蘋果腐敗菌侵染過程的拉曼光譜成像表征規(guī)律

郭志明，郭 闖，王明明，宋 燁，陳全勝，鄒小波

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250220）

據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計數據顯示，中國蘋果產量占世界蘋果產量的45%以上，在我國水果經濟中占有重要地位。但蘋果采后貯藏過程中容易被腐敗菌侵染導致變質，其中黑曲霉、青霉和鏈格孢是導致蘋果腐敗變質的最主要優(yōu)勢腐敗菌。腐敗菌侵染果蔬，是腐敗菌與果蔬相互作用的過程，腐敗菌會導致蘋果組織細胞成分發(fā)生變化，這些變化反映了腐敗菌的侵染過程。在感染早期，腐敗菌主要潛伏在蘋果果實的表面，隨著貯藏時間的延長，果實由于生理衰老和環(huán)境條件的變化，抵抗力下降，潛伏的腐敗菌就會通過傷口、氣孔和花萼等部位進入果實并迅速萌發(fā)，滲透并產生菌絲體，不僅導致蘋果腐敗變質，而且其次級代謝產物真菌毒素具有致畸致癌的作用，嚴重危害人體健康，造成嚴重的食品安全問題。其中，某些腐敗菌還會改變微環(huán)境，有利于腐敗菌的生長，因此對果蔬產品中腐敗菌的侵染過程及物理化學機理的研究非常有必要。

傳統(tǒng)的腐敗菌侵染過程的研究包括化學分析、電子顯微鏡、掃描電鏡等，雖然可以準確地測定植物細胞的成分和結構，但是這些方法需要先破壞蘋果組織細胞，測定步驟復雜，難以實時快速觀測果蔬組織細胞成分的空間分布。新興的檢測技術，如免疫定位，需要進行復雜的分子修飾和抗原抗體連接，具有耗時長、價格昂貴的缺點。因此亟待開發(fā)一種有效的方法，實現(xiàn)腐敗菌侵染蘋果組織的原位監(jiān)測和快速監(jiān)測。

共聚焦顯微拉曼光譜成像技術具有無損、免標記、快速、所需樣品量少和樣品前處理簡單的優(yōu)點，所構建的拉曼化學圖像可以揭示組分獨特的空間分布情況，并且繼承了顯微拉曼光譜成分檢測的優(yōu)勢。利用拉曼光譜圖像的指紋性可以揭示待測物的大分子成分分布信息，通過拉曼光譜中的細微變化還可以揭示多型體的分辨、有序度晶體與非晶體及材料的應變等分子結構信息，該技術已廣泛用于生化分析和微生物檢測。R?sch等采用共聚焦顯微拉曼技術對培養(yǎng)皿上的5 種細菌菌落的類別進行判別。Li Yue’e等采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術研究了鎘對小鼠肝臟的損傷，為研究鎘在人肝臟中的積累和毒性提供了參考。Pan Tingtao等利用共聚焦顯微拉曼光譜技術檢測腐敗梨果的交鏈孢酚的含量。趙艷茹等利用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術對油菜莖稈橫截面健康組織與染菌組織化合物進行化學成像，建立了核盤菌侵染莖稈的早期診斷模型。目前，共聚焦顯微拉曼光譜成像技術多應用于生物醫(yī)學研究，Li Guohao等利用磁性顯微拉曼光譜平臺以外泌體作為癌性標志物，對乳腺癌患者和健康人進行判別。Ma Danying等利用利用拉曼顯微光譜學系統(tǒng)，對健康和乳腺癌組織進行原位拉曼光譜采集，揭示了乳腺組織癌變過程中許多生化成分的變化，有助于乳腺癌的早期監(jiān)測和光譜診斷。在果蔬腐敗方面的研究較少，利用拉曼化學成像技術闡釋蘋果優(yōu)勢腐敗微生物的侵染過程具有重要的科學價值和實用意義。

本研究采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術動態(tài)監(jiān)測蘋果優(yōu)勢腐敗菌侵染過程中果實細胞和細胞間隙成分及結構的變化。以全新的視角闡述優(yōu)勢腐敗菌侵染蘋果腐敗的機制：1）利用顯微共聚焦拉曼光譜成像系統(tǒng)采集新鮮、侵染早期、侵染中期和侵染晚期蘋果細胞壁及細胞間隙的拉曼光譜，通過與纖維素和果膠標準品的拉曼光譜比較，解析出蘋果細胞成分的拉曼指紋圖譜。2）比較不同侵染階段的蘋果平均拉曼光譜，分析優(yōu)勢腐敗菌侵染過程中蘋果細胞成分纖維素和果膠的變化情況。3）采用夾峰法，選取纖維素和果膠的拉曼特征峰構建偽彩色圖像，分析在蘋果細胞壁和細胞間隙的分布情況和腐敗菌侵染過程中蘋果組織細胞的細微變化。為采用拉曼化學成像技術研究腐敗菌與果蔬組織互作的機制提供理論基礎。4）對腐敗菌侵染蘋果不同階段的拉曼光譜進行預處理和主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）方法建立蘋果不同腐敗程度的判別模型，實現(xiàn)優(yōu)勢腐敗菌侵染蘋果組織的早期快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗選用紅富士蘋果共計60 個，從江蘇鎮(zhèn)江水果批發(fā)市場挑選大小、形狀一致，沒有污染物和機械損傷的蘋果。樣品被運送到實驗室，隨后在4 ℃儲存。實驗前在室溫（25 ℃）條件下放置24 h，使蘋果溫度與實驗環(huán)境溫度一致。

擴展青霉（CICC40658）、皮落青霉（CICC40656）、產黃青霉（CICC40654）、黑曲霉（CICC2089）和鏈格孢（CICC2527） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；纖維素標準品、果膠標準品、乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；PDA培養(yǎng)基 國藥沃凱有限公司。

1.2 儀器與設備

XploRA PLUS超快速拉曼成像光譜儀 堀場（中國）貿易有限公司；DSX-280B高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；Blue pard恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；LED-3超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；XB.K.25血球計數板 上海市求精生化試劑有限公司；一次性培養(yǎng)皿 鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司；一次性無菌手術刀 宿遷盛視醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)勢腐敗菌的活化和培養(yǎng)

對優(yōu)勢腐敗菌進行活化培養(yǎng)，轉入第3代后，置于4 ℃冰箱中保存。選用PDA培養(yǎng)基，在85%相對濕度和28 ℃條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，用無菌塑料接種環(huán)收集腐敗菌孢子并懸浮于無菌水中，用血細胞計數板將腐敗菌懸液濃度控制在10CFU/mL。

1.3.2 蘋果穿刺接種

選取新鮮的蘋果，用75%乙醇溶液擦拭表面進行殺菌消毒，置于無菌操作臺紫外線下照射30 min。采用無菌注射器針頭沿蘋果赤道部分進行穿刺，每隔120°穿刺一個孔，向孔中注入20 μL的菌懸液，將接種好的蘋果置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待腐敗斑直徑約為1 cm，取出染病果實切片，進行拉曼光譜圖像采集。

1.3.3 組織切片制備

新鮮蘋果切片：沿蘋果赤道部位切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的蘋果組織塊，用手術刀切取0.5 cm厚的薄片，每個蘋果組織塊做3 個切片。共選取10 個新鮮蘋果，共獲取30 個蘋果切片。

腐敗蘋果切片：選取不同菌種染病的蘋果，每個接種點切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的蘋果組織塊。每種腐敗菌選擇10 個蘋果，分別獲取30 個蘋果組織切片，共獲得150 個蘋果切片。每個蘋果切片，按照距接種腐敗中心點的距離劃分為嚴重腐?。?.5 mm）、中度腐敗（3.5 mm）、輕微腐?。?.5 mm）。用濾紙吸去切片表面多余水分，固定在載玻片上，進行拉曼光譜的采集。每個菌種選擇2 個蘋果組織切片用于拉曼光譜圖像的采集。

圖1 蘋果組織樣品制備流程（a）和腐敗程度劃分示意圖（b）Fig.1 Preparation of apple tissue samples (a), and plot for spoilage degree division (b)

1.3.4 拉曼光譜與拉曼化學成像采集

1.3.4.1 蘋果組織和標準品拉曼光譜采集

將蘋果組織切片、纖維素和果膠標準品分別置于自動位移平臺上，調節(jié)激光光斑聚焦到待測物表面，每個光斑點采集3 次，取平均值作為最后的光譜數據值。參數設置如下：激發(fā)波長為638 nm，光柵為600 grooves/mm，物鏡倍數為50，衰減功率為50%，積分時間為10 s，累計次數為1，拉曼位移范圍為300～3 020 cm，共聚焦孔徑為100 μm。

1.3.4.2 拉曼化學成像

將切片固定到位移平臺上，垂直方向固定不變，僅在水平方向進行成像，區(qū)域為蘋果的細胞（180 μmh140 μm）及細胞間隙（50 μmh140 μm）。先在白光燈下采用50 倍物鏡調整待測樣品到清晰的視野，然后關閉白光，打開激光器，采用點掃描的方式采集待測樣品的光譜，參數設置如下：激發(fā)波長為638 nm，激光功率衰減為100%，積分時間為1 s，采集步長為5 μm，每個點累計次數為1。掃描結束后，采用夾峰法，選取拉曼特征峰，構建偽彩色圖像，以擴展青霉侵染為例，對腐敗菌侵染過程中蘋果細胞壁成分變化進行拉曼化學成像分析。

1.3.5 光譜數據處理及建模

為減少瑞利散射、噪聲和熒光背景等對光譜數據分析的干擾，對采集到的拉曼光譜進行預處理和基線校正。然后采用PCA對預處理后的光譜數據進行降維處理和聚類分析，以簡化數據、探索和識別樣品數據中的潛在聚類。最后采用LDA對蘋果4 種不同腐敗程度的拉曼光譜數據進行判別分析。LDA是一種常用的模式識別方法，以最小化類內的方差，利用數據類之間的差異進行建模，廣泛應用于檢測分類和特征提取。本研究所涉及的光譜預處理采用LabSpec6軟件，PCA和LDA數據處理均采用MatLab 2014a軟件（Mathworks Co.USA）。

2 結果與分析

2.1 光譜預處理

由于原始拉曼光譜具有一定的光譜噪聲和較高的熒光背景干擾，有效的光譜預處理非常重要。通過優(yōu)選光譜預處理方法對光譜進行去尖峰、平滑和基線校正等處理，能夠有效地減少光譜噪聲，保留有用信息，有利于簡化建模過程和提高模型的穩(wěn)定性。因此在建模前，首先對光譜進行預處理。光譜預處理過程和結果如圖2所示。圖2a為原始拉曼光譜，圖2b～d分別為去尖峰，平滑和去基線處理后的拉曼光譜。研究比較發(fā)現(xiàn)最佳的平滑去噪處理參數設置為：處理類型為降噪，擬合點數為126，擬合程度為2，因子為1。去基線參數設置為：背底擬合為多項式擬合，參數設定為擬合點數為2，擬合最大點數為236。通過光譜預處理，原始光譜的尖峰被去除，有效信息得到了保留，基線漂移現(xiàn)象得到了很好的改善。

圖2 蘋果細胞典型的拉曼光譜Fig.2 Typical Raman spectra of apple cells

2.2 蘋果細胞成分拉曼光譜解析

蘋果組織細胞壁由多種成分組成，因此采集到的拉曼光譜包含多個成分信息。研究根據采集到的蘋果拉曼光譜峰，結合相關文獻報道及標準品的拉曼光譜，對蘋果細胞拉曼光譜進行解析。通過對蘋果細胞壁的拉曼光譜峰進行物質歸屬解析發(fā)現(xiàn)，半纖維素的拉曼光譜峰位于526 cm和2 946 cm位移處，526 cm處為半纖維素的木聚糖分子振動，由于半纖維素和纖維素都具有相似的分子成分，因此2 946 cm也包含了半纖維素的CüH拉伸振動信息；果膠的拉曼光譜峰位于835 cm和875 cm位移處，其中835 cm為高甲基化果膠的-糖苷鍵振動，875 cm為低甲基化果膠的CüOüC異構體的骨架模式振動；木質素的拉曼光譜峰位于920 cm和1 467 cm位移處，920 cm為木質素的（CüOüC）平面對稱振動峰，1 647 cm為木質素的üCHü彎曲振動峰；蛋白質的拉曼位移峰位于991 cm和1 645 cm位移處，其中991 cm為蛋白質的CüCH拉伸振動和丙氨酸振動，1 645 cm為蛋白質的酰胺I C=O拉伸振動。另外，423 cm和629 cm位移處的拉曼峰表示蘋果細胞中的果糖成分。蘋果細胞主要成分的拉曼光譜峰及其所對應的歸屬物質見表1。

表1 蘋果細胞拉曼光譜峰的物質歸屬Table 1 Assignment of Raman spectral peaks of apple cells

2.3 腐敗微生物侵染蘋果不同階段的平均拉曼光譜

蘋果細胞壁主要包含纖維素、半纖維素、果膠和木質素等成分。腐敗菌在侵染蘋果組織的過程中，會分泌纖維素酶和果膠酶，水解蘋果細胞壁，釋放出細胞內的水和其他營養(yǎng)成分，進行生長和繁殖，隨著腐敗程度的增加，蘋果細胞成分不斷被腐敗菌消耗，其拉曼光譜峰強度也會發(fā)生一定程度的變化。圖3顯示了蘋果細胞在腐敗菌侵染不同階段（新鮮、輕微腐敗、中度腐敗和嚴重腐?。┑钠骄庾V曲線。

圖3 腐敗菌侵染不同階段的蘋果細胞平均拉曼光譜Fig.3 Averaged Raman spectra of apple cells at different fungal infection stages

從圖3可以看出，4 種腐敗階段的蘋果細胞平均拉曼光譜具有一定的相似性，但是強度具有明顯的差別，1 121、1 371 cm和2 946 cm處的拉曼光譜峰強度隨著腐敗程度的增加逐漸下降，表明腐敗菌在侵染蘋果過程中，產生纖維素酶，分解了蘋果細胞纖維素，導致蘋果細胞壁中纖維素含量的降低。這種趨勢同樣也發(fā)生在835 cm和875 cm處，表明腐敗菌侵染導致蘋果細胞果膠含量的降低。

2.4 腐敗菌侵染過程中蘋果細胞成分拉曼化學成像分析

為從微觀角度觀測黑曲霉侵染過程中蘋果細胞成分的變化，采用拉曼化學成像技術對侵染早期、中期和晚期的蘋果組織細胞進行成像分析。根據解析的多糖、纖維素、半纖維素和果膠的拉曼特征光譜，采用夾峰法，選取以上成分的特征光譜峰，以光譜強度構建這些成分在蘋果組織細胞壁及細胞間隙中分布的偽彩色圖像。偽彩色條顏色從藍至紅表示相應成份拉曼信號的強弱變化，顏色越靠近紅色表明待測成分的含量越高。

2.4.1 糖類成分的可視化分布

由于2 946 cm處的拉曼光譜峰為糖類的CüH拉伸振動，為構建糖類成分在蘋果組織細胞壁及細胞間隙中的分布圖像，夾峰選取范圍為2 900～3 000 cm位移處的光譜區(qū)間。由圖4a可以看出，新鮮的蘋果組織細胞形態(tài)呈圓形或橢圓形，大小均勻；中度腐敗的蘋果組織細胞，形狀發(fā)生褶皺彎曲，細胞壁表面呈現(xiàn)高低不平的狀態(tài)，原因可能是受到腐敗菌的侵染，細胞壁成分被分解，細胞結構遭到破壞，細胞內含物流出，導致顯微鏡聚焦困難，視野模糊；而嚴重腐敗的蘋果組織，細胞發(fā)生坍塌，細胞表面凹凸不平，可能原因是細胞壁結構遭到嚴重破壞，整體細胞被分解。圖4b、c顯示了構建的糖類成分在蘋果細胞壁中的糖類分布的偽彩色圖和三維圖，從多糖成分的偽彩色圖像可以看出，糖類成分在細胞壁中呈不均勻分布的狀態(tài)，越靠近角隅區(qū)和胞間層的區(qū)域含量越高，越靠近細胞間隙的部分，多糖含量越高；隨著腐敗程度的增加，多糖的含量呈下降趨勢。

圖4 蘋果細胞壁中糖類成分分布圖Fig.4 Distribution of carbohydrates in apple cell wall

2.4.2 纖維素成分的可視化分布

由于1 080 cm和1 121 cm處的拉曼光譜峰分別歸屬于纖維素的CüO和CüOüC糖苷鍵振動，為了構建纖維素成分在蘋果細胞間隙中分布的偽彩色圖像，通過夾峰法選取范圍為1 050～1 150 cm處的光譜區(qū)間。構建的纖維素成分在蘋果細胞間隙中的分布圖像（圖5）可以看出，新鮮的蘋果細胞中，纖維素在細胞間隙中呈現(xiàn)不均勻連續(xù)分布的狀態(tài)；中度腐敗的蘋果細胞中，纖維素含量明顯下降，且分布較為離散，可能原因是腐敗菌在侵染蘋果的初期，產生大量的纖維素酶和半纖維素酶，分解了纖維素；由于纖維素分布存在不均勻的情況，在嚴重腐敗的蘋果組織偽彩色圖中，局部區(qū)域纖維素出現(xiàn)了較高的情況，甚至高于新鮮的蘋果組織，而在其他區(qū)域，嚴重腐敗的蘋果細胞，相比于中度腐敗，纖維素含量變化較小，可能是在腐敗菌侵染末期，腐敗菌的菌絲穿過細胞壁，進入了細胞內部，依靠細胞內部的營養(yǎng)成分大量繁殖。

圖5 蘋果細胞間隙中纖維素分布圖Fig.5 Distribution of cellulose in the intercellular space of apples

2.4.3 果膠成分的可視化分布

由于果膠的特征拉曼光譜峰位于835 cm和875 cm位移處，因此通過夾峰法選取800～900 cm范圍內的拉曼光譜構建果膠成分在蘋果細胞間隙中分布的偽彩色圖像。由圖6可知，相比于纖維素成分，果膠在蘋果組織中的含量較低，在新鮮蘋果細胞中，果膠呈不均勻連續(xù)分布的狀態(tài)，其中，中度和嚴重腐敗的蘋果組織，果膠分布狀態(tài)較分散，原因是在腐敗菌侵染過程中，分泌胞外果膠酶，水解細胞中的果膠成分。

圖6 蘋果細胞間隙中果膠成分分布圖Fig.6 Distribution of pectin components in apple intercellular space

2.5 不同侵染階段拉曼光譜聚類分析

由于預處理后的光譜數據具有較高的維度，存在冗余的光譜信息，給建模帶來了復雜性，因此需要對預處理后的光譜數據在進行降維分析，減少無關信息對模型的干擾，提高模型的判別準確度。研究采用PCA對120 個拉曼光譜數據進行聚類分析，圖7顯示了4 個腐敗程度的樣本（新鮮、輕微腐敗、中度腐敗和嚴重腐?。┰诶塾嬝暙I率達97.58%的PC1、PC2和PC空間分布情況，從散點圖可以看出，4 種腐敗程度的拉曼光譜具有明顯的聚類趨勢，其中新鮮的蘋果拉曼光譜與其他3 種腐敗程度的蘋果拉曼光譜存在較少的交叉，腐敗程度越高，其與新鮮蘋果組織拉曼光譜的距離越遠，越容易被分開，而3 種腐敗的蘋果拉曼光譜之間均存在交叉現(xiàn)象。

圖7 基于前3 個PC的不同侵染階段蘋果細胞樣本的得分散點圖Fig.7 Scatter plot of first three principal components for apple cell samples at different infection stages

2.6 不同侵染階段判別模型的建立

為有效識別不同侵染階段的蘋果腐敗程度，在PCA的基礎上，采用LDA算法建立判別模型。首先分別獲取了5 種蘋果優(yōu)勢腐敗菌在4 種不同侵染階段的120 個拉曼光譜數據，在建立LDA判別模型的過程中，120 個樣本數據被分為校正集（80）和預測集（40）。之后選取累計貢獻率超過95%的前15 個PC作為輸入變量，并對PC的數量進行優(yōu)化。圖8顯示了LDA判別模型的PC數優(yōu)化過程，可以看出，當選擇前2 個PC時，模型的判別精確度較差，隨著輸入PC數的增加，模型的性能得到了極大的提高，當PC數超過10以后，模型的判別效果不再發(fā)生明顯變化。表2統(tǒng)計了蘋果5 種優(yōu)勢腐敗菌的最佳判別結果，對于蘋果優(yōu)勢腐敗菌黑曲霉、產黃青霉、皮落青霉、擴展青霉和鏈格孢，當分別選取10、6、12、15 個和10 個PC時，判別效果最佳，預測集判別率分別為97.92%、100%、95.87%、100%、97.92%，這表明采用LDA模式識別方法分析蘋果細胞成分變化的拉曼光譜數據，可以有效的對腐敗菌侵染蘋果進行早期診斷。

圖8 蘋果5 種優(yōu)勢腐敗菌建立LDA模型的PC數優(yōu)化黑曲霉（a）、產黃青霉（b）、皮落青霉（c）、擴展青霉（d）、鏈格孢（e）Fig.8 Optimization of number of principal components in LDA model for five dominant apple spoilage fungi Aspergillus niger (a), Penicillium chrysogenum (b), P.epidermidis (c), P.expansum (d) and Alternaria (e)

表2 蘋果5 種優(yōu)勢腐敗菌不同侵染階段的LDA判別模型的統(tǒng)計結果Table 2 Statistical results of LDA discriminant model for different infection stages of five dominant spoilage fungi in apples

3 結 論

采用共聚焦顯微拉曼光譜成像系統(tǒng)獲取5 種優(yōu)勢腐敗菌侵染蘋果不同階段的組織拉曼光譜圖像，進行圖譜解析和物質歸屬，發(fā)現(xiàn)蘋果組織細胞中的纖維素、果膠、木質素和蛋白質等成分是拉曼光譜響應的物質基礎。在不同侵染階段，這些成分的特征拉曼光譜峰平均強度發(fā)生了明顯的變化，隨著腐敗菌侵染程度的加劇，其強度逐漸下降。

針對腐敗菌侵染過程中蘋果細胞成分進行拉曼化學成像分析，通過拉曼化學成像成功的構建了多糖、纖維素和果膠成分在蘋果細胞壁中分布的偽彩色圖像。隨著腐敗菌侵染程度的加劇，多糖的含量呈下降趨勢；中度腐敗的纖維素相對于新鮮的蘋果組織有所減少，但嚴重腐敗的部分區(qū)域纖維素高于新鮮的蘋果組織，可能是在腐敗菌侵染末期，腐敗菌的菌絲進入了細胞內部，依靠營養(yǎng)成分大量繁殖；相比于纖維素成分，中度和嚴重腐敗的蘋果組織中的果膠分布狀態(tài)較分散，主要原因是在腐敗菌侵染過程中分泌胞外果膠酶，水解細胞中的果膠成分。

采用PCA結合LDA算法建立了5 種腐敗菌侵染蘋果不同階段的判別模型，判別準確率均達95%以上，其中產黃青霉和擴展青霉的判別率為100%，結果表明利用蘋果組織成分變化的拉曼光譜進行腐敗菌侵染程度的早期判別可行。

本研究以蘋果為對象，采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術對蘋果優(yōu)勢腐敗菌侵染蘋果的過程進行了動態(tài)監(jiān)測，建立了蘋果腐敗程度檢測方法，并從微觀角度對優(yōu)勢腐敗菌侵染過程中蘋果組織細胞成分及結構變化進行了可視化檢測，研究結果表明，共聚焦顯微拉曼光譜成像技術可實現(xiàn)腐敗菌侵染蘋果的早期診斷和過程解析。