0.05）。與成軟骨誘導(dǎo)7 d時對照組比較，成軟骨誘導(dǎo)14 d時對照組ADSCs中VEGF、ALP和RUNX-2 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），COL-Ⅱ和COL-Ⅹ mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與成軟骨誘導(dǎo)7 d時實驗組比較，成軟骨誘導(dǎo)14 d時實驗組ADSCs中COL-Ⅱ和COL-Ⅹ mRNA表達水平明顯升高 （P＜0.05），VEGF、ALP和RUNX-2 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表 2 成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時間2組ADSCs中COL--Ⅱ、SOX--9、COL--Ⅹ、VEGF、ALP和RUNX--2 mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of COL--Ⅱ,,SOX-- 99,,COL--Ⅹ,,VEGF,,ALP,,and RUNX-- 22 mRNA in ADSCs in two groups at different time of chondrogenic induction culture(n=3，±s）

表 2 成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時間2組ADSCs中COL--Ⅱ、SOX--9、COL--Ⅹ、VEGF、ALP和RUNX--2 mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of COL--Ⅱ,,SOX-- 99,,COL--Ⅹ,,VEGF,,ALP,,and RUNX-- 22 mRNA in ADSCs in two groups at different time of chondrogenic induction culture(n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group at the same time；△P＜0.05 compared with 7 d in the same group.

SOX-9 mRNA COL-ⅡmRNA COL-ⅩmRNA VEGF mRNA ALP mRNA RUNX-2 mRNA Group Control 7 d 14 d Experimental 7 d 14 d 1.00±0.07 2.05±0.19△1.00±0.11 0.77±0.32 1.01±0.12 1.55±0.09△0.02±0.01 0.01±0.01△1.00±0.09 0.10±0.01△1.00±0.04 0.13±0.01△7.10±0.27*△2.10±0.21*△1.16±0.24 2.59±0.07△1.23±0.25 0.93±0.12 0.86±0.03 1.16±0.08*△0.13±0.02*0.04±0.01*△4.69±0.09*1.75±0.11*△

3 討 論

骨組織重建涉及到多個方面，包括炎癥反應(yīng)、原代軟骨組織的產(chǎn)生、干細胞募集、血管再生和礦物質(zhì)沉積及改建等［16-17］。骨組織修復(fù)一般有2種方式：①骨膜下成骨，即干細胞分化為成骨細胞進而成骨，由于在缺損部位缺少血管的長入，無法進行營養(yǎng)交換和氧氣運輸；②軟骨內(nèi)成骨，即間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生肥大軟骨基質(zhì)作為軟骨導(dǎo)板，軟骨細胞產(chǎn)生VEGF促進血管發(fā)生和基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13， MMP-13）分解軟骨導(dǎo)板，為血管長入提供空間進行物質(zhì)交換，礦物質(zhì)沉積進而成骨［18-19］。軟骨內(nèi)成骨的方式是成人骨缺損時主要的骨修復(fù)方式。以往研究主要集中在通過骨膜下成骨的方式進行硬組織重建，本研究以ACM作為軟骨導(dǎo)板進行軟骨內(nèi)成骨［20］。同種屬的ACM可以促進干細胞的成軟骨分化，但異種ACM對干細胞的作用缺乏相關(guān)的研究和結(jié)論。本研究成功提取了原代SD大鼠ADSCs并進行了細胞鑒定，鑒定脂肪干細胞的方法包括形態(tài)學(xué)鑒定、誘導(dǎo)分化能力檢測和表面分子檢測。ADSCs是來自中胚層的間充質(zhì)干細胞，表面特異性標志物包括CD9、CD54 和 CD90，陰性表達 CD45［21］。ADSCs的成骨分化、成脂分化和成軟骨分化能力證明了本實驗所用的ADSCs具有干細胞特性，為接下來的實驗奠定了基礎(chǔ)［22］。本研究通過一系列脫細胞過程制備出了兔ACM［23］，采用CCK-8法和Calcein-AM/PI熒光染色法證明ACM不但無細胞毒性，而且有促進細胞增殖和黏附的作用。ACM主要由膠原和糖胺聚糖組成，本研究中羥脯氨酸含量檢測結(jié)果顯示：ACM中羥脯氨酸含量較CM有所降低，提示脫細胞過程將軟骨基質(zhì)顆粒中膠原含量降低。ACM的三維多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞的附著、血管的長入和骨質(zhì)的沉積［24］，本研究中掃描電子顯微鏡下觀察到ADSCs可以在ACM上正常黏附生長。COL-Ⅱ是成軟骨分化的標志性基因，SOX-9是調(diào)節(jié)軟骨發(fā)生的主控基因。本研究結(jié)果顯示：成軟骨誘導(dǎo)14 d時ADSCs中COL-Ⅱ mRNA表達水平高于7 d組，說明14 d時成軟骨誘導(dǎo)分化效果比7 d時更充分；在成軟骨誘導(dǎo)7和14 d時，與對照組比較，實驗組ADSCs中COL-Ⅹ mRNA表達水平降低，COL-Ⅹ表達水平升高說明細胞已經(jīng)進入肥大化早期，提示ACM可以抑制ADSCs分化為肥大化的軟骨細胞；實驗組ADSCs中VEGF mRNA表達水平大幅度提高，且在成軟骨誘導(dǎo)7 d時較14 d時表達水平更高。ALP和RUNX-2是軟骨細胞終末肥大化表達的因子，對后續(xù)礦化進行軟骨內(nèi)成骨有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，實驗組ADSCs中ALP和RUNX-2 mRNA表達水平升高，提示ACM可以促進軟骨內(nèi)成骨；成軟骨誘導(dǎo)7 d時ALP和RUNX-2 mRNA表達水平明顯高于14 d，表明ACM可能在早期促軟骨內(nèi)成骨效果更好。

異種ACM具有天然多孔結(jié)構(gòu)、來源廣泛和缺乏免疫效應(yīng)等優(yōu)點，且不必額外加入價格高昂的細胞因子，因此是擁有廣闊發(fā)展前景的骨缺損修復(fù)材料。ADSCs也是來源廣泛的一種具有多向分化能力的間充質(zhì)干細胞。異種ACM和ADSCs 2種易得的材料復(fù)合是潛在的骨再生方法。