超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中46 種食源性興奮劑殘留量

張海超，王 敬，洪 燈，張婧雯，田 浩,*，艾連峰，黃雪靜

（1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江 杭州 310000）

近年來在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中，由于各種飼料添加劑和人工激素的廣泛使用導(dǎo)致畜禽肉制品中產(chǎn)生獸藥殘留的現(xiàn)象屢見不鮮。每年國家食品安全監(jiān)督抽查中β-受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、蛋白同化劑等藥物殘留常被檢出，也成為動物源性食品的重點監(jiān)控項目[1]。殘留的這些藥物也給體育賽事造成食源性興奮劑的困擾[2]。我國發(fā)布了《冬奧會食品安全食品動物食源性興奮劑類藥品控制管理規(guī)范》，該規(guī)范包含40余項動物食源性興奮劑，有激動劑、蛋白同化劑、糖皮質(zhì)激素和利尿劑等。針對每一種或每一類化合物進行分析耗時較長、浪費人力物力，因此，研究多種食源性興奮劑的快速篩查方法對于檢測效率、快速準(zhǔn)確出具監(jiān)測數(shù)據(jù)顯得尤為重要。

目前，針對食品中這些興奮劑的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜[3]、液相色譜[4-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7-16]和液相色譜-高分辨質(zhì)譜[17-19]等。但針對這些化合物同時檢測的技術(shù)研究卻很少，難以滿足重大體育賽事對于時效性的要求。齊鶴鳴等[20]采用LC-MS/MS測定牛肉中18 種興奮劑殘留，包括β-受體激動劑、類固醇激素、糖皮質(zhì)激素和玉米赤霉醇。該方法雖然針對多種食源性興奮劑進行檢測，但是覆蓋面較窄，無法滿足冬奧會監(jiān)管項目要求。馬俊美等[21]采用四極桿/飛行時間質(zhì)譜測定牛肉中16 種蛋白同化制劑、8 種利尿劑、6 種糖皮質(zhì)激素共30 種食源性興奮劑。該方法簡便、快速，但四極桿/飛行時間質(zhì)譜這種高分辨質(zhì)譜價格昂貴，大部分實驗室仍未普及，LC-MS/MS儀仍是當(dāng)前檢測機構(gòu)的主流檢測手段，現(xiàn)行有效檢測標(biāo)準(zhǔn)方法也大多采用LC-MS/MS法[22-24]。且由于動物源性食品含有較多的蛋白、脂肪和磷脂，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，減少對色譜柱和儀器的污染，需要對其進行凈化處理。近年來在多種獸藥快速分析中多采用PRiME HLB固相萃取柱[25-28]和QuEChERS法[29-32]凈化。為使方法普適性更強，能夠為大多數(shù)實驗室使用，本研究針對冬奧會指定檢測項目對PRiME HLB固相萃取和QuEChERS法的凈化效果進行比較，采用LC-MS/MS儀建立動物源性品中10 種β-受體激動劑、3 種β-受體阻斷劑、13 種蛋白同化劑、9 種糖皮質(zhì)激素、11 種利尿劑共計46 種食源性興奮劑的檢測技術(shù)。方法操作簡便、快速，為多種食源性興奮劑的測定提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種動物源食品樣品（豬肉、牛肉、羊肉、雞蛋和牛奶）隨機購買于河北石家莊當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純）德國Fluka公司；乙酸、乙酸鈉、氯化鈉（均為分析純）廣州化學(xué)試劑廠；高純水 美國Millipore公司。

克倫特羅（CAS號：37148-27-9）、沙丁胺醇（CAS號：18559-94-9）、萊克多巴胺（CAS號：97825-25-7）、特布他林（CAS號：23031-25-6）、氯丙那林（CAS號：3811-25-4）、非諾特羅（CAS號：13392-18-2）、妥布特羅（CAS號：41570-61-0）、噴布特羅（CAS號：36507-48-9）、西馬特羅（CAS號：54239-37-1）、普萘洛爾（CAS號：525-66-6）、阿替洛爾（CAS號：29122-68-7）、美托洛爾（CAS號：37350-58-6）、克倫丙羅（CAS號：38339-11-6）、美雄酮（CAS號：72-63-9）、司坦唑醇（CAS號：10418-03-8）、甲基睪酮（CAS號：58-18-4）、丙酸睪酮（CAS號：57-85-2）、諾龍（CAS號：434-22-0）、丙酸諾龍（CAS號：7207-92-3）、苯丙酸諾龍（CAS號：62-90-8）、勃地酮（CAS號：846-48-0）、群勃龍（CAS號：10161-33-8）、睪酮（CAS號：58-22-0）、去氫表睪酮（CAS號：53-43-0）、澤倫諾（CAS號：26538-44-3）、齊帕特羅（CAS號：117827-79-9）、潑尼松（CAS號：53-03-2）、潑尼松龍（CAS號：50-24-8）、地塞米松（CAS號： 50-02-2）、倍他米松（CAS號：378-44-9）、氟氫可的松（CAS號：37148-27-9）、甲基潑尼松龍（CAS號：83-43-2）、倍氯米松（CAS號：4419-39-0）、氫化可的松（CAS號：50-23-7）、可的松（CAS號：53-06-5）、乙酰唑胺（CAS號：59-66-5）、坎利酮（CAS號：976-71-6）、氯噻酮（CAS號：77-36-1）、呋塞米（CAS號：54-31-9）、螺內(nèi)酯（CAS號：52-01-7）、芐氟噻嗪（CAS號：73-48-3）、氯噻嗪（CAS號：58-94-6）、氫氯噻嗪（CAS號：58-93-5）、氨苯蝶啶（CAS號：396-01-0）、精磺胺（CAS號：121-30-2）、托拉塞米（CAS號：56211-4-6），純度均大于等于95%，均為First Standard標(biāo)準(zhǔn)品，購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀 日本Shimadzu公司；3K-15型離心機 美國Sigma公司；PT2100型均質(zhì)器瑞士Kinematica公司；N-EVAP112氮吹儀 美國Organomation公司；渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；Milli-Q純化系統(tǒng) 美國Millipore公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）、Oasis PRiME HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL） 美國Waters公司；C18、中性氧化鋁分散固相粉末 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量各化合物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－18 ℃保存，有效期6 個月。移取各化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL，用甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃避光保存，有效期2 個星期。在實驗過程中根據(jù)需要精確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋成所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入0.2 mol/L乙酸鈉溶液（pH 5.2）8 mL，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液50 μL，渦旋混勻，于37 ℃下恒溫水浴16 h。樣品酶解后冷卻至室溫加入20 mL乙腈、5 g氯化鈉，均質(zhì)1 min，10 000 r/min離心5 min。移取10 mL乙腈層至另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷，渦旋振蕩1 min后棄去正己烷層，再加入10 mL乙腈飽和正己烷重復(fù)操作1 次。取上清液約6 mL置于50 mg C18和300 mg中性氧化鋁的另一離心管中，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取5 mL上清液于10 mL離心管中，40 ℃氮吹至干，用1 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解殘渣。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用UPLCMS/MS儀測定。

1.3.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；流動相：0.005%甲酸溶液（A）和甲醇（B）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% A、5% B；1.0～8.0 min，95%～10% A、5%～90% B；8.0～9.0 min，10% A、90% B；9.0～9.5 min，10%～5% A、90%～95% B；9.5～11.0 min，5% A、95% B；11.0～11.1 min，5%～95% A、95%～5% B；11.1～13.0 min，95% A、5% B。

地塞米松或倍他米松檢測條件：流動相：水（A）和乙腈（B）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，80%～70% A、20%～30% B；0.5～4.5 min，70% A、30% B；4.5～6.0 min，70%～10% A、30%～90% B；6.0～8.0 min，10% A、90% B；8.0～8.1 min，10%～80% A、90%～20% B；8.1～10.0 min，80% A、20% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（electro-spray ionization，ESI），正、負(fù)離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式正負(fù)同時掃描。離子源溫度350 ℃，毛細(xì)管溫度250 ℃，加熱模塊溫度350 ℃，氮氣流速3.0 L/min，干燥氣流速10.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Labsolution 5.86軟件（日本Shimadzu公司）采集，采用Postrun Analysis軟件進行定性分析，采用Quant Browser軟件進行定量分析；采用WPS Office軟件對實驗數(shù)據(jù)進行柱狀圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

樣品制備是藥物多殘留分析中的一個關(guān)鍵步驟，旨在同時從基質(zhì)中提取出所有具有不同理化性質(zhì)的分析物，有效消除基質(zhì)干擾，提高方法的靈敏度和穩(wěn)健性。β-受體激動劑類藥物極性范圍在極性至中等極性之間，以極性化合物為主的弱堿性化合物；蛋白同化激素在弱極性或中等極性的溶劑中有良好的溶解性；糖皮質(zhì)激素疏水性較強；利尿劑大多同時含有酸性和堿性基團，性質(zhì)差異較大。本實驗在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，通過待測物加標(biāo)回收率考察乙腈、乙酸乙酯的提取效果。乙酸乙酯回收率為42%～121%，乙腈回收率為75%～108%。相比，乙腈作為提取溶劑較為合適。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

對PRiME HLB固相萃取柱和QuEChERS兩種凈化方式進行比較。PRiME HLB固相萃取柱不需要活化、平衡等步驟，可將提取液直接過柱達(dá)到凈化目的。本實驗發(fā)現(xiàn)，采用該種凈化方式對司坦唑醇、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、丙酸諾龍保留性強，回收率只有20%～55%，其余化合物回收率為70.2%～116.5%。再經(jīng)后續(xù)乙腈洗脫，這4 種化合物的回收率可提高至50%～80%，但洗脫液顏色加深，分析原因為部分蛋白同化劑類化合物極性較弱，易同磷脂、蛋白等一起保留在凈化柱上，加大洗脫體積，連同雜質(zhì)目標(biāo)物洗脫出固相萃取柱，導(dǎo)致凈化效果較差。QuEChERS前處理方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全等特點，常用的凈化劑有N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑、中性氧化鋁等。動物源食品多含有蛋白、磷脂的基質(zhì)特點，實驗考察不同配比C18和中性氧化鋁的凈化效果。取5 mL提取液，固定加入100 mg中性氧化鋁，分別比較C18添加量為10、30、50、70 mg的回收率，發(fā)現(xiàn)C18添加量50 mg時46 種化合物的回收率最高；固定加入50 mg C18，分別比較中性氧化鋁添加量為100、300、500 mg的回收率，發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁添加量300 mg時46 種化合物的回收率最高。因此，實驗最終選擇提取液加入50 mg C18和300 mg中性氧化鋁作為組合凈化劑，可以獲得良好的凈化效果，基質(zhì)干擾小，且不會對目標(biāo)物產(chǎn)生明顯吸附。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本實驗所測化合物性質(zhì)差異較大，且含有3 對同分異構(gòu)體，坎利酮和螺內(nèi)酯、地塞米松和倍他米松、潑尼松龍和可的松。這3 對化合物具有相同的前體和產(chǎn)物離子，若要準(zhǔn)確定量這些化合物，色譜峰需有一定程度的分離。因此，實驗對色譜參數(shù)如流動相梯度條件、流動相成分進行測試，以實現(xiàn)目標(biāo)化合物的最佳色譜分離以及各化合物的良好峰形和最佳響應(yīng)。實驗考察首先考察甲醇、乙腈、0.1%甲酸溶液、水作為流動相，采用不同梯度在ACQUITY BEH C18色譜柱（100 mmh2.1 mm，1.7 μm）上進行分離，結(jié)果顯示，無論在乙腈-水還是甲醇-水條件下，潑尼松龍和可的松均可達(dá)到分離，但采用甲醇不能分離地塞米松和倍他米松，在乙腈條件下坎利酮和螺內(nèi)酯分離度也很差，需要運行36 min才能徹底分離，并且峰形較寬。綜合其他化合物，在乙腈-水條件下西馬特羅、特布他林、齊帕特羅峰溶劑效應(yīng)較強，峰提前流出，司坦唑醇峰形較差。在甲醇-水條件下，除司坦唑醇峰形較差外，各化合物在色譜柱上保留、峰形均較好。與乙腈-水體系相比，甲醇-水條件下噴布特羅、丙酸睪酮和苯丙酸諾龍響應(yīng)值提高2～5 倍。加入0.1%甲酸，β-激動劑、坎利酮、螺內(nèi)酯、睪酮等化合物靈敏度提高0.5～2 倍，芐氟噻嗪、氯噻嗪、乙酰唑胺和糖皮質(zhì)激素類等大部分化合物電離產(chǎn)生抑制作用，但司坦唑醇峰形得到改善。通過再次優(yōu)化甲酸濃度，實驗最終采用0.005%甲酸-甲醇作為流動相，除地塞米松和倍他米松無法分離外，各化合物靈敏度和和峰形均可滿足要求，整個梯度運行時間13 min；當(dāng)?shù)厝姿珊捅端姿蓹z出時采用1.3.3節(jié)色譜條件分離進行準(zhǔn)確定量。46 種化合物的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 46 種食源性興奮劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖（10 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatograms of 46 foodborne stimulant drugs (10 ng/mL)

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，進樣量1 μL。確定各化合物的最佳質(zhì)譜條件，包括離子源溫度、毛細(xì)管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮氣流速、選擇特征離子對、Q1和Q3電壓、碰撞能量等質(zhì)譜分析條件。各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和UPLC流動相溶液混合進入ESI源，在正負(fù)離子同時掃描方式下進行一級全掃描質(zhì)譜分析，其中大部分化合物分子離子峰[M＋H]＋響應(yīng)值最高，噻嗪類利尿劑均表現(xiàn)為[M－H]－響應(yīng)值最高。螺內(nèi)酯在高溫離子源內(nèi)不穩(wěn)定，脫去一分子乙酰基硫基可顯示較高的[M－C2H3OS]＋，與坎利酮母離子相同。可的松和潑尼松龍的分子離子峰[M＋COOH]－峰反而比[M＋H]＋響應(yīng)值高。然后選擇相應(yīng)的母離子峰進行子離子掃描，得到主要的子離子，并選擇響應(yīng)值高的子離子進行碰撞能量優(yōu)化，最終確定多反應(yīng)監(jiān)測的離子對及碰撞能量，本實驗采用正、負(fù)離子切換模式同時檢測樣品中46 種興奮劑類藥物。建立的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 46 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)、線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Mass spectrometric parameters, linearity, LODs and LOQs of 46 compounds

續(xù)表1

續(xù)表1

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指色譜分離時共洗脫的物質(zhì)改變了待測成分的離子化效應(yīng)，引起信號的抑制或提高。基質(zhì)效應(yīng)影響大時會降低方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，造成測定誤差。動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，容易對目標(biāo)物產(chǎn)生干擾。一般認(rèn)為，基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在0.85～1.15之間不存在基質(zhì)效應(yīng)[15-17]。本實驗方法對所選動物源樣品存在一定基質(zhì)效應(yīng)，以豬肉為例，基質(zhì)效應(yīng)在0.32～1.40之間，結(jié)果見圖2。所建立方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行校正。

圖2 46 種食源性興奮劑基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of 46 foodborne stimulant drugs

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

取不含46 種化合物的豬肉、牛肉、羊肉、雞蛋和牛奶按照1.3.1節(jié)方法制備得到空白基質(zhì)溶液，用各基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液得到質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到各化合物線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，結(jié)果顯示，46 種化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在各自范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

采用信噪比（RSN）法進行46 種目標(biāo)化合物的檢出限和定量限確定，在各基質(zhì)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2節(jié)步驟進行樣品前處理后進樣測定，以RSN≥3計算檢出限，RSN≥10計算定量限，同一化合物在不同基質(zhì)中檢出限、定量限和線性范圍一致（表1）。代表性牛肉基質(zhì)中各化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

2.6.2 方法的回收率和精密度

根據(jù)GB/T 27404ü2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，實驗選取豬肉、牛肉、羊肉、雞蛋和牛奶5 種不含46 種食源性興奮劑化合物的基質(zhì)分別在3 個質(zhì)量濃度進行加標(biāo)回收實驗，每個水平測定6 次。由表2可知，方法的平均回收率在76.0%～111.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～12.4%之間。

表2 方法的加標(biāo)回收率及RSD（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of the developed method (n = 6)

續(xù)表2

續(xù)表2

2.7 實際樣品分析

采用本方法對市售豬肉、牛肉、羊肉共計50 批，雞蛋10 批和牛奶10 批進行測定，結(jié)果表明，1 批豬肉檢出克倫特羅，檢出量為1.86 μg/kg，采用GB/T 22286ü2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》[23]進行驗證，結(jié)果為1.90 μg/kg，RSD為1.50%，無明顯差異，結(jié)果可靠?？藗愄亓_陽性樣品離子色譜圖和質(zhì)譜圖如圖3所示。

圖3 陽性樣品中克倫特羅提取離子色譜（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.3 Extracted ion chromatogram (A) and mass spectrum (B) of clenbuterol in positive samples

2.8 與文獻(xiàn)方法比較

如表3所示，本方法采用普適性較強的UPLC-MS/MS儀建立動物源性食品中10 種β-受體激動劑、3 種β-受體阻斷劑、13 種蛋白同化劑、9 種糖皮質(zhì)激素、11 種利尿劑共計5 類46 種食源性興奮劑的同時檢測技術(shù)，定量限為0.1～2.0 μg/kg，可滿足大型體育賽事對于食源性興奮劑的監(jiān)管要求。與文獻(xiàn)方法相比，該方法普適性強，覆蓋化合物范圍全面，測定基質(zhì)范圍廣泛，可以一次樣品處理獲得所有結(jié)果，提高工作效率。

表3 本方法與文獻(xiàn)分析方法的對比Table 3 Comparison of the present method with previously reported methods

3 結(jié) 論

應(yīng)用QuEChERS凈化，以UPLC-MS/MS法建立同時檢測動物源性食品中46 種食源性興奮劑的方法，分別對前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，測定β-激動劑、糖皮質(zhì)激素類、利尿劑類和蛋白同化劑類等多種食源性興奮劑。該方法具有靈敏度高、普適性強、操作簡便等優(yōu)點，適用于動物源性食品中多種食源性興奮劑的測定，可為體育賽事的食品保障工作提供有效的技術(shù)支撐。