5種消毒劑對(duì)玉米種子萌發(fā)及其幼苗生長的影響

季鴻飛， 楊國平,3， 張 琇， 吳凱華， 沈婷婷， 齊玉璽

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 寧夏 銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 銀川 750021；3.寧夏五豐農(nóng)業(yè)科技有限公司， 銀川 750021)

播種前使用消毒劑處理種子是一種必要的作物綜合管理方法[1]。消毒劑處理種子會(huì)提高種子出苗率、種子活力以及防止種子和土壤傳播真菌病原體[2]，然而消毒劑對(duì)種子發(fā)育也有一定的影響。種子消毒劑會(huì)影響種子淀粉酶活性，進(jìn)而引起種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的變化[3]。有些消毒劑對(duì)作物發(fā)育會(huì)造成一定的損傷，為避免來自消毒劑的傷害，作物會(huì)上調(diào)某些關(guān)鍵酶，如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等，防止過量活性氧和過氧化氫導(dǎo)致的膜質(zhì)變質(zhì)，并減少有害物質(zhì)如丙二醛(MDA)等的積累，增強(qiáng)作物的抗氧化能力[4]。

玉米是中國第一大糧食作物，2010—2020年間，玉米年均產(chǎn)量增長率為2.66%[5]。由于玉米耐貧瘠、抗旱，對(duì)環(huán)境要求低，在中國的種植面積僅次于小麥。國內(nèi)玉米主要用于飼料、工業(yè)和口糧，其中飼料需求和工業(yè)需求約占90%以上[6]，玉米產(chǎn)業(yè)對(duì)保障國家糧食安全具有重要的意義。玉米種子表面的病害菌會(huì)影響種子的萌發(fā)，通常玉米在種植前需要進(jìn)行種子消毒，種子消毒是玉米健康種植的重要環(huán)節(jié)之一。目前，對(duì)于玉米種子消毒的研究大多是在消毒效果和萌發(fā)指標(biāo)上，對(duì)玉米幼苗生長以及相關(guān)酶活性影響的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)以NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚和乙醇等5種消毒劑對(duì)玉米種子進(jìn)行浸種消毒，分析消毒劑對(duì)玉米種子消毒效果、萌發(fā)指標(biāo)、幼苗生長和生理生化的影響，旨在篩選出對(duì)玉米種子效果最佳的消毒劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為寧單33號(hào)玉米種子。種子消毒劑分別為6% NaClO溶液，1% CuSO4溶液，0.1% HgCl2溶液，4%苯酚溶液，75%乙醇溶液。種子培養(yǎng)基為0.8%瓊脂。

1.2 方 法

1.2.1種子萌發(fā)和消毒實(shí)驗(yàn)

選擇大小均勻、飽滿、無損傷、無霉變的玉米種子，放入無菌燒杯中，用75%乙醇沖洗10 s后，再分別用NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇浸泡12 min，以無菌水作為對(duì)照組(ck)，各消毒劑處理完后用無菌水沖洗4～5次，將各處理種子浸入無菌水中，放入4 ℃冰箱。浸種12 h，然后將種子接種于無菌瓊脂培養(yǎng)基上，每處理接種40粒，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(18 ℃)。

試驗(yàn)期內(nèi)，每天對(duì)接種后的玉米種子萌發(fā)和污染數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共統(tǒng)計(jì)5 d。種子出現(xiàn)菌毛或種子周邊發(fā)生菌圈，記做污染，并將其余未污染的種子接入新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)觀察。當(dāng)胚根長至0.5 cm時(shí)，視為萌發(fā)。

污染率(%)=(累計(jì)污染粒數(shù)/總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(累計(jì)萌發(fā)粒數(shù)/總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(日最高發(fā)芽種子數(shù)/總粒數(shù))×100%。

1.2.2淀粉酶測定

取第5天發(fā)芽的玉米種子測定淀粉酶活性，測定方法采用DNS顯色法[7]。

1.2.3幼苗根長、株高、鮮重、莖粗的測定

將6種處理已萌發(fā)的種子分別接種于含有無菌沙粒的塑料杯中，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每個(gè)杯子接種4粒，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(18 ℃)條件下培養(yǎng)，定期補(bǔ)充植物營養(yǎng)液，并觀察植物的生長狀況，于生長12 d后測量其根長、株高、莖粗和鮮重。

1.2.4SOD、CAT及MDA的測定

12 d后取植物材料，SOD測定采用氮藍(lán)四唑法[8]，CAT測定采用紫外分光光度法[9]，MDA測定參照張春梅[10]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25.0和GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Tukey法分析顯著性差異，設(shè)定顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對(duì)玉米種子發(fā)芽和污染的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，玉米種子的污染率和發(fā)芽率也逐漸增加(圖1)。不同消毒處理間存在顯著性差異，各處理組在第1天污染率都為0，第2天除HgCl2處理組外，其余消毒劑處理均出現(xiàn)污染，第3天到第5天NaClO、ck污染率顯著上升，分別增加了44.16%和36.67%。CuSO4、苯酚處理組的污染率隨天數(shù)呈平穩(wěn)的上升趨勢，乙醇處理組第4天到第5天時(shí)污染率顯著上升，增加了22.5%。到第5天HgCl2處理才出現(xiàn)種子染菌，培養(yǎng)5 d后，NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇、ck處理組污染率分別為48.33%、13.33%、1.67%、17.5%、44.17%、50%，HgCl2處理組染菌率最低。培養(yǎng)5 d后，NaClO、CuSO4、HgCl2、苯酚、乙醇、ck處理組萌發(fā)率分別為96%、100%、95%、60%、93%、96%。苯酚處理組會(huì)抑制種子的萌發(fā)，發(fā)芽率和發(fā)芽勢最低(圖1、圖2)，其余消毒劑處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率沒有顯著差異。綜合來看，HgCl2不影響種子的萌發(fā)，且染菌率最低，其消毒效果要優(yōu)于其他4種消毒劑。

圖1 消毒劑對(duì)玉米種子發(fā)芽率和污染率的影響Fig.1 Effects of disinfectant on germination rate and contamination rate of maize seeds

圖2 不同處理玉米種子的發(fā)芽勢Fig.2 Germination potential of maize seeds under different treatments

2.2 消毒劑對(duì)玉米種子淀粉酶的影響

不同消毒劑處理的玉米種子淀粉酶活性差異明顯(圖3)，各處理組α-淀粉酶活性為：乙醇>NaClO>ck>苯酚>CuSO4>HgCl2，乙醇、NaClO處理組均會(huì)提高α-淀粉酶活性，與ck相比沒有顯著差異。苯酚、CuSO4處理組會(huì)降低α-淀粉酶活性，但與ck相比沒有顯著差異。HgCl2處理組α-淀粉酶活性最低，與ck相比存在顯著差異，酶活性較ck降低了68.92%。各處理組β-淀粉酶活性為：ck>苯酚>乙醇>HgCl2>NaClO>CuSO4。5種消毒劑處理均會(huì)降低β-淀粉酶活性，其中苯酚處理組β-淀粉酶活性與ck相比沒有顯著差異，乙醇、HgCl2、NaClO、CuSO4處理組β-淀粉酶活性與ck相比存在顯著差異，酶活性較ck分別降低了27%、38%、45.1%、51.41%，CuSO4處理組β-淀粉酶活性最低。HgCl2處理會(huì)顯著降低α-淀粉酶活性；乙醇、HgCl2、NaClO、CuSO4處理會(huì)顯著降低β-淀粉酶活性，HgCl2會(huì)顯著抑制玉米種子淀粉酶活性，對(duì)淀粉酶活性影響最大。

圖3 消毒劑對(duì)玉米種子淀粉酶活性的影響 Fig.3 Effects of disinfectant on amylase activity of maize seeds

2.3 消毒劑對(duì)玉米幼苗根長、株高、鮮重、莖粗的影響

在無菌瓊脂培養(yǎng)基上生長5 d后，玉米種子幼根生長存在差異，NaClO處理組對(duì)幼根有一定促進(jìn)作用，HgCl2和乙醇處理組對(duì)幼根有一定的抑制作用，CuSO4和苯酚對(duì)幼根的抑制現(xiàn)象明顯。

5種消毒劑處理12 d的玉米幼苗生長指標(biāo)也存在差異(表1)，苯酚、CuSO4和乙醇處理會(huì)抑制玉米幼苗根的生長，苯酚處理與ck相比沒有顯著差異，CuSO4和乙醇處理與ck相比根的長度顯著減小，分別降低23.5%和20.9%。5種消毒劑對(duì)玉米幼苗株高影響不大，沒有顯著差異。各消毒劑處理均會(huì)降低玉米幼苗的鮮重，其中乙醇處理會(huì)顯著降低玉米幼苗的鮮重，與ck相比降低了26.2%，其余組與ck相比沒有顯著差異。CuSO4、NaClO和HgCl2處理會(huì)提高玉米幼苗的莖粗，乙醇和苯酚處理會(huì)降低玉米幼苗的莖粗，但是都沒有顯著差異。從上述5種消毒劑對(duì)玉米幼苗的生長指標(biāo)來看，NaClO對(duì)玉米幼苗生長的影響最小，其次是HgCl2，乙醇、苯酚和CuSO4都會(huì)對(duì)玉米幼苗的生長產(chǎn)生一定的影響。

表1 消毒劑處理玉米種子幼苗的根長、株高、鮮重、莖粗Table 1 Root length,plant height,fresh weight and stem diameter of corn seeds treated with disinfectants

2.4 消毒劑對(duì)玉米幼苗SOD、CAT活性和MDA含量的影響

試驗(yàn)組均會(huì)提高玉米幼苗SOD活性(圖4 A)，CuSO4和乙醇處理組SOD活性較ck相比顯著上升，分別增加了89.13 U/g和108.15 U/g。HgCl2、NaClO和苯酚處理組SOD活性會(huì)略有上升，但與ck相比沒有顯著差異。CuSO4和乙醇處理組會(huì)顯著提高玉米幼苗葉片的SOD活性。

圖4 消毒劑對(duì)玉米幼苗SOD、CAT和MDA含量的影響Fig.4 Effects of disinfectant on activities of SOD,CAT and MDA content in maize seedlings

由圖4 B可知，NaClO處理CAT活性最高，酶活性較ck增長了84%，存在顯著差異。HgCl2處理較ck相比酶活性增加61.28%，具有顯著差異。乙醇處理略高于ck，無顯著差異。CuSO4、苯酚處理酶活性與ck相差無幾，沒有顯著性差異。NaClO、HgCl2、乙醇處理均會(huì)提高玉米幼苗SOD活性，其中NaClO處理活性提高最為明顯。

HgCl2、乙醇、苯酚處理組的玉米幼苗葉片MDA含量與ck相比沒有顯著差異(圖4 C)。與ck相比，CuSO4處理組MDA含量提高了0.003 4 μmol/g，但是差異不顯著。NaClO處理組MDA含量最高，達(dá)到了0.021 2 μmol/g，與ck相比提高了72.3%，差異顯著，NaClO處理會(huì)顯著增加玉米幼苗葉片中的MDA含量。其他消毒劑對(duì)MDA含量的影響較小，幾乎不會(huì)累積MDA。

3 討 論

探討了消毒劑對(duì)玉米種子的消毒效果、種子萌發(fā)、幼苗生長和相關(guān)酶活性的影響。NaClO、CuSO4、HgCl2、乙醇等種子消毒劑，常被應(yīng)用于蔬菜、作物及其他經(jīng)濟(jì)植物種子的消毒[11-13]，苯酚則常應(yīng)用于醫(yī)療器械的消毒[14]。種子消毒效果通常用污染率[12]、發(fā)芽率和發(fā)芽勢來評(píng)價(jià)[15]。

欒博宇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿種子用HgCl2消毒時(shí)，種子發(fā)芽率會(huì)降低；NaClO對(duì)頭花蓼種子消毒后，發(fā)芽率顯著降低[17]；乙醇處理毛紅椿種子會(huì)使種子活力下降，但CuSO4會(huì)提高種子活力[18]，這與本試驗(yàn)結(jié)果有所差別。本試驗(yàn)結(jié)果表明，苯酚會(huì)抑制種子的萌發(fā)，降低種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，其余4種消毒劑對(duì)玉米種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響較小。其原因可能是苯酚不易溶于水，在沖洗的過程中很難完全去除，在玉米種子表面有殘留，其他消毒劑水溶性較好，在種子表面殘留較少，對(duì)種子萌發(fā)的影響較小，同時(shí)玉米種子沒有外殼，更易于萌發(fā)。苯酚作為醫(yī)療器械的消毒劑并不適宜于玉米種子的消毒。

祿亞洲等[19]通過比較不同消毒劑對(duì)西藏龍膽種子消毒效果，發(fā)現(xiàn)HgCl2消毒效果最好；NaClO處理煙草種子不僅不會(huì)影響種子的發(fā)芽，消毒效果也最佳[11]；其他試驗(yàn)結(jié)果表明，CuSO4是更適合小桐種子的消毒劑[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1%HgCl2對(duì)玉米種子消毒效果最好，污染率最低，而這可能與玉米種子體積較大表面光滑的特性有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，苯酚、CuSO4和乙醇處理會(huì)抑制玉米幼苗根的生長。研究發(fā)現(xiàn)，某些種子在萌發(fā)過程中會(huì)產(chǎn)生苯酚類抑制物，此外在一些連作障礙植物的根際土壤中也會(huì)存在苯酚類的抑制物，對(duì)種子萌發(fā)和根的生長有顯著抑制影響[21-22]，同時(shí)銅離子還會(huì)抑制幼苗根尖的有絲分裂，使胚根的生長受到抑制[23]，這可能也是苯酚和CuSO4抑制玉米幼根生長的原因。高玉蓮等[24]發(fā)現(xiàn)，高濃度的乙醇提取物會(huì)抑制高粱根的長度，而其他研究表明，乙醇提取物不僅會(huì)對(duì)植物根的生長產(chǎn)生抑制，也會(huì)對(duì)植物的鮮重產(chǎn)生一定的影響[25]。本試驗(yàn)中乙醇處理會(huì)減少玉米幼苗根的長度和鮮重可能與上述研究原因相似。

玉米等禾谷類植株幼苗萌發(fā)生長所需要的主要碳源儲(chǔ)存在胚乳或子葉等種子器官中，作為淀粉儲(chǔ)備[26]。在玉米種子萌發(fā)過程中，種胚向胚乳分泌天然赤霉素。這些激素誘導(dǎo)糊粉層中水解酶的發(fā)育，其中就包含淀粉酶[27]。淀粉酶分解儲(chǔ)備的淀粉，以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)缴L中的胚芽和胚根中，促進(jìn)種子的呼吸作用，為胚根、胚芽生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源[28]。植物體的淀粉酶根據(jù)水解淀粉產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)型可分為α-淀粉酶或者β-淀粉酶[29]。α-淀粉酶是種子萌發(fā)初期最重要的水解酶[30]，水解玉米種子中約90%的淀粉[31]。β-淀粉酶分解淀粉產(chǎn)生麥芽糖和有限糊精，在禾谷類種子萌發(fā)過程中，同樣起到重要的作用[32]。結(jié)果表明，CuSO4和HgCl2消毒處理會(huì)降低玉米種子的淀粉酶活性。已有研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)，一定濃度的銅離子和汞離子會(huì)抑制種子淀粉酶活性[33-34]。

非生物脅迫(干旱、溫度、鹽堿、光照、重金屬等)會(huì)引發(fā)植物次級(jí)氧化脅迫,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成體內(nèi)大量ROS和MDA的積累，進(jìn)而引起SOD和CAT活性升高來清除ROS[35-36]。趙奇等[37]發(fā)現(xiàn)，一定濃度的CuSO4會(huì)提高玉米幼苗的SOD活性；Li等[38]通過乙醇處理草莓發(fā)現(xiàn)，乙醇能夠提高草莓SOD活性。楊小胡等[39]研究發(fā)現(xiàn)，NaClO水浴處理會(huì)提高板栗的CAT活性，同時(shí)會(huì)引起MDA的積累；其他研究也表明，一定濃度的汞離子會(huì)提高植物CAT活性[40]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同消毒劑處理過的玉米幼苗抗氧化酶活性存在差異，CuSO4和乙醇處理的玉米幼苗SOD活性較高，NaClO和HgCl2處理玉米幼苗CAT活性較高，同時(shí)NaClO處理MDA積累量最高，推測消毒劑浸泡會(huì)對(duì)植物造成一定的脅迫，會(huì)造成抗氧化酶活性的上調(diào)，同時(shí)也會(huì)引起一些有害物質(zhì)的積累。

4 結(jié) 論

通過使用5種消毒劑對(duì)玉米消毒，通過萌發(fā)指標(biāo)、生長指標(biāo)和相關(guān)生理指標(biāo)的測定和分析，HgCl2處理組染菌率低，其消毒效果最好，同時(shí)HgCl2對(duì)玉米萌發(fā)影響較小，對(duì)玉米幼苗的影響較小。雖然HgCl2會(huì)對(duì)種子的淀粉酶產(chǎn)生一定的影響，但是不會(huì)對(duì)玉米的后續(xù)生長產(chǎn)生脅迫，對(duì)POD、CAT活性和MDA含量影響較小。因此，在對(duì)玉米種子消毒時(shí)，采用75%乙醇預(yù)處理10 s加0.1% HgCl2浸泡12 min為宜。