變構(gòu)促紅細(xì)胞生成素對(duì)中年雌性腦缺血小鼠白質(zhì)損傷的作用研究

王榮亮 楊振宏 馬舒貝 王韜 羅玉敏 焦力群

腦血管病以其高病死率、高致殘率成為威脅人類(lèi)生存的重要疾病，但至今對(duì)其仍無(wú)公認(rèn)、有效的神經(jīng)保護(hù)劑。近年來(lái)，研究者們對(duì)神經(jīng)保護(hù)藥物在缺血性卒中臨床轉(zhuǎn)化失敗的結(jié)果中分析了很多可能原因，其中一種觀點(diǎn)是過(guò)去治療缺血性腦血管病時(shí)過(guò)于注重對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，而忽略了對(duì)白質(zhì)的保護(hù)[1-2]。隨著現(xiàn)代神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，臨床上發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的很多疾病都存在白質(zhì)損傷，從新生兒的腦室周?chē)踪|(zhì)軟化、成年期的卒中到老年人的血管性癡呆，白質(zhì)均是缺血、缺氧損傷的靶點(diǎn)[3-5]。雖然腦缺血可促使機(jī)體誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)新生，但大部分OPCs不能發(fā)育成為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，致髓鞘化不充足，影響腦缺血后的白質(zhì)修復(fù)[6-7]。

在過(guò)去的30年里，基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)在治療缺血性腦血管病中展現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)效果[8-9]。德國(guó)的一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)研究(Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)，ClinicalTrials.gov，注冊(cè)號(hào)：NCT00604630)結(jié)果表明，由于重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)聯(lián)合EPO治療急性腦缺血患者可使患者出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，包括死亡、出血、血栓栓塞事件，因此，EPO不適用于采用rt-PA溶栓治療的腦缺血患者[10]。然而，該臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步分析結(jié)果表明，對(duì)于未rt-PA溶栓的腦缺血患者，EPO能產(chǎn)生有效的神經(jīng)保護(hù)效果，改善患者的神經(jīng)功能評(píng)分。這個(gè)結(jié)論與該中心第1次的EPO治療腦缺血的臨床試驗(yàn)結(jié)論相一致[11]。以上結(jié)果表明，EPO可能成為臨床治療缺血性卒中的潛在神經(jīng)保護(hù)劑。除了不能與rt-PA聯(lián)用，另一個(gè)影響EPO臨床轉(zhuǎn)化的問(wèn)題是其促紅細(xì)胞生成作用。在急性腦缺血早期，EPO需高劑量和多次全身給藥，才能穿過(guò)血-腦屏障進(jìn)入腦組織，達(dá)到有效的治療濃度，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如血栓形成和繼發(fā)性梗死[12]。值得注意的是，EPO的促紅細(xì)胞生成作用與其組織保護(hù)作用可能是通過(guò)與不同受體分別獨(dú)立介導(dǎo)的[13]?；谝陨涎芯?，我們將EPO的促紅細(xì)胞生成的基因序列中位于104位的絲氨酸突變到異亮氨酸，制作成變構(gòu)EPO(mutant EPO,MEPO)，使EPO完全喪失了促紅細(xì)胞生成活性，但仍對(duì)腦缺血小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[14-15]。我們最近的研究結(jié)果顯示，MEPO可改善成年雄性小鼠腦缺血后神經(jīng)功能，促進(jìn)其白質(zhì)修復(fù)[16]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證MEPO對(duì)腦缺血雌性中年小鼠腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞及白質(zhì)的影響，評(píng)價(jià)其保護(hù)作用，為其向臨床轉(zhuǎn)化研究提供更多的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

中年(10月齡)雌性C57BL/6J小鼠30只，體質(zhì)量(25±2) g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010]。實(shí)驗(yàn)所使用的動(dòng)物均經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)(動(dòng)物倫理號(hào)：XWH20210128)，遵守動(dòng)物福利和倫理的相關(guān)規(guī)定。恒溫條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前一晚禁食但不禁水。將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為3組，每組10只：(1)假手術(shù)組(Sham組)：分離血管，不結(jié)扎或凝斷血管；(2)模型組(Vehicle組)：腦缺血+與MEPO相同用量的等滲鹽水；(3)MEPO組：腦缺血+MEPO。造模術(shù)后即刻按照5 000 IU/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射MEPO或等滲鹽水，每隔1 d給藥1次，直到術(shù)后14 d。術(shù)后第2天開(kāi)始，按照50 mg/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射5-溴-2′-脫氧尿苷(5-Bromodeoxyuridinc,BrdU)，每日1次，直至術(shù)后11 d。記錄每只動(dòng)物每天的體質(zhì)量。將每組動(dòng)物分為第1、第2兩組，每組5只，記錄每組動(dòng)物死亡數(shù)量。第1組在術(shù)后3 d處死，取腦組織進(jìn)行2,3,5-氯化三苯基四氮唑( 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色；第2組在術(shù)后14 d取腦組織，制作冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

MEPO為美國(guó)匹斯堡大學(xué)曹?chē)?guó)棟教授贈(zèng)送。實(shí)驗(yàn)所用單抗購(gòu)于北京誼誠(chéng)盛盈生物科技有限公司：髓鞘堿性蛋白抗體(anti-myelin basic protein,anti-MBP，兔來(lái)源)、神經(jīng)絲200抗體(anti-neurofilament 200,anti-NF200，小鼠來(lái)源)、CD16抗體(anti-CD16，大鼠來(lái)源)、CD206抗體(anti-CD206，山羊來(lái)源)、Iba1抗體(anti-Iba1，兔來(lái)源)、Iba1抗體(anti-Iba1，小鼠來(lái)源)、2′，3′-環(huán)腺苷酸-3′-磷酸二酯酶(2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase,CNPase，兔來(lái)源)、BrdU(小鼠來(lái)源)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β抗體(anti-CCAAT enhancer binding protein β,anti-C/EPBβ，小鼠來(lái)源)。所有二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司，封片劑為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI； 0100-20,Southern Biotech，美國(guó))。雙極電凝(德威ACC100，北京天業(yè)愛(ài)博科貿(mào)有限公司)、正置免疫熒光顯微鏡(Eclipase 80i，日本尼康公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技有限公司)、冰凍切片機(jī)(CM1900，德國(guó)萊卡公司)、脫色搖床(TS1，江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型制作

采用大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端血管永久性閉塞的方式制備小鼠腦缺血模型[5]將C57BL/6J小鼠用70%一氧化二氮和30%氧氣混合氣體及4%恩氟烷氣體混合誘導(dǎo)麻醉，使用70%一氧化二氮和30%氧氣混合氣體及1.5%恩氟烷氣體混合維持麻醉。仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮后頸部正中開(kāi)約1 cm的切口，鈍性分離肌肉、筋膜后暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，進(jìn)行結(jié)扎后縫合頸部切口。隨后將小鼠左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，于右側(cè)外眥和耳道連線處進(jìn)行備皮并開(kāi)1個(gè)約0.5 cm的切口，分離并切斷顳肌后暴露顱骨，用小鼠顱骨鉆在顱骨上開(kāi)1個(gè)直徑約2 mm的孔，暴露右側(cè)大腦中動(dòng)脈主干及側(cè)支血管后電凝后剪斷。顯微鏡下觀察動(dòng)脈側(cè)支血管無(wú)血液流出證明建模成功，縫合皮膚后用碘伏消毒，眼部涂藥膏保護(hù)眼球。在手術(shù)過(guò)程中，通過(guò)溫控墊將小鼠肛溫維持在(37.0±0.5) °C。

1.4 體質(zhì)量的記錄

記錄各組小鼠術(shù)前及術(shù)后第1天至第14天的體質(zhì)量。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

采用貼條實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行測(cè)試。將3 mm×3 mm的貼紙貼在小鼠左前肢掌心上，放入直徑15 cm的透明圓筒中，分別記錄小鼠第1次觸碰貼紙所用的時(shí)間(接觸時(shí)間)和將貼紙撕掉所用的時(shí)間(移除時(shí)間)。術(shù)前訓(xùn)練3 d，以小鼠撕掉貼紙的時(shí)間少于10 s為入組標(biāo)準(zhǔn)。分別在小鼠術(shù)前、腦缺血后第1、3、5、9、12、14天進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 腦梗死及腦水腫評(píng)價(jià)

小鼠腦缺血3 d后，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液配制的0.04 g/L多聚甲醛磷酸鹽溶液經(jīng)右心室快速灌注，斷頭取腦后進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(2 mm厚度)，用磷酸鹽緩沖液配制的0.02 g/L TTC染色，染色后紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)槟X梗死組織。用數(shù)碼相機(jī)拍攝，使用Image J圖像分析軟件計(jì)算腦梗死及水腫面積。腦梗死百分比=(正常側(cè)大腦半球面積-患側(cè)大腦半球非梗死區(qū)面積)/正常側(cè)大腦半球面積×100%。腦水腫百分比=(正常側(cè)大腦半球面積-患側(cè)大腦半球的面積)/正常側(cè)大腦半球面積×100%。

1.7 腦組織冰凍切片

小鼠腦缺血術(shù)后14 d，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，0.04 g/L 多聚甲醛磷酸鹽溶液經(jīng)右心室快速灌注，斷頭取腦，置于0.04 g/L 多聚甲醛中后固定48 h后，再經(jīng)0.3 g/L 蔗糖-多聚甲醛溶液脫水。在冰凍切片機(jī)上做連續(xù)冠狀切片，每片15 μm。將腦組織切片貼在含有多聚賴(lài)氨酸的載玻片上，放入-20 °C冰箱中備用。

1.8 免疫熒光檢測(cè)

將冰凍切片平衡室溫后，用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min，隨后用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液配制的0.03 g/L驢血清封閉2 h；按照1∶100的比例加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)驢來(lái)源的熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min；用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核及封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。熒光強(qiáng)度的比值以及雙陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)采用Image J分析軟件進(jìn)行檢測(cè)。

應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)MBP和NF200，用MBP/NF200熒光強(qiáng)度比值評(píng)價(jià)髓鞘脫失程度，也表示白質(zhì)損傷程度，兩者比值越小，腦白質(zhì)損傷越嚴(yán)重。采用Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，CD16標(biāo)記M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，CD206標(biāo)記M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，采用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠腦缺血后14 d腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化。用CNPase標(biāo)記成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞， BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，兩者共染陽(yáng)性(CNPase+/BrdU+)表示新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外，用Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ用綠色熒光標(biāo)記，C/EBPβ+/Iba1+雙陽(yáng)性細(xì)胞指表達(dá)C/EBPβ的小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

術(shù)后3組小鼠存活狀況顯示，Vehicle組小鼠死亡2只(分別于術(shù)后12 d和13 d)，MEPO組小鼠死亡1只(術(shù)后3 d)，Sham組小鼠無(wú)死亡。用于術(shù)后3 d的TTC染色分析小鼠腦梗死百分比的數(shù)量為每組5只，由于染色過(guò)程中Vehicle組和MEPO組小鼠分別有2只的缺血側(cè)腦組織發(fā)生部分丟失，因此分析小鼠腦水腫百分比的數(shù)量為每組3只。術(shù)后14 d，各組小鼠存活數(shù)量分別為Sham組5只，Vehicle組3只，MEPO組4只。因此，用于體質(zhì)量、行為學(xué)分析的小鼠每組統(tǒng)一為3只。最終存活的所有小鼠用于后續(xù)免疫熒光分析，分別為Sham組5只，Vehicle組3只，MEPO組4只。

2.1 3組小鼠腦缺血后的體質(zhì)量比較

重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間效應(yīng)F(14,84)=5.066，P<0.01；組別效應(yīng)F(2,6)=3.623，P=0.090；交叉效應(yīng)F(28,84)=2.110，P=0.005。與Sham組比較，Vehicle組小鼠體質(zhì)量在術(shù)后第1、2、6、7天明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與Vehicle組比較，MEPO組小鼠體質(zhì)量雖然有增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間3組中年雌性C57BL/6J小鼠體質(zhì)量的比較

組別術(shù)后第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天Sham組26.4±1.326.6±0.826.3±2.325.6±0.726.7±1.926.8±1.426.8±1.5Vehicle組22.9±1.423.0±1.823.4±2.423.4±2.222.8±2.023.2±2.323.2±2.3MEPO組25.6±1.926.4±2.725.8±2.826.0±2.525.9±4.326.5±2.926.6±2.9F值4.0923.4361.1961.5811.5322.3052.301P值0.0760.1010.3660.2810.2900.1810.181

2.2 3組小鼠腦缺血后的神經(jīng)功能評(píng)估

2.2.1接觸時(shí)間：重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間效應(yīng)F(6,36)=5.003，P<0.01；組別效應(yīng)F(2,6)=5.634，P=0.042；交互相應(yīng)F(12,36)= 1.964，P=0.059。3組小鼠接觸時(shí)間在各觀察時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2，圖2a。

表2 術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間3組中年雌性C57BL/6J小鼠的神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果的比較

組別移除時(shí)間術(shù)前術(shù)后第1天術(shù)后第3天術(shù)后第5天術(shù)后第9天術(shù)后第12天術(shù)后第14天Sham組7.6±0.7008.6±03.008.4±03.906.8±01.505.0±00.706.9±01.307.6±00.4Vehicle組8.1±1.7101.6±32.0a77.2±37.274.9±39.1a36.9±21.754.4±32.573.0±18.2aMEPO組6.7±2.8020.0±16.9b42.0±48.314.2±13.2b13.9±08.527.1±29.514.8±10.0bF值0.41917.6202.8577.3614.4972.66326.760P值0.67600.0030.1340.0240.0640.14900.001

2.2.2移除時(shí)間：重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間效應(yīng)F(6,36)=5.320，P<0.01；組別效應(yīng)F(2,6)=10.570，P=0.011(圖2b)；交互效應(yīng)F(12,36)= 3.212，P=0.003。與Sham組比較，Vehicle組小鼠在腦缺血后第1、5、14天移除時(shí)間均明顯增加(均P<0.05)；而與Vehicle組比較，MEPO組小鼠在腦缺血后第1、5、14天的移除時(shí)間則明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2b。

2.3 3組小鼠腦缺血3 d后的腦梗死百分比和腦水腫百分比

TTC染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠未發(fā)生腦梗死和腦水腫現(xiàn)象，故不進(jìn)行測(cè)定。與Sham組比較，Vehicle組和MEPO組小鼠腦組織均出現(xiàn)一定程度的腦梗死(圖3a)。與Vehicle組比較，MEPO組小鼠腦梗死百分比和腦水腫百分比均明顯降低(均P≤0.05,圖3b，3c和表3)。

表3 Vehicle組與MEPO組中年雌性C57BL/6J小鼠術(shù)后3 d腦梗死和腦水腫百分比比較

2.4 3組小鼠腦缺血后的腦白質(zhì)損傷比較

腦缺血后第14天，免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Sham組小鼠腦組織相比，Vehicle組和MEPO組小鼠腦組織均出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象，而MEPO組脫髓鞘明顯輕于Vehicle組(圖4a)。腦缺血后第14天，Sham組、Vehicle組、MEPO組3組小鼠的MBP/NF200熒光強(qiáng)度比值分別為4.6±0.8、0.9±0.5、2.9±1.0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.750，P<0.01)；與Sham組比較，Vehicle組和MEPO組小鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)MBP/NF200熒光強(qiáng)度比值顯著降低(P<0.05)；與Vehicle組比較，MEPO組小鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)MBP/NF200熒光強(qiáng)度比值顯著升高(P<0.05，圖4b)。

表4 Vehicle組與MEPO組中年雌性C57BL/6J小鼠術(shù)后第14天不同小膠質(zhì)細(xì)胞表型數(shù)量比較個(gè)/mm2)

2.5 3組小鼠腦缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組的小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，未發(fā)生活化，故不做小膠質(zhì)細(xì)胞活化表型的數(shù)量統(tǒng)計(jì)；相比Sham組，Vehicle組和MEPO組的M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生活化。與Vehicle組比較，MEPO組中CD16+/Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而MEPO組中CD206+/Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較Vehicle組明顯增多(P<0.05)，小膠質(zhì)細(xì)胞更傾向于M2表型極化。見(jiàn)圖5，表4。

2.6 3組小鼠腦缺血后的少突膠質(zhì)細(xì)胞新生

小鼠腦缺血后第14天后，免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織中出現(xiàn)少量新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞。相比Sham組，Vehicle組和MEPO小鼠腦組織中新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均有一定程度增加(圖6a，6b)。Sham組、Vehicle組、MEPO組CNPase+/BrdU+的細(xì)胞數(shù)量分別為(1.6±0.9)、(15.7±4.9)、(26.3±5.1)個(gè)/mm2，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.000，P<0.01)；與Sham組比較，Vehicle組和MCAO組腦缺血同側(cè)組織中CNPase+/BrdU+細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(均P<0.05)；與Vehicle組比較，MEPO組中CNPase+/BrdU+細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖6c。

2.7 3組小鼠腦缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞中C/EBPβ表達(dá)

小鼠腦缺血后第14天后，免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織中出現(xiàn)少量表達(dá)C/EBPβ的小膠質(zhì)細(xì)胞。相比Sham組，Vehicle組和MEPO組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯活化，胞體變大。此外，Vehicle組和MEPO組小鼠腦組織中C/EBPβ陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量也明顯增加(圖7a)。Sham組、Vehicle組、MEPO組C/EBPβ+/Iba1+細(xì)胞數(shù)量分別為(1.4±1.1)、(33.3±11.6)、(18.3±6.7)個(gè)/mm2，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.750，P<0.01)。與Sham組比較，Vehicle組和MEPO組腦缺血同側(cè)組織中C/EBPβ+/Iba1+細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(均P<0.05)；與Vehicle組比較，MEPO組中C/EBPβ+/Iba1+細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖7b。

3 討論

神經(jīng)保護(hù)藥在缺血性卒中臨床轉(zhuǎn)化失敗的一個(gè)重要原因可能是過(guò)去研究者過(guò)于關(guān)注神經(jīng)元胞體(灰質(zhì))的保護(hù)，而忽略了對(duì)白質(zhì)的保護(hù)[17]。白質(zhì)主要由軸突纖維、少突膠質(zhì)細(xì)胞和其他膠質(zhì)細(xì)胞組成，少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生髓鞘，包裹在軸突外，促進(jìn)神經(jīng)脈沖的跳躍式傳導(dǎo)以及保護(hù)軸突。腦白質(zhì)對(duì)缺血損傷十分敏感，白質(zhì)損傷幾乎占據(jù)梗死體積的50%，包括髓鞘損傷、白質(zhì)膠質(zhì)化等，可導(dǎo)致很?chē)?yán)重的神經(jīng)功能缺損[3,6]。因此，脫髓鞘是缺血性或出血性腦損傷的一個(gè)重要的病理現(xiàn)象，對(duì)髓鞘的保護(hù)也是腦血管病及多種神經(jīng)變性病的治療靶點(diǎn)[18-19]。缺血性卒中發(fā)生脫髓鞘，常導(dǎo)致進(jìn)行性不可逆神經(jīng)行為功能障礙，特別是老年卒中患者[20]。研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞新生，進(jìn)而加快軸突再髓鞘化和白質(zhì)修復(fù)[21]。既往研究結(jié)果顯示，MEPO可以促進(jìn)中年雄性小鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，并最終修復(fù)白質(zhì)[22]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證MEPO保護(hù)白質(zhì)的作用是否也對(duì)中年雌性腦缺血小鼠有作用。此外，本研究中采用了小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端血管永久性閉塞模型，充分保證了腦組織梗死位置和梗死范圍的均一性。結(jié)果表明，MEPO組雌性小鼠在腦缺血急性期的腦梗死百分比及腦水腫百分比較Vehicle組均有明顯降低。與之對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能在術(shù)后較短的時(shí)間內(nèi)得到恢復(fù)，證實(shí)了MEPO對(duì)中年雌性腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。有研究顯示，在新生兒胼胝體和皮質(zhì)區(qū)的缺氧缺血性損傷14 d后，延遲進(jìn)行EPO治療顯著增加了MBP/NF200熒光染色的比值[22]。本研究結(jié)果與之相似，MEPO顯著提高中年雌性小鼠缺血性腦損傷后第14天皮質(zhì)的MBP/NF200比值，提示MEPO可以抑制腦缺血后髓鞘的脫失。

小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后的神經(jīng)炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其與巨噬細(xì)胞有相似的特征，按照不同的作用，可分為M1和M2表型。研究表明，在損傷部位存在M1和M2激活的混合小膠質(zhì)細(xì)胞，M1小膠質(zhì)細(xì)胞可增加炎性反應(yīng)前介質(zhì)的分泌，抑制軸突再生，而M2小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)神經(jīng)新生[23]。因此，探尋可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的分子開(kāi)關(guān)，并通過(guò)干預(yù)將腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)變，是治療腦血管病的一個(gè)可行的策略[23-24]。這種觀點(diǎn)雖也有爭(zhēng)議，認(rèn)為將小膠質(zhì)細(xì)胞分為M1表型和M2表型過(guò)于簡(jiǎn)單[25]，但最近幾年的研究證實(shí)了其可行性。在腦出血模型中，將小膠質(zhì)細(xì)胞表型向M2轉(zhuǎn)變，可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)白質(zhì)修復(fù)[26]。既往研究結(jié)果均已證明，EPO和MEPO可以調(diào)節(jié)小鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的表型向M2轉(zhuǎn)化，發(fā)揮保護(hù)作用[16,27]。

在本研究中，MEPO的這種作用同樣體現(xiàn)在中年雌性腦缺血小鼠上。

C/EBP是堿性亮氨酸拉鏈類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)在C/EBP家族中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)成員(α、β、γ、δ、ε、ζ)。C/EBPβ和C/EBPδ參與神經(jīng)元突觸可塑性，同時(shí)調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)[28]。在阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制中，C/EBPβ的激活刺激載脂蛋白E4的表達(dá)，從而促進(jìn)阿爾茨海默病的病理進(jìn)程[29]。而這一進(jìn)程很可能與小膠質(zhì)細(xì)胞中C/EBPβ激活后刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子相關(guān)，而抑制C/EBPβ激活可有效阻斷這一進(jìn)程[30]。我們的結(jié)果顯示，MEPO組的小膠質(zhì)細(xì)胞中C/EBPβ明顯減少，這可能是促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，MEPO減少中年雌性小鼠腦缺血后3 d的腦梗死和腦水腫程度，并改善腦缺血后的神經(jīng)功能。在腦缺血后第14天，MEPO通過(guò)降低小膠質(zhì)細(xì)胞中C/EBPβ的表達(dá)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞新生，從而達(dá)到修復(fù)腦白質(zhì)的作用。