CD47敲除對小鼠顱腦創(chuàng)傷后血管生成的影響及其分子機制

陳可欣,屈東昊,劉曉龍,陳 勃,張舒巖

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院實驗平臺，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷外科，吉林 長春 130021）

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是國內(nèi)外嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，不僅伴隨著諸多復(fù)雜的創(chuàng)傷后遺癥，還會導(dǎo)致較高的致殘率和致死率［1-2］。目前，針對TBI潛在干預(yù)靶點的研究已經(jīng)十分廣泛，但真正轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的可行性治療靶點很少。近年來已有相關(guān)研究［3-4］開始探索血管功能改善在TBI后修復(fù)神經(jīng)功能障礙中的作用。血管新生可以恢復(fù)缺血區(qū)域的血供，挽救損傷的神經(jīng)元，已成為TBI治療的一個新的研究方向［5］。整合素 相 關(guān) 蛋 白 （integrin-associated protein，IAP）CD47，是一種細(xì)胞表面受體，也稱為“don’t eat me”信號，廣泛表達于各種細(xì)胞［6-7］。既往研究［8］表明：CD47在動脈粥樣硬化斑塊、中風(fēng)和血管老化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD47可被血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）激活，導(dǎo)致一氧化氮（nitric oxide，NO）生成從而抑制信號傳導(dǎo)。CD47/TSP-1復(fù)合物通過促進活性氧的產(chǎn)生而引起血管疾?。?-9］。到目前為止，關(guān)于CD47在TBI中作用的研究還十分有限。因此，本文作者利用CD47敲除小鼠研究TBI后小鼠腦組織血管生成情況和CD47敲除對小鼠TBI后血管生成的影響，以期為TBI的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2019-0001；CD47敲除同時內(nèi)源性表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 的 C57BL/6 小 鼠（CD47KO-GFP小鼠），動物使用許可證號：SYXK（吉）-2022-0001；均為8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由吉林大學(xué)第一醫(yī)院動物中心繁育獲得。小鼠飼養(yǎng)在吉林大學(xué)第一醫(yī)院動物中心，環(huán)境保持恒定溫度（21℃±3℃）和恒定濕度（55%±5%），并給予12 h的光照/黑暗循環(huán)。所有涉及動物的程序均經(jīng)吉林大學(xué)實驗動物委員會批準(zhǔn)。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（phtelet endothelial cell adhesion molecule-l， PECAM-1） 即 CD31抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab7388），血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）抗體購自美國CST公司 （貨 號：2479）， 核 因 子 κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）抗體購自美國Affinity公司（貨號：AF5006），Alexa Fluor 594二抗和DAPI均購自美國Absin公司（貨號：abs20021和abs933），M131培養(yǎng)基購自美國Gibco-lnvitrogen公司。液壓顱腦打擊儀（PCI 3000）購自美國弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)工程部，熒光Nikon Ti-E倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，BX53光學(xué)顯微鏡和Ⅸ73熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗動物分組 小鼠隨機分為假手術(shù)組和TBI組，每組20只，造模完成后行腦含水量檢測、血腦屏障通透性檢測、HE染色和免疫熒光實驗；另各取10只野生型C57BL16小鼠（野生型組）和CD47KO-GFP小鼠 （CD47KO-GFP組），TBI造模后提取腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞行免疫熒光檢測。

1.3 可控性液壓顱腦打擊儀制備小鼠TBI模型 采用液壓顱腦打擊儀建立小鼠TBI模型。小鼠采用4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉和1.5%異氟烷維持麻醉后，剃除頭部毛發(fā)，俯臥位固定于腦立體定向儀上，用碘伏消毒后沿中線切開頭皮，分離骨膜，暴露顱骨。以前囟后2.0 mm、中線右側(cè)旁開2.0 mm為中心，鉆直徑3.0 mm圓形骨窗（保持硬腦膜的完整性）。骨窗建立后，將液壓沖擊器的沖擊管口小心放置在骨窗內(nèi)，周圍用牙托粉固定沖擊管并密閉管口周邊縫隙。調(diào)整擺錘與垂直方向的角度，造成顱腦損傷。注意維持小鼠體溫，待生命體征平穩(wěn)后縫合頭皮。

1.4 小鼠腦組織含水量檢測 采用干/濕比重法檢測小鼠腦組織含水量。模型建立后24 h，每組選取5只小鼠處死。取腦組織，棄去小腦和雙側(cè)嗅球。沿大腦中線將大腦分成正常側(cè)和打擊側(cè)。用濾紙吸干表面水分，先稱量大腦半球濕質(zhì)量后，置于110℃恒溫箱中烘烤24 h至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量。腦含水量=（腦濕質(zhì)量－腦干質(zhì)量）/腦濕質(zhì)量×100%。

1.5 伊文思藍（Evans blue，EB）注射法檢測小鼠血腦屏障通透性 術(shù)后24 h，每組取5只小鼠，經(jīng)4%水合氯醛麻醉，股靜脈注射2%EB生理鹽水液3 mL·kg－1。2 h后向左心室灌注生理鹽水至右心房流出無色液體，斷頭取腦，剝離干凈軟腦膜和血凝塊，左右半球分開，濾紙吸干右半球水分，取病灶區(qū)腦組織，稱濕質(zhì)量后置于盛有3 mL甲酰胺的試管中，加上橡皮塞置37℃恒溫水浴箱中。48 h后吸取上清液，紫外分光光度計（波長=632 nm）進行比色，測得吸光度（A）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算EB水平（μg·g－1）。以小鼠腦組織中EB水平代表血腦屏障通透性。

1.6 HE染色觀察小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn) 在TBI模型建立后24 h，每組選取5只小鼠，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后打開胸腔，先用生理鹽水進行心臟灌注，觀察肝臟逐漸變?yōu)榘咨珵橹?，再?%多聚甲醛進行心臟灌注，待四肢抽動后斷頭取腦，將腦組織放在4%甲醛中固定24 h，石蠟包埋后制成切片，進行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)參考文獻［10］中的方法分離CD47KO-GFP組小鼠和野生型組小鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并立即培養(yǎng)。使用含5%MVGS的M131培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每4 d以1∶3傳代培養(yǎng)。將CD47KO-GFP組小鼠和野生型組小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，通過光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞生長狀態(tài)、再生情況和血管生成情況。

1.8 免疫熒光染色法檢測小鼠腦組織中VEGFR1和CD31蛋白表達水平及NF-κB在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的活化情況 小鼠腦組織用4%多聚甲醛固定并用0.3%Triton X-100打孔后，用5%正常BSA封閉。用CD31和VEGFR1抗體在4℃下過夜后，與偶聯(lián)IgG的Alexa Fluor488二抗和偶聯(lián)IgG的Alexa Fluor 594二抗室溫90 min。洗滌3次后，用DAPI染色細(xì)胞核15 min。通過熒光Nikon Ti-E倒置顯微鏡觀察染色載玻片。根據(jù)紅色和綠色熒光的表達強度和分布情況，通過Image J軟件計算小鼠腦組織中單位面積內(nèi)VEGFR1和CD31蛋白表達水平。

使用PBS緩沖液清洗小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞3次后，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min。加入0.3%Triton X-100室溫透化10 min，之后加入5%血清進行封閉1 h。然后加入5%免稀釋的一抗，4℃過夜。PBS緩沖液清洗3次后加入5%免稀釋的二抗，室溫放置90 min。PBS緩沖液洗滌3次后，用DAPI染色細(xì)胞核15 min。通過熒光Nikon Ti-E倒置顯微鏡觀察染色載玻片，觀察NF-κB的活化情況。當(dāng)NF-κB分布于細(xì)胞漿時處于非活化狀態(tài)，當(dāng)NF-κB進入細(xì)胞核時處于活化狀態(tài)。

1.9 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實驗 內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實驗可以檢驗內(nèi)皮細(xì)胞的能力［11-13］。1∶1混合CD47KO-GFP組小鼠和野生型組小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，計算單位面積中2組小鼠參與形成管狀結(jié)構(gòu)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞百分率，評估二者的血管生成能力。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組小鼠腦組織含水量、EB水平、VEGFR1和CD31蛋白表達水平及小鼠腦組織中參與血管生成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞百分率均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠腦組織含水量和EB水平 與假手術(shù)組比較，TBI組小鼠健側(cè)腦組織含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），TBI組小鼠打擊側(cè)腦組織含水量明顯增加（P＜0.01）。見表1。假手術(shù)組和TBI組小鼠 腦 組 織 中 EB水 平 分 別 為 （2.63±0.53） 和（11.62±1.29） μg·g－1，與假手術(shù)組比較，TBI組小鼠腦組織中EB水平明顯升高（P＜0.05），小鼠腦組織EB染色明顯增強。見圖1。

圖1 2組小鼠腦組織EB染色結(jié)果(Bar=0.5 cm)Fig.1 Results of EB staining of brain tissue of mice in two groups(Bar=0.5 cm)

表1 2組小鼠腦組織含水量Water contents in brain tissue of mice in two groups（n=5，±s,η/%）

表1 2組小鼠腦組織含水量Water contents in brain tissue of mice in two groups（n=5，±s,η/%）

*P＜0.01 vs sham operation group.

Group Sham operation TBI Injured side 75.02±0.67 80.40±0.68*Water content Normal side 74.99±0.43 75.14±0.41

2.2 2組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn) 假手術(shù)組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常；TBI組小鼠腦組織原有的腦組織結(jié)構(gòu)無法清晰辨認(rèn)，細(xì)胞核濃染色，出現(xiàn)細(xì)胞核周圍環(huán)形低染色甚至空白染色區(qū)，出血點明顯。見圖2。

圖2 2組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)（Bar=200 μm）Fig.2 Pathomorphology of brain tissue of mice in two groups（Bar=200 μ m）

2.3 2組小鼠腦組織中VEGFR1和CD31蛋白表達水平 免疫熒光染色檢測， TBI后24 h，假手術(shù)組小鼠腦組織中少見VEGFR1和CD31陽性的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，TBI組小鼠腦組織中VEGFR1和CD31蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3和4。

圖3 免疫熒光染色法檢測2組小鼠腦組織中VEGFR1和CD31的表達情況（Bar=200 μm）Fig.3 Expressions of VEGFR1 and CD31 in brain tissue of mice in two groups detected by immunofluorescence staining assay（Bar=200 μm）

圖4 2組小鼠腦組織中VEGFR1(A)和CD31(B)蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of VEGFR1(A)and CD31(B)proteins in brain tissue of mice in two groups

2.4 2組小鼠腦組織中參與血管生成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞百分率 與野生組比較，CD47KO-GFP組小鼠腦組織中參與血管生成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞百分率明顯增加（P＜0.05）。見圖5和6。圖5A為2組小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h后的明場圖像，圖5B為在熒光顯微鏡下對圖5A中GFP陽性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進行觀測，圖5C為A與B疊加后的圖片（Merge）。

圖5 熒光顯微鏡下觀察2組小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)情況（Bar=200 μm）Fig.5 Co-culture of cerebral microvascular endothelial cells in two groups observed under fluorescence microscope（Bar=200 μm）

圖6 2組小鼠腦組織中參與血管生成的微血管內(nèi)皮細(xì)胞百分率Fig.6 Percentages of microvascular endothelial cells participating in angiogenesis in brain tissue of mice in two groups

2.5 2組小鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB活化情況 免疫熒光染色檢測，野生型組小鼠源的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB既存在于細(xì)胞漿中又存在于細(xì)胞核內(nèi)，即NF-κB處于活化狀態(tài)；CD47 KO-GFP組小鼠源的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB大部分存在于細(xì)胞漿中，幾乎不存在于細(xì)胞核中，即NF-κB處于非活化狀態(tài)。見圖7。

圖7 免疫熒光染色法檢測2組小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB的活化狀態(tài)（Bar=200 μm）Fig.7 Activation of NF-κB in brain microvascular endothelial cells of mice in two groups detected by immunofluorescence staining assay（Bar=200 μm）

3 討 論

TBI是公共衛(wèi)生問題的巨大挑戰(zhàn)。但在近幾十年中針對TBI的研究能夠成功轉(zhuǎn)化到臨床的極少［14］。腦外傷伴隨的血管剪切性損傷破壞了血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管源性的腦組織水腫，引起顱內(nèi)壓升高［15］。血管網(wǎng)絡(luò)是維持腦組織代謝和神經(jīng)功能的基礎(chǔ)［16］，腦血管功能障礙普遍存在于所有TBI相關(guān)損傷中［17］，TBI后損傷的脈管系統(tǒng)會試圖進行修復(fù)。本研究結(jié)果顯示：TBI后小鼠VEGFR1和CD31雙陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多并且分布和表達情況一致。VEGFR1是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在控制傷口愈合和維持血管通透性等過程發(fā)揮重要作用。CD31是內(nèi)皮標(biāo)志物之一，增強的CD31表達可誘導(dǎo)血管生成。TBI發(fā)生后，二者表達同時上調(diào)不僅可以促進損傷的血腦屏障恢復(fù)，還可以促進側(cè)支循環(huán)的重建，有利于神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)。

CD47與TSP-1結(jié)合可抑制NO和VEGFR1的促血管生成作用，并引起由缺氧、缺血和再灌注引起的組織損傷。目前已有多項研究［18-21］通過CD47KO小鼠分析CD47在損傷組織中的作用：CD47敲除可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［19］，提高暴露于輻射下小鼠的存活率，還可減輕多壁碳納米管暴露后導(dǎo)致的肺部微血管功能障礙。本研究結(jié)果顯示：CD47敲除可使小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力增強。CD47與TSP-1結(jié)合抑制VEGFR2活化及其下游基因的表達，但不抑制VEGF與VEGFR2結(jié)合，最終導(dǎo)致新血管形成受到抑制［8］。此外，TSP-1/CD47還可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞中的關(guān)鍵血管生成標(biāo)志物進而抑制血管生成［22］。還有研究［23］顯示：TSP-1/CD47 可以影響 NF-κB/激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的激活，造成炎癥反應(yīng)的改變。本研究結(jié)果證實了CD47KO小鼠NF-κB的表達和分泌受抑制。NF-κB是胞內(nèi)重要的炎癥因子啟動基因。當(dāng)NF-κB信號受到抑制時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)也受到抑制［24-26］。已有研究［27］證實：在肺癌細(xì)胞中腫瘤壞死 因 子 α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） /NF-κB信號通路的表達受CD47表達的調(diào)控。因此推測TBI后小鼠腦組織中CD47KO抑制損傷腦組織炎癥因子啟動基因（NF-κB）活性，進而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從另一方面改善TBI的愈后。

綜上所述，小鼠TBI后血腦屏障通透性明顯增加，損傷腦組織的血管生成增強，CD47敲除可促進血管生成，抑制NF-κB的活性，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。因此，通過對CD47的干預(yù)以促進腦微血管上皮細(xì)胞的新生，CD47敲除有可能成為治療早期TBI并逆轉(zhuǎn)TBI患者神經(jīng)功能損傷的有效方法。