高糖通過miR-125b對小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用

沈 鑫,劉 洋,陳泓宇,張 潔,程慶礫,楊 光

（解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心腎臟病科 國家老年醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853）

2型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）是最常見的慢性代謝性疾病之一，其發(fā)病率逐年升高，2019年全球糖尿病患病率為9.3%，患病人數(shù)約4.63億例，預(yù)計(jì)到2045年患病人數(shù)將上升至7億例［1］。研究［2］顯示：在糖尿病人群中，基于糖脂代謝紊亂等引起機(jī)體的慢性低水平炎癥狀態(tài)是造成糖尿病靶器官損傷的重要病因，在該病理生理過程中，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的激活和其向促炎表型極化發(fā)揮了重要作用。單核細(xì)胞進(jìn)入組織后可以隨周圍環(huán)境的改變分化為不同類型的巨噬細(xì)胞，包括經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞M1型（促炎型）和替代性活化巨噬細(xì)胞M2型（抗炎型），即巨噬細(xì)胞極化［3］。研究［4-5］顯示：糖尿病的微環(huán)境可能會改變巨噬細(xì)胞M1/M2的極化狀態(tài)，從而造成機(jī)體的微炎癥狀態(tài)。

微小 RNAs（microRNAs，miRNAs） 是一種小分子非編碼RNA，作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，其不編碼蛋白質(zhì)，但在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。某些miRNAs可以參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，提示miRNAs可能是改善糖尿病微炎癥環(huán)境的有效靶點(diǎn)。有研究［6-7］顯示：miR-125b可能是調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的重要靶點(diǎn)，且與糖尿病微血管病變有密切關(guān)聯(lián)。目前國內(nèi)外對于miR-125b調(diào)控巨噬細(xì)胞極性的研究報(bào)道較少，本研究擬探討高糖對巨噬細(xì)胞極化改變和miR-125b表達(dá)的影響，并進(jìn)一步評估m(xù)iR-125b對巨噬細(xì)胞極性的調(diào)控作用，為改善糖尿病患者微炎癥環(huán)境提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中國科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青-鏈霉素和無糖RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，D-葡萄糖購自美國Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和TRIzol購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購自日本TOYOBO公司，小鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）和白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β， IL-1β） 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞流式APC anti-mouse CD86和PE anti-mouse CD206購自北京Biolegend公司，IL-1β和IL-10抗體購自美國CST公司，干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5） 和Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）抗體購自英國Abcam公司，過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）和干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4） 抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司，GAPDH購自杭州賢至生物有限公司。低速離心機(jī)（5702R）購自德國Eppendorf公司，酶標(biāo)儀（Thermo MULTISKAN MK3） 購 自 美 國Thermo公 司，CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO-MCO-15AC）購自日本三洋公司，倒置顯微鏡（OLYMPUS-IX51）購自北京普瑞賽司儀器有限公司、流式細(xì)胞儀（Beckmancoulter-cytoFLEX） 和 RT-qPCR 儀（ABI-QuantStudio 6）購自上海土森視覺科技有限公司，水平電泳儀（JY300）和紫外分析儀（JY02S）購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，電轉(zhuǎn)儀（DYCZ-40）購自北京六一儀器廠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 小鼠RAW264.7細(xì)胞采用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代。取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，按照不同實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。①正常對照（NG）組：RAW264.7細(xì)胞+正常培養(yǎng)基（5.6 mmol·L－1葡萄糖）；②正糖抑制 （NG+miR-125b inhibitor）組：RAW264.7細(xì)胞+正常培養(yǎng)基+miR-125b inhibitor沉默miR-125b表達(dá)；③高糖刺激（HG）組：RAW264.7細(xì)胞+高糖培養(yǎng)基 （30 mmol·L－1葡萄糖）；④高糖抑制 （HG+miR-125b inhibitor）組：RAW264.7細(xì)胞+高糖培養(yǎng)基+miR-125b inhibitor沉默miR-125b表達(dá)。其中NG+miR-125b inhibitor組和HG+miR-125b inhibitor組通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法沉默miR-125b的表達(dá)，miR-125b inhibitor由漢恒生物科技（上海）有限公司合成，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟進(jìn)行操作。各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度葡萄糖刺激培養(yǎng)72 h后留取細(xì)胞和細(xì)胞上清進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 RT-qPCR法檢測細(xì)胞中M1/M2極化相關(guān)因子mRNA和miR-125b表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行mRNA定量分析。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。引物序列：GAPDH，上游引物5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′， 下 游 引 物 5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′； IRF4， 上 游 引 物 5′-TCCCCATTGAGCCAAGCATA-3′， 下 游 引 物 5′-TCCTCTGTCCATTGTCGTCC-3′；IL-10，上游引物5′-GCTGGACAACATACTGCTAACCG-3′，下游引 物 5′-CACAGGGGAGAAATCGATGACAG-3′；IL-1β， 上 游 引 物 5′-GTCTTTCCCGTGGACCTTC-3′， 下 游 引 物 5′-ATCTCGGAGCCTGTAGTGC-3′；PPAR，上游引物 5′-AGGGCGATCTTGACAGGAAA-3′， 下 游 引 物 5′-CGAAACTGGCACCCTTGAAA-3′； TLR4， 上 游 引 物 5′-GCCCTACCAAGTCTCAGCTA-3′， 下 游 引 物 5′-CTGCAGCTCTTCTAGACCCA-3′；IRF5，上游引物5′-TGTCCCAGACCCAAATCTCC-3′， 下 游 引 物5′-CTCTAGGTCCGTCAAAGGCA-3′； U6， 上游引物 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游 引 物 5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；miR-125b， 上 游 引 物 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAAGT-3′， 下 游 引 物 5′-TGCGCTCCCTGAGACCCTAACT-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 變性15 s，58℃、 20 s，72℃ 延伸30 s，循環(huán)40次；95℃終末延伸10 s，4℃保持。M1/M2極化相關(guān)基因以GAPDH為內(nèi)參，miR-125b以U6為內(nèi)參，采用 2－△△Ct法計(jì)算 M1/M2極化相關(guān)因子mRNA和miR-125b表達(dá)水平。

1.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清中相關(guān)細(xì)胞因子水平 細(xì)胞分組和處理同上。細(xì)胞離心后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞上清中IL-10、IL-12、IL-6和IL-1β水平，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中M1/M2極化標(biāo)記物CD86和CD206陽性表達(dá)率 細(xì)胞分組和處理同上。各組RAW264.7細(xì)胞消化后離心，棄上清，加 PBS緩沖液重懸，1 500 r·min－1離心 5 min，PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，細(xì)胞分為2份，一份加入200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，每流式小管添加CD86（0.25 μg/次），4℃孵育 30 min；另一份CD206孵育前進(jìn)行破膜處理，再添加CD206（0.5 μg/次），4℃孵育 30 min； PBS緩沖液再次洗滌2次，PBS緩沖液重懸后采用流式細(xì)胞儀檢測CD86和CD206陽性表達(dá)率。

1.6 Western blotting法檢測細(xì)胞中M1/M2極化相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總蛋白后，測定蛋白濃度。加樣后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和脫脂牛奶室溫封閉后，用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗PPAR（1∶500）、IL-1β（1∶500）、IRF5（1∶500）、TLR4（1∶1 000）、IRF4（1∶1 000）、IL-10（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST充分洗膜5～6次，每次5 min，二抗37℃孵育2 h，再次洗膜5～6次，每次5 min，ECL顯色，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中miR-125b及IL-10、IL-1β、TLR4、IRF4、PPAR 和 IRF5 mRNA 表達(dá)水平，細(xì)胞上清中IL-10、IL-12、IL-6和IL-1β水平，細(xì)胞表面分子CD86和CD206陽性表達(dá)率，細(xì)胞中IRF4、PPAR、 IL-10、IRF5、TLR4和IL-1β蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NG組和HG組細(xì)胞中IL-10、IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞上清中IL-10、IL-1β、IL-12和IL-6水平 RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：高糖處理72 h后，與NG組比較，HG組細(xì)胞中M2相關(guān)標(biāo)記物IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）， M1相關(guān)標(biāo)記物IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖1。ELISA法檢測結(jié)果顯示：高糖處理72 h后，與NG組比較，HG組細(xì)胞上清中IL-10水平明顯降低（P＜0.01），M1相關(guān)標(biāo)記物IL-1β、IL-12和IL-6水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖1 2組細(xì)胞中IL-10、IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of IL-10,IL-1β,and TLR4 mRNA in cells in two groups

圖2 ELISA法檢測2組細(xì)胞上清中M1/M2相關(guān)因子水平Fig.2 Levels of M1/M2 related factors in cells in two groups detected by ELISA

2.2 NG組和HG組細(xì)胞中CD86和CD206陽性表達(dá)率 與NG組（16.43%±1.39%）比較，高糖處理72 h后，HG組細(xì)胞中CD86陽性表達(dá)率（66.46%±1.69%） 明 顯 升 高 （P＜0.01）； 與NG組（8.42%±0.87%）比較，高糖處理72 h后，HG組細(xì)胞中CD206陽性表達(dá)率（3.98%±0.53%）明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測2組細(xì)胞中CD86和CD206陽性表達(dá)率Fig.3 Positive expression rates of CD86 and CD206 in cells in two groups detected by flow cytometry

2.3 各組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平 與NG組比較，HG組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；沉默miR-125b表達(dá)后，分別與NG組和HG組比較，NG+miR-125b inhibitor組和HG+miR-125b inhibitor組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of miR-125b in cells in various groups

2.4 沉默miR-125b表達(dá)后各組細(xì)胞中IL-10、IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞上清中IL-10、IL-1β、IL-12和IL-6水平 RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：沉默miR-125b表達(dá)后，分別與NG組和HG組比較，NG+miR-125b inhibitor組和HG+miR-125b inhibitor組細(xì)胞中IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01），IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平均明顯降低 （P＜0.05或 P＜0.01）。見圖 5。ELISA法檢測結(jié)果顯示：沉默miR-125b表達(dá)后，分別與NG組和HG組比較，NG+miR-125b inhibitor組和HG+miR-125b inhibitor組細(xì)胞上清中IL-10水平均明顯升高 （P＜0.01），IL-1β、IL-12和IL-6水平均明顯降低（P＜0.01）。見圖6。

圖5 RT-qPCR法檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞中IL-10、IL-1β和TLR4 mRNA表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of IL-10,IL-1β,and TLR4 mRNA in cells in various groups after silencing miR-125b detected by RT-qPCR method

圖6 ELISA法檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞上清中IL-10、IL-1β、IL-12和IL-6水平Fig.6 Levels of IL-10,IL-1β,IL-12 and IL-6 in cell supernatant in various groups after silencing miR-125b detected by ELISA

2.5 沉默miR-125b表達(dá)后各組細(xì)胞中CD86和CD206陽性表達(dá)率 沉默miR-125b表達(dá)后，分別與NG組和HG組比較，NG+miR-125b inhibitor組和HG+miR-125b inhibitor組細(xì)胞中CD86陽性表達(dá)率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），CD206陽性表達(dá)率明顯升高（P＜0.01）。見圖7和8。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞中CD86陽性表達(dá)率Fig.7 Positive expression rates of CD86 in cells in various groups after silencing miR-125b detected by flow cytometry

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞中CD206陽性表達(dá)率Fig.8 Positive expression rates of CD206 in cells in various groups after silencing miR-125b detected by flow cytometry

2.6 各組細(xì)胞中IRF4、PPAR和IRF5 mRNA表達(dá)水平及 IRF4、PPAR 、IL-10、IRF5、TLR4 和 IL-1β蛋白表達(dá)水平 RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示：與NG組比較，高糖處理72 h后，HG組細(xì)胞中IRF4和PPAR mRNA表達(dá)水 平明顯降 低 （P＜0.01），IRF5 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；沉默miR-125b表達(dá)后，分別與NG和HG組比較，NG+miR-125binhibitor組 和 HG+miR-125b inhibitor組中IRF4及PPAR mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01），IRF5 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖9。

圖9 RT-qPCR法檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞中IRF4、PPAR和IRF5 mRNA表達(dá)水平Fig.9 Expression levels of IRF4,PPAR,IRF5 mRNA after silencing miR-125b in cells in various groups detected by RT-qPCR method

Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與NG組比較，高糖處理72 h后，HG組細(xì)胞中IRF4、PPAR和IL-10蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），IRF5、TLR4和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；沉默miR-125b表達(dá)后，與NG組比較，NG+miR-125b inhibitor組 細(xì) 胞 中 IRF4、PPAR和IL-10蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），IRF5、TLR4和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與HG組比較，HG+miR-125b inhibitor組細(xì)胞中IRF4、PPAR和IL-10蛋白表達(dá)水平明顯升高；TLR4和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖10和11。

圖10 Western blotting法檢測沉默miR-125b后各組細(xì)胞中M1/M2極化相關(guān)因子蛋白表達(dá)電泳圖Fig.10 Electrophoregram of expressions of M1/M2 polarization-related factor proteins in cells in various groups after silencing miR-125b detected by Western blotting method

圖11 沉默miR-125b后各組細(xì)胞中M1/M2極化相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平Fig.11 Expression levels of M1/M2 polarization-related factor proteins in cells in various groups after silencing miR-125b

3 討 論

糖尿病是最常見的慢性病之一，也是全世界發(fā)病率和死亡率較高的疾病。糖尿病的血糖升高、代謝紊亂和胰島素抵抗等核心病理生理改變，可同時(shí)造成機(jī)體的慢性低水平炎癥狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致T2DM靶器官損傷。研究者［8］認(rèn)為：炎癥微環(huán)境可能是糖尿病腎病和動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。另有研究［2］表明：與非糖尿病患者比較，糖尿病患者體內(nèi)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-6等促炎細(xì)胞因子的水平升高，同時(shí)外周血中Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2） 和 TLR4 mRNA 表達(dá)水平也明顯升高，且上述炎癥指標(biāo)與T2DM患者中胰島素抵抗水平密切相關(guān)。導(dǎo)致機(jī)體微炎癥狀態(tài)的機(jī)制包括缺氧、細(xì)胞死亡、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑、胰島素抵抗、脂肪因子和趨化因子作用等［9］。

在T2DM患者體內(nèi)的微炎癥狀態(tài)中，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的激活和極化發(fā)揮了重要作用。巨噬細(xì)胞極化是指巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)并發(fā)揮不同功能作用的過程。按照表型特點(diǎn)和分泌的細(xì)胞因子可將巨噬細(xì)胞分為M1和M2 2種極化類型，其中M1極化為促炎表型，可以通過INF-γ或脂多糖激活，高表達(dá)IL-12、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α、CD86、TLR4和組織相容復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ， MHC Ⅱ）等［10］，可分泌TNF-α、一氧化氮、超氧化物和IL-1等細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織損傷；而M2極化呈現(xiàn)出抗炎表型，可以通過白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）或白細(xì)胞介素3（interleukin-3，IL-3）激活，高表達(dá)IL-10、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、類幾丁質(zhì)酶3樣分子3、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） 和 CD206等，可以分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子，在機(jī)體的損傷修復(fù)中具有重要的作用［3，11］。M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥是導(dǎo)致T2DM患者胰島素抵抗和β細(xì)胞功能異常的關(guān)鍵。在胰島炎癥狀態(tài)時(shí)，巨噬細(xì)胞會極化為M1型，同時(shí)分泌各種炎癥細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致局部和全身炎癥，胰腺β細(xì)胞功能異常以及肝臟、脂肪和肌肉骨骼組織中的胰島素抵抗［12］。

巨噬細(xì)胞的極化是一個(gè)高度動態(tài)的過程，巨噬細(xì)胞不會保持于單一激活狀態(tài)［13］，巨噬細(xì)胞的極化表型可以在生理和病理?xiàng)l件下逆轉(zhuǎn)［14］。在糖尿病的微炎癥環(huán)境中，巨噬細(xì)胞通常向M1表型極化。研究［15］顯示：用晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs） 處 理Ana-1巨噬細(xì)胞會使細(xì)胞中IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)水平降低，提示巨噬細(xì)胞向M1促炎表型轉(zhuǎn)化。本研究在體外評估了高糖刺激對小鼠巨噬細(xì)胞極性改變的影響，結(jié)果表明：高糖微環(huán)境可促使巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)變。有研究者［16］發(fā)現(xiàn)：小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞在 25 mmol·L－1葡萄糖培養(yǎng)基中隨著時(shí)間的推移，iNOS表達(dá)上調(diào)，而MR（M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）表達(dá)下調(diào)。另有研究［17］顯示：與非糖尿病組比較，糖尿病患者肝組織在基線和缺血/再灌注后M1標(biāo)志物表達(dá)水平升高，M2標(biāo)志物表達(dá)水平降低，表明高血糖可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，抑制向M2極化，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，從而加劇肝臟的缺血/再灌注損傷。但高糖引起M1極化的分子機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示：經(jīng)高糖培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化的同時(shí)，miR-125b表達(dá)水平也明顯升高。miR-125b可能是調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的重要靶點(diǎn)，有研究［6］報(bào)道：過表達(dá)miR-125b后巨噬細(xì)胞處于激活狀態(tài)，刺激T淋巴細(xì)胞，并且增加其對IFN-γ的反應(yīng)性，該作用主要是通過抑制IRF4表達(dá)介導(dǎo)的。IRF4是促進(jìn)M2激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，巨噬細(xì)胞的TLRs被激活后可上調(diào)去甲基化酶—含jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白3（jumonji domain-containing protein 3，jmjd3）的表達(dá)，IRF4是jmjd3的靶基因，jmjd3的缺失雖然不影響M1型巨噬細(xì)胞極化，但M2型巨噬細(xì)胞極化受到抑制［18］。當(dāng)小鼠巨噬細(xì)胞被IFNγ誘導(dǎo)時(shí)，miR125b表達(dá)的增加會抑制其靶基因IRF4表達(dá)，表現(xiàn)為M1型巨噬細(xì)胞增多［19］。最近一項(xiàng)研究［20］顯示：T2DM患者中，IRF5基因表達(dá)上調(diào)且巨噬細(xì)胞向M1促炎型方向極化，同時(shí)炎性因子 CD11c、IL-1β、TNF-α、IL-6 和單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)增加。本研究為了評估m(xù)iR-125b的調(diào)控作用，沉默miR-125b的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組比較，沉默miR-125b表達(dá)后，NG組和HG組細(xì)胞中M1相關(guān)標(biāo)記物均明顯降低，而M2相關(guān)標(biāo)記物均明顯升高，提示沉默miR-125b表達(dá)，可部分逆轉(zhuǎn)高糖刺激引起巨噬細(xì)胞向M1表型的轉(zhuǎn)化；沉默miR-125b后，高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IRF4和PPAR降低作用被逆轉(zhuǎn)，而IRF5表達(dá)則降低，提示高糖可能通過促進(jìn)miR-125b表達(dá)，進(jìn)而影響IRF4、PPAR和IRF5的表達(dá)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)變。M1巨噬細(xì)胞表型受信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋 白 1 （signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和IRF5控制，而M2巨噬細(xì)胞表型受信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）、IRF4和 PPARγ控制［21］。研究［22］表明：PPARγ激活是M2巨噬細(xì)胞成熟所必需的，缺乏PPARγ對M2巨噬細(xì)胞極化有抵抗力并能夠促進(jìn)胰島素抵抗，而PPARγ可能通過IL-4-STAT6軸的作用來控制M2巨噬細(xì)胞表型。有研究［7］顯示：miR-125b可能與糖尿病微血管病變有密切關(guān)聯(lián)，上調(diào)miR-125b表達(dá)能夠促進(jìn)基質(zhì)礦化，降低血管彈性，加速血管硬化，從而加重微血管損害，miR-125b還可以通過靶基因Suv39h1蛋白來調(diào)控糖尿病小鼠炎癥因子的釋放。miR-125b的高表達(dá)也與敗血癥患者的疾病嚴(yán)重程度、炎癥和死亡率增加有關(guān)聯(lián)［23］。

綜上所述，高糖刺激會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促炎M1表型轉(zhuǎn)變，同時(shí)miR-125b表達(dá)水平升高；沉默miR-125b的表達(dá)，則可部分逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1的表型轉(zhuǎn)化。miR-125b可能是逆轉(zhuǎn)高糖引起的巨噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化的重要靶點(diǎn)，通過沉默miR-125b來調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，對于改善糖尿病患者的微炎癥狀態(tài)和減少并發(fā)癥發(fā)生具有很大研究潛力。