檸檬苦素對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠脂質(zhì)代謝和腸道菌群的影響

黃 爽,陳 琛,黃 波

（貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563000）

兒童肥胖是目前面臨的最為嚴(yán)峻的全球性健康問(wèn)題之一，其主要特征為脂肪量增加、脂質(zhì)代謝失調(diào)和腸道菌群失衡。兒童肥胖往往會(huì)持續(xù)到成年期，是患高血壓、高血脂、哮喘、2型糖尿病和心血管疾病等的主要危險(xiǎn)因素［1-2］。因此，減少兒童肥胖是一個(gè)重要的公共健康目標(biāo)，然而現(xiàn)有的抗肥胖藥物療效有限，并伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，不建議兒童服用。導(dǎo)致兒童肥胖的因素很多，不同類(lèi)型的肥胖，其致病因素也有所不同。高脂肪飲食是導(dǎo)致兒童營(yíng)養(yǎng)性肥胖的重要因素之一，同時(shí)腸道菌群在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖和代謝疾病中起著重要作用，腸道微生物組成可能隨著肥胖的發(fā)展而改變［3］。研究［4］顯示：高脂肪飲食可改變擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的比例，導(dǎo)致肥胖和其他代謝紊亂的發(fā)生。中藥對(duì)腸道菌群失衡和脂質(zhì)代謝紊亂具有良好的調(diào)控作用［5］。檸檬苦素廣泛存在于柑橘類(lèi)水果中，是一種三萜苷元衍生物，具有多種藥理學(xué)功效，包括抗癌、抗炎、抗菌和抗病毒等活性。此外，檸檬苦素還有降血脂和抗糖尿病的功效［6］。研究［7］顯示：口服檸檬苦素后小鼠腸道擬桿菌門(mén)和變形桿菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯增加，而雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度明顯降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯改善。但檸檬苦素對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖幼鼠脂質(zhì)代謝及腸道菌群的調(diào)控作用目前尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖幼鼠模型，探討檸檬苦素對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠脂質(zhì)代謝和腸道菌群的影響，以期為緩解高脂飲食引起的營(yíng)養(yǎng)性肥胖提供新的潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 SD大鼠85只，雄性，3周齡（剛斷乳），體質(zhì)量45～55 g，由遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黔）2021-0002。大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（溫度22℃～24℃，相對(duì)濕度55%～60%，12 h光照-黑暗循環(huán)），可自由飲水和進(jìn)食。檸檬苦素（純度＞90%）購(gòu)于美國(guó)Merck公司，普通飼料和高脂飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，QlAamp DNA Stool Mini Kit和SYBR Green PCR Kit均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，TaKaRa Ex Taq購(gòu)自日本TaKaRa Bio公司，MiSeq試劑盒購(gòu)自美國(guó)Illumina公司。AU5800全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，RM2235手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，BX53生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，NanoDrop 2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備和動(dòng)物分組 85只3周齡SD大鼠隨機(jī)分為普通飼料組（15只）和高脂飼料組（70只），其中普通飼料組幼鼠給予普通飼料喂養(yǎng)（玉米28.0%、酵母1.8%、面粉15.0%、油脂1.2%、麩皮16.0%、石粉1.0%、豆粕11.0%、碳酸氫鈣1.2%、魚(yú)粉12.0%、復(fù)合維生素2.0%、苜蓿10.0%和微量元素0.8%），高脂飼料組幼鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)（普通飼料51.9%、豬油15.0%、膽鹽0.2%、蔗糖20.0%、碳酸氫鈣1.0%、酪蛋白10.0%、石粉0.5%、膽固醇1.2%和鹽0.2%），自由飲水，持續(xù)喂養(yǎng)4周。4周后以超出普通飼料組大鼠體質(zhì)量20%作為營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)［8］，共篩選出營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠46只，隨機(jī)選取造模成功的大鼠40只分為模型組和低、中及高劑量檸檬苦素組，每組10只，從普通飼料組隨機(jī)選取10只大鼠作為對(duì)照組。低、中和高劑量檸檬苦素組大鼠分別給予12.5、25.0和50.0 mg·kg－1檸檬苦素灌胃，其他組大鼠均給予等量媒介（1.0%吐溫+0.5%CMC-Na的水溶液）灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周。給藥全程，對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其他組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，收集每只大鼠新鮮糞便于2 mL無(wú)菌試管中，－80℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，取血后乙醚麻醉處死大鼠并解剖取材。

1.3 測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量、計(jì)算李氏（Lee’s）指數(shù)和脂肪系數(shù) 給藥前后稱(chēng)量并記錄各組大鼠體質(zhì)量。處死大鼠后測(cè)量各組大鼠從鼻至肛門(mén)的長(zhǎng)度，即為體長(zhǎng)，然后打開(kāi)大鼠腹腔，取體內(nèi)脂肪（腎周、附睪旁和腸系膜周?chē)荆┓Q(chēng)質(zhì)量，根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］中的方法計(jì)算Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)。

1.4 各組大鼠血脂水平檢測(cè) 大鼠血液樣本4℃、3 000 g離心15 min，收集血清。采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯 （triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol， HDL-C）水平。

1.5 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn) 取大鼠肝臟組織用生理鹽水沖洗干凈，10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，采用手動(dòng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將組織切成4 μm厚的薄片，分別使用蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)和脂肪沉積情況。

1.6 采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)各組大鼠糞便中腸道菌群結(jié)構(gòu) 取適量大鼠糞便，采用QlAamp DNA Stool Mini Kit從各組大鼠糞便中提取DNA，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度并純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。利用TaKaRa Ex Taq對(duì)16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：正向引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGAC-3′， 反 向 引 物 5′-GGACTACTAGGGTATCTAAT-3′；PCR 反應(yīng)體系 （50 μL）：TaKaRa Ex Taq 1 μL， 10×Ex Taq buffer 5 μL，MgCl24 μL，dNTP 4 μL，DNA模板 2 μL，正向引物 （10 μmol·L－1） 和反 向 引 物 （10 μmol·L－1） 各2 μL，H2O 30 μL。PCR反應(yīng)程序 ：95 ℃ 預(yù) 變 性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段?；厥债a(chǎn)物采用SYBR Green PCR Kit通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法進(jìn)行定量分析，采用MiSeq試劑盒制備含有每個(gè)樣品2 μL的混合物，生成混合庫(kù)，送至北京諾禾致源有限公司進(jìn)行MiSeq PE300雙端測(cè)序。按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs），選取OTUs的代表性序列，采用Qiime vl.8.0軟件進(jìn)行OTU聚類(lèi)和物種注釋?zhuān)容^各組大鼠腸道菌群的物種多樣性和物種相對(duì)豐度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪系數(shù)、血脂水平和腸道菌群相對(duì)豐度均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量 藥物干預(yù)前，與對(duì)照組比較，模型組及低、中和高劑量檸檬苦素組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量檸檬苦素組大鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠體質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05），而低劑量檸檬苦素組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups（n=10，±s，m/g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups（n=10，±s，m/g）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model Limonin Low dose Medium dose High dose Body weight Before intervention 213.50±14.65 294.03±15.87*After intervention 321.07±18.45 407.20±20.16*405.33±16.64 368.21±16.29△345.90±11.63△294.43±18.52*294.84±8.47*295.12±17.92*

2.2 各組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)均明顯降低（P＜0.05），而低劑量檸檬苦素組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)Tab.2 Lee’s indexes and adipose coefficients of rats in various groups （n=10，±s）

表2 各組大鼠Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)Tab.2 Lee’s indexes and adipose coefficients of rats in various groups （n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Lee’s index Control Model Limonin Low dose Medium dose High dose 357.30±12.07 390.11±11.66*Adipose coefficient（η/%）2.14±0.22 6.28±0.69*6.26±0.58 4.39±0.21△3.02±0.46△388.92±12.22 370.48±18.43△363.51±13.67△

2.3 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG和 LDL-C水平均明顯升高 （P＜0.05），HDL-C水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平均明顯降低（P＜0.05），HDL-C水平明顯升高（P＜0.05），低劑量檸檬苦素組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Tab.3 Levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C in serum of rats in various groups[n=10，±s，cB/（mmol·L－1）]

表3 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Tab.3 Levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C in serum of rats in various groups[n=10，±s，cB/（mmol·L－1）]

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Control Model Limonin Low dose Medium dose High dose TC 1.32±0.11 2.78±0.16*TG 0.48±0.05 1.22±0.07*LDL-C 0.37±0.03 0.91±0.06*HDL-C 0.61±0.07 0.23±0.03*0.24±0.03 0.40±005△0.56±0.04△2.76±0.11 1.83±0.10△1.55±0.14△1.23±0.06 0.74±0.05△0.53±0.09△0.90±0.08 0.62±0.07△0.44±0.05△

2.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較，模型組和低劑量檸檬苦素組大鼠肝細(xì)胞大小不勻，排列不規(guī)整，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂肪變性空泡；與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠肝細(xì)胞排列較規(guī)整，脂肪變性明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of liver tissue of rats in various groups(HE，×400)

2.5 各組大鼠糞便中腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度 門(mén)水平上，大鼠腸道菌群中主要包含厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén) （Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）等。與對(duì)照組比較，模型組大鼠糞便中厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度明顯升高（P＜0.05），擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠糞便中厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度明顯降低（P＜0.05），擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度明顯升高（P＜0.05），低劑量檸檬苦素組大鼠糞便中腸道菌群門(mén)水平上相 對(duì)豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腸道菌群門(mén)水平的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of intestinal microbiota of rats in various groups at phylum level

2.6 各組大鼠糞便中腸道菌群屬水平相對(duì)豐度 屬水平上，大鼠腸道菌群中主要包含乳桿菌屬（Lactobacillus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、Odoribacter、擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）等。與對(duì)照組比較，模型組大鼠糞便中顫螺旋菌屬相對(duì)豐度明顯升高（P＜0.05），乳桿菌屬相對(duì)豐度明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，中和高劑量檸檬苦素組大鼠糞便中顫螺旋菌屬相對(duì)豐度明顯降低（P＜0.05），乳桿菌屬相對(duì)豐度明顯升高（P＜0.05），低劑量檸檬苦素組大鼠糞便腸道菌群屬水平上相對(duì)豐度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠腸道菌群屬水平的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of gut microbiota of rats in various groups at genus level

3 討 論

兒童肥胖是一種由能量不平衡引起的慢性代謝紊亂，可導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積現(xiàn)象的發(fā)生。兒童肥胖的表現(xiàn)是體質(zhì)量與身高之間的平衡被破壞，該損害是由遺傳因素、飲食習(xí)慣、體育活動(dòng)和激素水平改變等引起的［10-11］。研究［12］表明：高脂飲食是導(dǎo)致兒童肥胖的重要因素之一，過(guò)多的能量攝入會(huì)導(dǎo)致兒童肝臟受損，體內(nèi)脂質(zhì)代謝失調(diào)，脂肪堆積，從而引起肥胖，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康［13-14］。因此，控制和預(yù)防兒童肥胖是一個(gè)值得廣泛關(guān)注的重要公共健康問(wèn)題。目前，減肥藥對(duì)控制體質(zhì)量有一定的效果，但其對(duì)身體也會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，且有體質(zhì)量反彈的風(fēng)險(xiǎn)［15］。因此，迫切需要尋找預(yù)防兒童肥胖的有效藥物。

檸檬苦素是一種天然的四環(huán)三萜類(lèi)化合物，其通常來(lái)源于蕓香科和楝科植物，可從多種中藥和水果中分離得到，檸檬苦素在柑橘類(lèi)水果中含量很高［16］。檸檬苦素具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、保護(hù)肝臟和降低血脂等［17-18］。本研究通過(guò)高脂飲食建立營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，結(jié)果顯示：模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)均明顯升高，血清中TC、TG和LDL-C水平均明顯升高，HDL-C水平明顯降低，肝臟中有脂肪堆積和脂肪變性，表明營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型構(gòu)建成功；檸檬苦素干預(yù)后大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)均明顯降低，血清中血脂水平失調(diào)和肝臟中脂肪堆積情況均明顯改善，說(shuō)明檸檬苦素可調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝，改善肥胖。

腸道菌群在腸道中對(duì)物質(zhì)分解、吸收和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化起著重要的生理作用。研究［19］表明：肥胖等代謝性疾病與腸道菌群失衡有明顯相關(guān)性。FAVA等［20］研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食可導(dǎo)致人體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一些正常優(yōu)勢(shì)菌群減少甚至消失。某些細(xì)菌類(lèi)群與脂質(zhì)代謝有關(guān)，其修飾可能影響宿主的脂質(zhì)代謝和信號(hào)分子的表達(dá)［21］。有研究［22］顯示：擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的比例通常與肥胖有關(guān)，擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比率的下降與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠腸道菌群失調(diào)有關(guān)。此外，雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道益生菌相對(duì)豐度的下降可能與小鼠體內(nèi)糖脂代謝水平的變化有關(guān)［23］。因此，在肥胖和肥胖相關(guān)疾病的治療中，腸道微生物群是一個(gè)潛在的營(yíng)養(yǎng)和藥理靶點(diǎn)。然而，檸檬苦素對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用尚不清楚。16S rRNA測(cè)序是檢測(cè)腸道菌群結(jié)構(gòu)常用的方法，采用針對(duì)相鄰保守區(qū)域的引物來(lái)擴(kuò)增16S rRNA基因高度可變的區(qū)域，然后通過(guò)MiSeq測(cè)序和Qiime分析來(lái)比較各組大鼠糞便中腸道菌群結(jié)構(gòu)。本研究采用16S rRNA測(cè)序法探討檸檬苦素對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠腸道菌群的影響，結(jié)果顯示：在門(mén)水平上，高脂飲食可提高厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度，降低擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度。為進(jìn)一步探討各樣本間的差異，本研究對(duì)大鼠腸道菌群進(jìn)行屬級(jí)分析，在屬水平上，高脂飲食可提高顫螺旋菌屬相對(duì)豐度，降低乳桿菌屬相對(duì)豐度，而檸檬苦素干預(yù)后大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于正常水平。因此，檸檬苦素對(duì)大鼠腸道菌群失調(diào)有明顯的改善作用。

綜上所述，檸檬苦素干預(yù)可調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠脂質(zhì)代謝紊亂和腸道菌群失調(diào)，降低大鼠體質(zhì)量、血脂水平和脂肪堆積，從而改善大鼠肥胖。本研究為檸檬苦素作為一種生物活性成分在改善兒童肥胖中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。