都勻毛尖本地種茶樹代謝組研究

裴會敏， 陳 志， 張龍芬， 文 狄， 王 芬

(1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 貴州 都勻 558000；2.長順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 長順 550700)

代謝組學(xué)[1-3]是后基因組時代各種組學(xué)中一種下游的研究方法，可以對組織、器官或細胞中的所有低分子量代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)分析，是基因與表型的媒介，能夠揭示細胞內(nèi)各種代謝物生物分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性，能識別具有重要作用的組間顯著差異代謝物，并闡明這些差異物在生物活動中的分子機理[4-6]。李萌茹等[4]利用代謝組學(xué)技術(shù)對黃芩根、莖、葉、花的醇提物進行研究，結(jié)果表明，這些代謝物能夠?qū)λダ洗笫蟠x紊亂起到一定的改善作用。代謝產(chǎn)物可以直接反映生物學(xué)過程，也是反映生物學(xué)表型的基礎(chǔ)，通過對代謝組的探索，可以對代謝產(chǎn)物進行定性和定量研究[7]。王春波等[8]比較分析了貴定云霧茶本地種和引進種的差異代謝物，表明兒茶素和原花青素B 1在本地種的含量較高，因此本地種更適合綠茶的加工。汪生等[9]利用超高液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用代謝組技術(shù)比較分析了普洱生茶和普洱熟茶的差異代謝物，為科學(xué)合理解釋兩種茶之間的功效差異提供理論依據(jù)。徐春暉等[10]利用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry,UPLC-QTOF-MS)代謝組方法比較狗牯腦、廬山云霧和婺源綠茶的差異代謝物，并對它們的品質(zhì)進行分析，研究結(jié)果為保護這3種茶葉提供一定的理論依據(jù)。曾亮等[11]利用UPLC-MS/MS檢測普洱生茶水提物，研究表明，隨著貯藏時間的延長，茶多酚、兒茶素等呈現(xiàn)下降趨勢，黃酮上升。于然等[12]采用高效液相色譜法同時測定茶葉中6種茶多酚含量，結(jié)果表明，白茶水提物中表沒食子酸兒茶素最多，而竹葉青綠茶中含量最多的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯。賈浩等[13]基于代謝組學(xué)技術(shù)對單面針的葉、根和莖進行研究，結(jié)果表明，單面針根莖部有效成分含量高于葉。本研究將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于茶樹中，主要是研究其各個器官的代謝物種類、數(shù)量的差異以及它們之間的相互關(guān)系，并結(jié)合生物信息學(xué)的分析技術(shù)，對茶樹各個器官中化學(xué)成分進行定性和定量分析，從整體上探討茶樹各化學(xué)成分的特征和規(guī)律。

貴州地處東經(jīng)103°36′～109°35′，北緯24°37′～29°13′，地形復(fù)雜、氣候溫暖濕潤、土壤肥沃、水源豐富，是中國茶樹的起源中心，具有生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶的自然環(huán)境[14-15]。都勻毛尖茶產(chǎn)自中國貴州，主要生長在黔南布依族苗族自治州的都勻市和貴定縣等地，1915年在巴拿馬萬國博覽會上獲得“金獎”[16]。茶樹中含有很多對人體健康有益的生理活性物質(zhì)[17-19]，如茶多酚和茶氨酸，具有極高的營養(yǎng)價值、科研價值和經(jīng)濟價值。茶是世界公認的健康飲料[20-21]，茶葉中的化學(xué)物質(zhì)直接影響茶葉的口感和品質(zhì)[22-23]。以往關(guān)注的焦點主要在茶樹的葉片上，對茶樹莖和根的功能價值研究不足，事實上茶樹莖含有大量對人類有用的生物化學(xué)物質(zhì)，以代謝組為基礎(chǔ)分析都勻毛尖本地種茶樹根莖與葉的代謝物差異，挖掘根莖和葉中的有益成分，可推動都勻毛尖本地茶樹品種的健康發(fā)展。UPLC-QTOF-MS技術(shù)[24-25]具有靈敏性強且通量高的特點，可以對茶樹葉片的代謝產(chǎn)物進行測定。因此，本實驗利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，研究都勻毛尖本地種茶樹莖根與葉之間的代謝物差異，以期為挖掘都勻毛尖茶葉、莖中的有益功能性成分和培育優(yōu)良品種等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2018年11月，在貴州省黔南州都勻市紅敏茶園選取一株健康、無病的本地種茶樹作為母株，剪取帶葉莖枝條扦插。2021年4月選取6株長勢良好并且株高一致的茶苗分為3組，每組2株，在第1組中剪取葉3片作為葉的第一個生物學(xué)重復(fù)，莖3根作為莖的第一個生物學(xué)重復(fù)，根須大約1 g作為根的第一個生物學(xué)重復(fù)，每個樣本3個生物學(xué)重復(fù)，共9個樣本，將樣本全部放入離心管中再放入液氮中，最后放入-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇 CAS：67-56-1，純度：LC-MS級；乙腈 CAS：75-05-8，純度：LC-MS級；L-2-氯苯丙氨酸 CAS：103616-89-3，純度≥98%；醋酸銨 CAS:631-61-8，純度：LC-MS級；氨水 CAS:1336-21-6，純度：LC-MS級別。

Agilent 1290高效液相色譜儀，AB Sciex品牌TripleTOF 5600型高分辨質(zhì)譜儀，Thermo Fisher Scientific品牌Heraeus Fresco 17型離心機，Sartorius品牌BSA 124 S-CW型天平，Merck Millipore品牌明澈D 24型純水儀，深圳市雷德邦電子有限公司的PS-60 AL型超聲儀， Waters品牌ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm 2.1×100 mm)型色譜柱。

1.2 實驗方法

1.2.1樣本制備

稱取樣品50 mg，然后加入1 000 μL提取液(V甲醇∶V乙腈∶V水=2∶2∶1，內(nèi)標濃度2 μg/mL)，渦旋混勻30 s。加入磁珠，45 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min(冰水浴)，重復(fù)3次。低溫條件下離心15 min(13 000 r/min，4 ℃)，取出200 μL上清液于2 mL進樣瓶，每個樣本各取20 μL混合成QC樣本，再取200 μL上機檢測。

1.2.2色譜條件

沃特世Acquity UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min(5% A)，0.5～7 min(35% A)，7～8 min(60% A)，8～9 min(60% A)，9～10 min(5% A)，10～12 min(5% A)；流速：400 μL/min；進樣量：3 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件

利用AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀，根據(jù)IDA功能并應(yīng)用Analyst TF 1.7，AB Sciex進行一二級數(shù)據(jù)的搜集。霧化氣壓：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：65 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負離子模式)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

基于標準品上機建庫的信息和二級質(zhì)譜信息進行代謝產(chǎn)物的測定，并且利用軟件ProteoWizard[26]和XCMS[27]對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化、代謝產(chǎn)物進行鑒定等一系列數(shù)據(jù)處理，然后進行數(shù)據(jù)歸一化對代謝物進行定量，隨后對9個樣本進行主成分分析，并利用R包ropls進行OPLS-DA模型計算[28]，最后根據(jù)代謝物名稱在對應(yīng)數(shù)據(jù)庫中進行查找，對代謝物進行KEGG、HMDB和Lipidmaps注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 重復(fù)相關(guān)性評估

負離子模式下通過對3個器官9個樣品進行生物學(xué)重復(fù)關(guān)聯(lián)性評價，利用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)r進行評估，其平方值如果接近1，說明器官內(nèi)生物學(xué)重復(fù)較好(圖1)，3個器官的重復(fù)相關(guān)性值大部分介于0.7～0.9之間，說明器官內(nèi)的重復(fù)性是可用的，而器官間的相關(guān)性值幾乎都在0.4以下，表明3個器官間的差異代謝物比較可靠。

圖1 樣品間相關(guān)性評估Fig.1 Correlation assessment among samples

2.2 主成分分析

負離子模式下利用UPLC-QTOF-MS對根莖和葉進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，莖、根和葉組間很明顯被劃分開，表明3個器官的化學(xué)組成存在顯著差異(圖2)，除根外，莖和葉的樣本組內(nèi)較為聚集，說明數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，可用于后續(xù)分析。在葉和根的主成分分析中，第一主成分和第二主成分貢獻率累計達95%以上，表明可靠性較強。在葉和莖的主成分分析中，主成分1的貢獻值達78.18%，主成分2的貢獻值達14.7%，二者之和達92%，表明可信度較高。在莖和根的主成分分析中，主成分1和主成分2的值分別達67.34%和25.07%，二者總值超過92%，說明主成分分析可為鑒別兩種器官提供足夠的可信度。在葉、莖和根的主成分分析中，主成分1和主成分2的貢獻率分別為68.48%和16.12%，累積貢獻率超過84%，說明3組樣品在代謝產(chǎn)物種類、含量等方面存在差異。

圖2 不同器官組織主成分得分 Fig.2 PCA scores of different organs

2.3 正交偏最小二乘法判別分析

雖然主成分分析法能夠有效地提取主要信息，但是往往會忽略一些敏感性不強的信息，而正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)能篩選掉無關(guān)緊要的變量，從而更好地觀察組間的差異。在葉與根的OPLS-DA模式分析中，葉和根很明顯的分布在橫坐標的兩側(cè)，R2X=0.895，R2Y=1，Q2=0.991，這些數(shù)值很明顯揭示了OPLS-DA模型可以反映出兩種器官間的代謝產(chǎn)物差異。在葉與莖的OPLS-DA模型分析中，R2X=0.715，R2Y=0.995，Q2=0.922，表明模型穩(wěn)定性可靠。在莖與根的OPLS-DA模型分析中，兩種器官組織劃分明確，模型驗證后參數(shù)值R2X=0.765，R2Y=1，Q2=0.97，說明模型具有較好的預(yù)測性和可靠性(圖3)。

圖3 3種器官組織的正交偏最小二乘判別分析Fig.3 OPLS-DA of the three organs

為檢查OPLS-DA模型的可靠性，采用置換測試法對負離子模式下模型進行外部交叉驗證(圖4)，當R2和Q2回歸線的斜率大于1，且置換檢驗圖中所有R2和Q2左邊的點都低于橫坐標為1處的點，表明模型未過擬合且穩(wěn)健，具有很好的穩(wěn)定性和預(yù)測性。

圖4 正交偏最小二乘判別分析模型置換檢驗Fig.4 OPLS-DA model permutation test

2.4 差異代謝物篩選

本研究篩選差異代謝物的標準為VIP>1，p<0.05并且Fold Chang>1，其中VIP指第一主成分變量投影重要度。負離子模式下共鑒定出504個差異代謝物。葉與根有205個差異代謝物，其中156個差異代謝物下調(diào)，49個差異代謝物上調(diào)，299個無變化，顯著性最高(p值最大)的5個代謝物分別是梫木毒素(Grayanotoxin I)上調(diào)、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)下調(diào)、絡(luò)氨酸，天冬氨酸，亮氨酸和谷氨酸(Tyr，Asp，Leu，Glu)下調(diào)、脫氧次黃苷酸(2′-Deoxyinosine 5′-monophosphate)下調(diào)、表兒茶素單沒食子酸酯(epicatechin monogallate)下調(diào)。葉與莖有112個差異代謝物，其中24個上調(diào)，88個下調(diào)，最顯著的5個差異代謝物分別是3-甲基-2-氧戊酸鈉(3-methyl-2-oxovaleric acid sodium salt)下調(diào)、氟尿苷(floxuridine)下調(diào)、阿拉伯糖(arabinose)下調(diào)、美索達嗪(mesoridazine)上調(diào)、羥基積雪草酸(madecassic acid)下調(diào)。莖與根有130個差異代謝物，其中46個上調(diào)，86個下調(diào)，最顯著的5個差異代謝物分別為5-羥基L色氨酸(5-Hydroxy-L-tryptophan)下調(diào)、拉米夫定(lamivudine)下調(diào)、異亮氨酸，天冬氨酸和賴氨酸(ILE，ASP，LYS)上調(diào)、絲氨酰組氨酸(serinyl-histidine)下調(diào)、奧美拉唑(omeprazole)下調(diào)(圖5)?；鹕綀D中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表倍數(shù)變化，縱坐標是t檢驗的p值，散點大小代表VIP值，藍色、紅色和灰色的點分別表示上調(diào)、下調(diào)和非差異代謝物。

圖5 3種器官差異代謝物火山圖Fig.5 Volcano plot of differential metabolites in three organs

負離子模式下葉與根和莖與根的共同差異代謝物有90個，葉與根和葉與莖的共同差異代謝物有86個，葉與莖和莖與根的共同差異代謝物有43個，葉、莖和根共同的差異代謝物有29個，說明這些差異代謝物在各自的器官發(fā)揮獨特的作用(圖6)。

圖6 3種器官共同差異代謝物Fig.6 Common differential metabolites in three organs

2.5 代謝物注釋

將代謝產(chǎn)物按照KEGG COMPOUND數(shù)據(jù)庫的注釋信息匹配到對應(yīng)的通路。負離子模式下次級代謝物的生物合成((ko 01110)，130)、不同環(huán)境下的微生物代謝((ko 01120)，130)、碳代謝((ko 01200)，130)、氧代羧酸代謝((ko 01210)，130)、脂肪酸代謝((ko 01212)，130)、芳香族化合物的降解((ko 01220)，130)、氨基酸生物合成((ko 01230)，130)、輔因子生物合成((ko 01240)，130)、代謝通路((ko 01100)，130)等中的代謝物最多。

HMDB數(shù)據(jù)庫廣泛用于代謝組學(xué)研究，負離子模式下在四級水平分類中，有181個代謝物注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫中，其中類黃酮、類肽、類固醇及其衍生物、有機膦酸及其衍生物、有機磷酸及其衍生物、異黃酮類、羧酸及其衍生物、大環(huán)內(nèi)酯類、有機氧復(fù)合物、香豆素類及其衍生物、縮酚酸及縮酚酸環(huán)醚、雜色曲霉素、單寧、肉桂酸及其衍生物中的代謝物注釋最多。

Lipidmaps數(shù)據(jù)庫是脂質(zhì)代謝研究和脂質(zhì)組學(xué)分析領(lǐng)域重要的工具，有81個代謝物可以注釋到lipidmaps數(shù)據(jù)庫中。負離子模式下注釋到酚類脂、線性四環(huán)素、多烯類等的代謝物最多。

利用R軟件包[29]，選用超幾何檢驗的方法對正負離子模式下所有差異代謝物KEGG注釋結(jié)果進行富集分析，在根莖葉的所有差異代謝物中，四氫葉酸(neg_368)、4-烯丙基苯甲醚(pos_335)、咖啡酸(neg_246)、芥子?；斯狨?pos_755)、芥子醇(pos_180)、氯代物(neg_183、pos_999)、傘形酮(neg_123、pos_1113、pos_681)、羥基阿魏酸(pos_480)、對烯丙基苯酚(pos_359)、香豆醇(pos_535)、莨菪亭(neg_171)、松柏醇(pos_1098、neg_423)、2-羥基肉桂酸(neg_23)、甲基硫腺苷(neg_13)、4-羥基香豆素(neg_115)富集在苯丙素生物合成、類黃酮生物合成和花青素生物合成通路中；飛燕草素(pos_141)、表沒食子兒茶素(neg_22、pos_45)、橙皮苷(neg_325)、異戊烯焦磷酸(neg_106)、表兒茶素(neg_80、pos_20、neg_210)、根皮素(neg_70)、柚皮苷(neg_218、pos_980、neg_82、pos_993)、5,7二羥基黃酮(neg_181)、生松素(pos_865、neg_296)、新橙皮苷(pos_961、neg_304)、芹菜素(pos_710)、二氫槲皮素(pos_140)、去甲氧基姜黃素(neg_205)、牡荊素(neg_75、pos_926)、半乳糖醛酸(neg_45)、紫鉚查爾酮(neg_107)、木犀草素(neg_271)、沒食子兒茶素(pos_72)富集在類黃酮生物合成和花青素生物合成通路中；3-甲基苯甲醛(pos_44)、香豆醇(pos_53)、天葵素3-O葡萄糖苷(neg_67)、芹菜素7-O-葡萄糖苷(pos_927、neg_340)、錦葵素3-O-葡萄糖苷(neg_50)、蘆丁(neg_68)、槲皮素3-O-葡萄糖苷(pos_21、neg_28)、槲皮苷(neg_32、pos_316)、芹菜素7-O-新陳皮糖苷(pos_1076)、芹菜苷(neg_272、pos_1069)、異牡荊素(neg_27)、紫云英苷(neg_449、pos_26)、葡萄糖苷(pos_161)富集在花青素生物合成路徑中(圖7)，以上結(jié)果表明，在同一通路中的代謝物具有功能上的相關(guān)性。圖中紅色的橢圓形節(jié)點為通路，藍色的三角形節(jié)點、綠色的菱形節(jié)點和桃紅色的矩形節(jié)點表示差異代謝物。

圖7 3種器官差異代謝物富集網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Differential metabolites enrichment network in three organs

3 討論與結(jié)論

本研究利用UPLC-QTOF-MS代謝組技術(shù)對3種器官9個樣品的負離子模式下504個代謝物進行了分析，揭示了在都勻毛尖本地種茶樹的3種器官中存在較大的成分差異，葉與根有205個差異代謝物，葉與莖之間有112個差異代謝物，莖與根之間有130個差異代謝物，3種器官中共同的差異代謝物有29個。通過主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析和重復(fù)相關(guān)性評估證明獲得的差異代謝物比較可靠。

負離子模式下葉與根有61個差異代謝物在KEGG中被注釋。異牡荊苷、根皮苷、錦葵素3-O-葡萄糖、傘形酮、莨菪亭、綠原酸鹽、豆異黃酮、柚皮素、馬錢苷酸、芹菜苷、新橙皮苷、6′氧丙二酰黃豆苷、巴卡亭等在葉中上調(diào)，參與茶多酚代謝過程，主要有黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成、花青素生物合成、苯丙素生物合成、異黃酮類生物合成、單萜生物合成、二萜生物合成等。這些代謝物主要決定茶湯澀味。次黃嘌呤核苷、脫氧次黃苷、2′脫氧次黃苷5′單磷酸、黃嘌呤核苷等也在葉中上調(diào)，主要參與嘌呤代謝和咖啡因代謝，嘌呤類物質(zhì)影響茶葉適制性，咖啡堿使茶葉具有辛苦味?？鼘幩?、莽草酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、O-乙酰-L-絲氨酸、5-羥基-L-色氨酸、右旋脯氨酸、O-琥珀酰-L-高絲氨酸、肌肽、3,4二羥基扁桃酸、葉酸、四氫葉酸等主要參與各種氨基酸代謝和生物合成，這些氨基酸是茶葉滋味的組分，使茶葉具有鮮爽味。肌醇、棉子糖、蔗糖、L-核酮糖、N′N′二乙酰基殼二糖、D-木酮糖、2-脫氫-3-脫氧-葡萄糖酸鹽、半乳糖醛酸等主要參與各種糖類代謝，增加茶的甜味。都勻毛尖本地種茶樹中含有豐富的氨基酸、茶多酚、嘌呤等物質(zhì)，與王春波等[8]的研究結(jié)果一致。

負離子模式下葉與莖有26個差異代謝物注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，谷氨酸鈉、水楊酸、落葉松脂醇、N羥乙酰神經(jīng)氨酸等在莖中上調(diào)，其中谷氨酸鈉主要參與各種氨基酸代謝和氮代謝，谷氨酸能與氨結(jié)合從而降低血液中的氨含量起減毒作用[30]。谷氨酸鈉還可作為調(diào)味劑提高食品的鮮味。焦谷氨酸在莖中也上調(diào)，參與谷胱甘肽代謝，由谷氨酸分子內(nèi)脫水而成，如果谷胱甘肽合成酶缺陷，可引起焦谷氨酸血癥[31-32]。水楊酸主要參與苯丙氨酸代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可用于制備阿司匹林、水楊酸鈉、水楊酰胺、止痛靈等藥物[33]。落葉松脂醇對腫瘤細胞具有抑制作用[34]。N羥乙酰神經(jīng)氨酸參與氨基糖和核苷酸糖代謝，是某些癌癥中的一種特異性標志物，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中起重要作用[35]。

負離子模式下莖與根有36個差異代謝物注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中。異牡荊苷、槲皮苷、錦葵素-3-O-葡萄糖苷、4-羥基香豆素、6′-O丙二酰黃豆苷、芹菜素7-葡萄糖苷、松柏醇等在莖中上調(diào)，主要參與黃酮、黃酮醇、黃烷醇、花青素、苯丙素等的生物合成，說明這些嫩莖具有抗氧化、抗輻射、抗癌、解毒等功能。定性與定量分析都勻毛尖本地種茶樹不同器官代謝組比較研究在茶葉生物學(xué)研究中具有重要意義，為培育良種茶樹提供理論基礎(chǔ)。