超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸和馬尿酸殘留

王娟強，劉夢瑤，張明悅，趙文濤*，李瑩瑩，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

苯甲酸及其鈉鹽對酵母菌、霉菌和部分細菌均有抑制作用，作為防腐劑在我國被廣泛應用于蜜餞、醬及醬制品、飲料等各類食品中，GB 2760ü2014《食品添加劑使用標準》規(guī)定了部分食品中苯甲酸及其鈉鹽的允許使用范圍和最大使用量，并規(guī)定肉制品、生鮮肉中不得檢出苯甲酸。2013年美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局批準苯甲酸鈉用于畜禽產(chǎn)品，最大限量為0.1%（以質(zhì)量計）。日本禁止在肉制品中使用苯甲酸鈉，歐洲和澳大利亞雖然允許苯甲酸鈉用于肉制品，卻不建議在兒童食品中使用。苯甲酸及其鈉鹽對人體的毒副作用較小，但過量攝入會損害神經(jīng)系統(tǒng)，破壞細胞平衡，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，嚴重威脅生命健康。近年來，苯甲酸鈉毒性大小備受爭議，其使用的安全性也越來越受關(guān)注。

近年來，市場上出現(xiàn)一些不法商家在暴利驅(qū)使下，制造、銷售添加了苯甲酸鈉的“注水肉”，注水后的肉易造成微生物污染，不法商家添加苯甲酸鈉，達到殺菌防腐效果，減緩生鮮肉的腐敗。注水肉現(xiàn)象屢禁不止，2014年興化市一家屠宰場被舉報給活豬注水，通過增加豬肉質(zhì)量非法盈利。2017年錦州市某鎮(zhèn)肉聯(lián)廠向待屠宰的生豬注水，同時注射鹽酸腎上腺素針劑，生產(chǎn)、銷售大量“注水豬肉”。2018年報道發(fā)現(xiàn)注水時加入保水藥和消炎藥等新作案手法。注水肉不僅損害消費者的利益，更會引入非肉源性污染物威脅消費者的健康。目前尚無針對生鮮肉中苯甲酸鈉及代謝物的檢測方法。為嚴厲打擊非法注水肉行為，亟需建立生鮮肉中苯甲酸及其代謝物的檢測方法，為執(zhí)法提供技術(shù)支撐。

此外，苯甲酸已被歐盟批準作為生長肥育豬飼料添加劑，其日糧添加水平為0.5%～1%。在我國，近年來苯甲酸及鈉鹽開始應用于畜禽飼料中。研究表明苯甲酸可提高生長豬的日增質(zhì)量，縮短達到肥育體質(zhì)量時間。Kristensen等研究發(fā)現(xiàn)生長豬在攝入苯甲酸后被肝臟迅速吸收并被腎臟代謝，以85%馬尿酸和15%苯甲酸形式排出體外。而Shu Yan等研究發(fā)現(xiàn)日糧添加2.5%或5.0%苯甲酸組豬肝臟和腎臟中苯甲酸殘留量高于0.5%苯甲酸組，攝入過量苯甲酸會導致仔豬器官受損，苯甲酸會在豬組織器官中累積。以上研究表明，長期攝入過量苯甲酸會在動物組織器官累積，苯甲酸主要代謝產(chǎn)物是馬尿酸。通過檢測畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸及馬尿酸含量可評估使用飼料的合理性，監(jiān)測苯甲酸及代謝物在畜肉及內(nèi)臟中的殘留量可有效保障食品安全。

目前國內(nèi)外關(guān)于苯甲酸和馬尿酸檢測方法的研究報道主要采用毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。GB 5009.28ü2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中僅規(guī)定了一般食品中苯甲酸的液相色譜和氣相色譜檢測方法。氣相色譜法前處理操作繁瑣、耗時較長，高效液相色譜法靈敏度較低、定性能力較差，陽性樣品通常需要進行質(zhì)譜確證，用于多組分復雜基質(zhì)的同時測定難以克服基質(zhì)干擾的不足。而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一般采用多反應監(jiān)測方式，不但抗干擾能力強、操作簡便、選擇性強，準確度和靈敏度也高，逐漸成為多組分高通量痕量、微量分析的重要方法。目前，國內(nèi)外針對苯甲酸和馬尿酸的研究中，采用檢測的樣品基質(zhì)并未涉及新鮮畜肉及內(nèi)臟，且未有同時檢測苯甲酸和馬尿酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法?，F(xiàn)有國家標準中也沒有專門針對生肉樣品的前處理方法，已有文獻報道的動物源食品基質(zhì)多為肉制品和乳制品，主要通過水相提取、沉淀劑沉淀蛋白除雜，而生肉樣品中不僅含蛋白還包括磷脂、酶等復雜成分，如何有效減少樣品雜質(zhì)干擾是畜肉及內(nèi)臟樣品前處理的難點。隨著固相萃取小柱填料的發(fā)展，固相萃取技術(shù)發(fā)揮較大優(yōu)勢，如避免乳化現(xiàn)象、操作簡單方便、溶劑消耗少、回收富集效率高、重復性好，被廣泛應用于多個領(lǐng)域。因此，本實驗專注于畜肉及內(nèi)臟樣品前處理條件優(yōu)化，通過固相萃取技術(shù)凈化樣品，建立能夠檢測畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸和馬尿酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本檢測方法能夠高通量、快速檢測畜肉及內(nèi)臟中的苯甲酸和馬尿酸，可用于評估監(jiān)測飼用苯甲酸的畜肉食品安全，為執(zhí)法機關(guān)監(jiān)管違法添加苯甲酸的行為提供有力技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 德國CNW公司；乙腈、甲醇、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；水為一級水。

對照品：苯甲酸鈉（純度98.94%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；馬尿酸（純度98%） 德國CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PRiME HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）、MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL） 沃特世科技（上海）有限公司；C固相萃取柱（500 mg/3 mL）、PAX固相萃取柱（200 mg/3 mL）、PWAX固相萃取柱（200 mg/3 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；ExionLC高效液相色譜-QTRAP 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；AUW220電子天平（分度值0.1 mg） 日本Shimadzu公司；S-100渦旋儀 日本Taiyo公司；離心機日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；固相萃取裝置 美國Agilent公司；HGC-24A氮吹儀天津恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準溶液：準確稱取對照品，折算成苯甲酸、馬尿酸各10 mg（精確至0.000 1 g），置于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L標準儲備液。置于－18 ℃以下冰箱中保存。

混合標準溶液：分別吸取苯甲酸、馬尿酸標準儲備液適量，用甲醇配制成混合標準溶液，置于－18 ℃以下冰箱中保存。

標準工作溶液：使用時將上述混合標準溶液用甲醇-水（1∶1，/）逐級稀釋為標準工作溶液。臨用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品制備與前處理

取空白或供試動物組織樣品，絞碎，均質(zhì)，得空白或試樣。稱取樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，加蓋后渦旋提取20 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，將2 mL上清液過PRiME HLB固相萃取柱，接收流出液，并用2 mL甲醇洗脫，收集全部流出液，在40 ℃以下氮氣吹近干至0.5 mL，加入0.5 mL水，渦旋復溶，過0.22 μm濾膜，供測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：Phenomenex Luna Omega Polar C色譜柱（2.1 mmh100 mm，3 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）；B為乙腈；流速0.4 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式（ESI）；離子化電壓4 500 V；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力60 psi；霧化溫度550 ℃；多反應監(jiān)測參數(shù)見表2。

表2 苯甲酸和馬尿酸的多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters in MRM mode for benzoic acid and hippuric acid

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

液相色譜條件的優(yōu)化主要考察色譜柱和流動相對目標化合物的保留和分離情況。實驗過程中比較不同的色譜柱Phenomenex Luna Omega Polar C（2.1 mmh100 mm，3 μm）、Phenomenex Kinetex C（3.0 mmh50 mm，2.6 μm）、Agilent SB-AQ（3.0 mmh100 mm，1.8 μm）對化合物分離效果的影響。如圖1B所示，使用Agilent SB-AQ色譜柱時，在苯甲酸出峰處左邊有1 個干擾峰。使用Kinetex C色譜柱時，苯甲酸峰形不佳（圖1A）。Phenomenex Luna Omega Polar C色譜柱不僅能使化合物完全分離，還能有效減少雜質(zhì)對苯甲酸和馬尿酸的干擾。Luna Omega Polar C色譜柱填充了具有極性基團修飾的顆粒，其表面增強了極性保留能力，對苯甲酸和馬尿酸保留和分離效果好。為使化合物峰形更佳，響應更高，本實驗考察在水相為純水、5 mmol/L乙酸銨溶液和5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液，有機相為乙腈的流動相體系下，苯甲酸和馬尿酸的出峰情況。結(jié)果表明，水相為純水時，苯甲酸和馬尿酸出峰時間較早，并且苯甲酸出峰時間右側(cè)有1 個干擾峰（圖1D）；水相為5 mmol/L乙酸銨溶液時，苯甲酸未出峰，可能是乙酸銨溶液抑制了其電離（圖1C）。通過加入一定量甲酸調(diào)節(jié)流動相5 mmol/L乙酸銨溶液的pH值，使目標化合物出峰時間后移，從而減少洗脫雜質(zhì)對目標物的影響，更好地改善峰形，得到對稱的尖峰。因此，本實驗選擇含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相水相。

圖1 不同液相色譜條件下化合物的離子流圖Fig.1 Ion current chromatograms of the target compounds under different liquid chromatography conditions

如圖2所示，苯甲酸和馬尿酸的結(jié)構(gòu)中均含有羧基，苯甲酸鈉以鈉鹽形式存在，在極性溶劑中易失去氫離子形成帶負電荷的基團[M－H]，因此選取負離子模式對化合物混合標準溶液進行全掃描，以確定分子離子峰。然后進一步碎裂母離子，并對子離子進行全掃描。在此基礎(chǔ)上，選擇2 個豐度較高、峰形好、干擾小的特征子離子，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)，最終選定定量分析條件，結(jié)果見表2。苯甲酸和馬尿酸的離子流圖見圖3。

圖2 目標化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structures of the target compounds

圖3 苯甲酸（200 ng/mL）和馬尿酸（40 ng/mL）的離子流圖Fig.3 Ion current chromatograms of the target compounds (benzonic acid at 200 ng/mL and hippuric acid at 40 ng/mL)

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

苯甲酸和馬尿酸屬于極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，采用極性溶劑進行樣品提取。對比甲醇、乙腈、甲醇-水（1∶1，/）、乙腈-水（1∶1，/）、甲酸-甲醇-水（0.02∶1∶1，/）、甲酸-乙腈-水（0.02∶1∶1，/）作為提取溶劑時的提取效率。如圖4所示，甲醇作為提取溶液時對苯甲酸的提取效果最好，乙腈和甲醇-水（1∶1，/）次之。對馬尿酸提取效果依次為甲醇-水（1∶1，/）＞甲酸-乙腈-水（0.02∶1∶1，/）＞乙腈-水（1∶1，/）＞甲醇。在甲醇-水和乙腈-水體系下馬尿酸提取率較純有機相更高，說明加入一定比例的水，有利于馬尿酸的提取。此外，實驗結(jié)果表明加入甲酸并不能提高對苯甲酸和馬尿酸的提取效率。綜上，甲醇和甲醇-水（1∶1，/）對苯甲酸和馬尿酸提取效果更佳。

圖4 不同提取溶劑對苯甲酸和馬尿酸提取效果的影響（n=3）Fig.4 Effect of different solvent systems on the extraction of benzoic acid and hippuric acid (n = 3)

為進一步優(yōu)化溶劑對目標化合物的提取，考察不同比例甲醇和水體系下，甲醇、甲醇-水（75∶25，/）、甲醇-水（50∶50，/）、甲醇-水（25∶75，/）以及純水對苯甲酸（加標量1 mg/kg）和馬尿酸（加標量0.2 mg/kg）的提取回收效果。如圖5所示，以上幾種提取溶劑對馬尿酸的提取效果差別不大，回收率在100%～115%之間。而提取溶劑為甲醇時，苯甲酸回收率最高，達到90%以上。為有效提取兩種目標化合物，本實驗選擇甲醇作為提取溶劑。

圖5 不同比例甲醇-水溶劑體系下目標物的提取回收率（n=3）Fig.5 Effect of methanol, water and their mixtures on the recoveries of target compounds (n = 3)

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化

雖然樣品在提取、離心過程中去除了大部分脂肪、蛋白，但提取溶液中仍含有大量雜質(zhì)，還需進一步凈化。相較于液液萃取等凈化方式，固相萃取柱凈化可以有效保留目標物，去除多余雜質(zhì)，因此選取固相萃取柱對其進行富集、除雜。凈化過程中，不同類型固相萃取柱對目標化合物的保留程度不同，本實驗選取6 種固相萃取柱，對比苯甲酸1 mg/kg、馬尿酸0.2 mg/kg添加水平下的回收率。如圖6所示，PRiME HLB小柱能夠有效減少畜肉及內(nèi)臟樣品中磷脂等雜質(zhì)的干擾，使苯甲酸和馬尿酸得到高回收率。HLB具有一定比例的親水基，能夠有效萃取極性酸性化合物，對苯甲酸和馬尿酸吸附效果好，但用甲醇洗脫時，苯甲酸未能全部洗脫下來，回收率約為57%。C反相固相萃取小柱對苯甲酸和馬尿酸吸附效果均較差，水相上樣和淋洗時大部分流出，導致基本無回收?；旌闲完庪x子色譜柱MAX和PAX具有強陰子交換作用，對苯甲酸和馬尿酸具有較強的吸附保留，但由于苯甲酸的苯環(huán)與羧基共軛，形成較為穩(wěn)定的苯甲酸負離子，吸附劑作用強，較難洗脫，從而導致回收較差。弱陰離子交換柱PWAX與強陰離子交換柱相比，與苯甲酸作用相對較弱，洗脫回收更好。雖然陰離子交換固相萃取小柱對馬尿酸的回收率大于90%，但對苯甲酸的回收率均小于70%。綜上所述，本實驗選擇PRiME HLB對樣品進行凈化，苯甲酸和馬尿酸回收率分別約為105%和98%。

圖6 固相萃取柱對苯甲酸和馬尿酸回收率的影響（n=3）Fig.6 Effect of SPE columns on the recoveries of benzoic acid and hippuric acid (n = 3)

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

該方法采用外標法定量分析，配制苯甲酸和馬尿酸系列混合標準溶液進行分析，如表3所示，在苯甲酸20～1 000 ng/mL和馬尿酸4～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性范圍良好。以3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限及定量限，本方法馬尿酸檢出限和定量限分別為2.5 μg/kg和10 μg/kg，苯甲酸檢出限12.5 μg/kg和定量限50 μg/kg，遠低于GB 5009.28ü2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中液相色譜法檢測苯甲酸的檢出限（0.005 g/kg）和定量限（0.01 g/kg），有利于低含量苯甲酸的檢測，具有明顯優(yōu)勢。

表3 苯甲酸和馬尿酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 3 Regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of benzoic acid and hippuric acid

2.3.2 準確度及精密度

向畜肉及內(nèi)臟中按定量限、2 倍定量限和10 倍定量限濃度水平加入苯甲酸和馬尿酸標準溶液，每個添加量分別做6 個平行，通過提取凈化后測定其含量，計算回收率確定方法的準確度，并計算測定結(jié)果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）評價方法精密度。如表4所示，兩種化合物的回收率在70.5%～99.7%之間，精密度RSD在0.3%～7.1%之間（=6），均小于8%，其精密度和回收率均符合實驗要求。

表4 不同基質(zhì)中苯甲酸和馬尿酸的加標回收率和精密度（n =6）Table 4 Recoveries and RSDs of benzoic acid hippuric acid spiked into different matrices (n = 6)

2.3.3 重復性和穩(wěn)定性

為考察方法重復性，由3 個不同實驗人員重新取苯甲酸和馬尿酸3 個不同質(zhì)量濃度樣品溶液，計算測定結(jié)果RSD，由表5可知，重復性實驗中苯甲酸和馬尿酸RSD為1.1%～5.8%。在方法穩(wěn)定性實驗中，日內(nèi)穩(wěn)定性實驗中對同一個樣品在1 d內(nèi)檢測5 次，計算RSD，其范圍為2.0%～6.9%。日間穩(wěn)定性實驗中對同一個樣品在1 d內(nèi)檢測1 次，檢測3 d，計算RSD，其范圍0.7%～7.2%。結(jié)果表明該方法具有良好的重復性和日內(nèi)、日間穩(wěn)定性。

表5 不同基質(zhì)中苯甲酸、馬尿酸的重復性和日內(nèi)、日間穩(wěn)定性的RSDTable 5 Repeatability and intra- and inter-day stability of benzoic acid hippuric acid in different matrices%

2.4 實際樣品檢測

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對收集的5 個可疑牛肉樣品進行檢測，馬尿酸均有檢出，其中1 個牛肉樣品中馬尿酸含量較高，為0.013 6 g/kg；4 個樣品苯甲酸檢出量均超過0.010 0 g/kg，2 個樣品苯甲酸檢出結(jié)果甚至超過0.300 g/kg，均超過了美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局對苯甲酸和苯甲酸鈉用于畜禽產(chǎn)品的最大限量0.01 g/kg。

通過該方法對市售75 個樣品進行檢測，包括豬肉27 個、豬肝16 個、牛肉16 個、羊肉6 個、豬腎5 個和羊腎5 個。豬肉樣品中苯甲酸檢出率為44%，牛肉樣品中苯甲酸檢出率為50%，6 個羊肉樣品均有檢出，其中1 個豬肉樣品苯甲酸檢出量較高，為0.006 04 g/kg，2 個牛肉樣品苯甲酸檢出量較高，分別為0.019 3 g/kg和0.130 g/kg，其他樣品苯甲酸檢出量為52.1～198.0 μg/kg。對于馬尿酸，豬肉樣品中馬尿酸檢出率為67%，含量為30.4～251.0 μg/kg，牛肉樣品中3 個樣品馬尿酸未檢出，其余樣品馬尿酸檢出量為25.3～726.0 μg/kg，羊肉中馬尿酸檢出量為193～674 μg/kg。此外，豬肝樣品中苯甲酸檢出量為60.5～403.0 μg/kg，馬尿酸檢出量為25.6～653.0 μg/kg。豬腎和羊腎樣品苯甲酸檢出量分別為960～5 276 μg/kg和407～690 μg/kg，馬尿酸檢出量分別為2 401～13 192 μg/kg和1 018～1 725 μg/kg，遠高于豬肉和羊肉樣品。實驗結(jié)果表明，在畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸和馬尿酸檢出率相對較高，可能存在非法添加和過量使用飼用苯甲酸現(xiàn)象，且存在較大風險。

3 結(jié) 論

建立畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸和馬尿酸殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法經(jīng)甲醇渦旋提取，PRiME HLB凈化，前處理操作簡單、方便，上機檢測時間5.5 min，快速、高效。加標實驗中，在豬肉和豬肝基質(zhì)中回收率在70.5%～99.7%之間。苯甲酸檢出限為12.5 μg/kg、定量限為50 μg/kg，遠低于GB 5009.28ü2016中液相色譜法檢測苯甲酸的檢出限（0.005 g/kg）和定量限（0.01 g/kg），可用于低含量苯甲酸的檢測。方法學考察結(jié)果表明，該方法準確、可靠，具有良好的重復性和穩(wěn)定性，可適用于大批量畜肉及內(nèi)臟樣品的監(jiān)測分析。目前，國家標準并無針對畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸及代謝物馬尿酸殘留的檢測方法，且未對畜肉及內(nèi)臟中苯甲酸及馬尿酸殘留限量進行規(guī)定，不利于執(zhí)法機構(gòu)對違法注水添加苯甲酸及鈉鹽和過量飼用苯甲酸的行為進行監(jiān)管。本方法的建立彌補了檢測方法的空缺，為打擊違法添加苯甲酸行為提供有力的技術(shù)支撐，對保障畜肉及內(nèi)臟食品安全具有重要意義。