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    尿游離皮質(zhì)醇萃取方法的改良及其檢測(cè)相關(guān)影響因素的分析

    2022-08-02 01:06:46吳祝圓黃毅文賈子超胡志東羅微
    關(guān)鍵詞:改良法化學(xué)發(fā)光二氯甲烷

    吳祝圓,黃毅文,賈子超,胡志東,羅微,2

    (1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 300052,2.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,天津 300023)

    皮質(zhì)醇檢測(cè)是評(píng)估腎上腺功能的重要指標(biāo)。血液中的皮質(zhì)類固醇會(huì)與類固醇結(jié)合蛋白結(jié)合,僅有10%為游離狀態(tài)且能發(fā)揮生物學(xué)功能。尿皮質(zhì)醇是血游離的皮質(zhì)醇經(jīng)腎小球過(guò)濾而來(lái),其含量與血液中發(fā)揮生理功能的游離皮質(zhì)醇濃度及其變化呈正相關(guān)。24 h 尿游離皮質(zhì)醇(urinary free cortisol,UFC)測(cè)定相對(duì)不受晝夜節(jié)律變化影響,更能精準(zhǔn)反映腎上腺皮質(zhì)功能,也是診斷庫(kù)欣綜合征的可靠指標(biāo)[1]。雖然UFC 檢測(cè)最先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[2],但該方法因設(shè)備耗材成本高檢測(cè)通量低,尚未廣泛使用及驗(yàn)證[3]。雖然新觀點(diǎn)認(rèn)為二甲氯烷萃取-化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)尿皮質(zhì)醇受萃取、復(fù)溶等步驟干擾,應(yīng)逐漸用LC-MS/MS 替代;但仍有很多實(shí)驗(yàn)室還以二氯甲烷萃取-化學(xué)發(fā)光分析法為主,關(guān)鍵是它仍然保持成本低、通量高、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[4]。

    化學(xué)發(fā)光法(CLIA)檢測(cè)UFC 需要提前對(duì)尿標(biāo)本進(jìn)行萃取,這一過(guò)程暫未實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,萃取過(guò)程難免受諸多影響因素干擾,對(duì)結(jié)果造成一定影響,目前臨床也尚無(wú)公認(rèn)的理想萃取方法。本實(shí)驗(yàn)室自該項(xiàng)目開展以來(lái),一直采用較為傳統(tǒng)的二氯甲烷液相萃取-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法[5]。其萃取步驟大致為:(1)取24 h 尿0.5 mL 加二氯甲烷1 mL 于干凈的玻璃管中。(2)渦旋振蕩儀上振蕩5 min,離心5 min(3 000 r/min)。(3)取下層400 μL 于玻璃空管中水浴鍋內(nèi)揮發(fā)蒸干。(4)加200 μL 生理鹽水復(fù)溶樣本后CLIA 檢測(cè)。

    原方案中渦旋振蕩儀僅適合10 個(gè)以內(nèi)檢測(cè)/次,常因受力不均容易使得混合物呈晶狀體致萃取過(guò)程本該出現(xiàn)的液面分層消失,導(dǎo)致一定概率的萃取失敗。為適應(yīng)日益增長(zhǎng)的標(biāo)本量及標(biāo)準(zhǔn)化需求,本研究將對(duì)方案進(jìn)行改良。同時(shí)本研究也將探討目前尚未見(jiàn)報(bào)道的尿標(biāo)本留置時(shí)間、蛋白尿、潛血尿這三大因素是否對(duì)UFC 的萃取及檢測(cè)存在干擾,以期為臨床檢驗(yàn)提供更多科學(xué)參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣本及分組 取2019 年12 月—2020 年12 月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科的23 例不同結(jié)果的24 h UFC 標(biāo)本,其中8 例低值、8 例中值、7 例高值。低中高值的分組標(biāo)準(zhǔn)為:參照本實(shí)驗(yàn)室的UFC 檢測(cè)參考范圍是30~110 μg/24 h(尿皮質(zhì)醇濃度乘以24 h 尿量)。0~50 μg/24 h 納入低值組、50~110 μg/24 h 納入中值組,>220 μg/24 h 納入高值組。取其中低、中、高各5 例用于改良萃取法與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果的比較。再取低、中、高各1 例用于精密度評(píng)估。另取低、中、高各1 例用于分析不同標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。1 例低值標(biāo)本作為基質(zhì)摻入皮質(zhì)醇(Cor)質(zhì)控品用于準(zhǔn)確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。最后1 例中值標(biāo)本作為基質(zhì)用于尿蛋白及尿潛血干擾實(shí)驗(yàn)。因?qū)嶋H臨床工作中同一標(biāo)本的量無(wú)法滿足不同實(shí)驗(yàn)的多次要求,因而不同實(shí)驗(yàn)選擇了不同標(biāo)本。

    1.2 試劑與儀器 分析純二氯甲烷(天津市化學(xué)試劑三廠)、皮質(zhì)醇測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光)(英國(guó)西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司)、漩渦混合器XW-80A(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、HY-5A 回旋式振蕩器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)、全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀IMMULITE 2000(德國(guó)西門子有限公司)、日立7180 全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI 公司)、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(希森美康XN-2000+PA-990)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀AB SCIEX Triple QuadTM4500MD(美國(guó)SCIEX 公司)。

    1.3 原理與方法 UFC 的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法,西門子公司IMMULITE 2000 全自動(dòng)免疫化學(xué)發(fā)光自動(dòng)分析儀的原理是患者尿標(biāo)本中的皮質(zhì)醇與發(fā)光劑吖啶酯標(biāo)記的皮質(zhì)醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相上的多克隆兔抗皮質(zhì)醇抗體,它以共價(jià)形式連接至磁顆粒上,皮質(zhì)醇含量與儀器測(cè)得相對(duì)光單位量之間成反比關(guān)系。其試劑詳情可見(jiàn)說(shuō)明書。為保證檢測(cè)性能最佳,按照IMMULITE 2000 操作手冊(cè)進(jìn)行日常維護(hù)、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備、設(shè)置、質(zhì)控等。尿皮質(zhì)醇的提取采用二氯甲烷萃取法,詳情如上文所述。改良之處為上文所述的步驟(2)替換成HY-5A 回旋式振蕩器并設(shè)定轉(zhuǎn)速為250 r/min,振蕩時(shí)間5 min。在改良的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討標(biāo)本留置時(shí)間、蛋白尿、潛血尿的UFC 萃取及檢測(cè)的干擾。在標(biāo)本留置時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中,自初次檢測(cè)后,連續(xù)間隔24 h 再作檢測(cè),標(biāo)本儲(chǔ)存條件為4℃冷藏,不添加防腐劑。在尿蛋白及潛血干擾實(shí)驗(yàn)中,選取1 份尿蛋白及反復(fù)凍融后的血常規(guī)上清標(biāo)本與1 例已知UFC 值的樣本配制成不同濃度的尿蛋白樣本及尿潛血樣本,上機(jī)檢測(cè)Cor 值,計(jì)算實(shí)測(cè)值與理論值的偏差。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行分析,正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s 表示,計(jì)數(shù)資料采用%表示,兩樣本均數(shù)間采用Student′s t 檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 患者資料 本研究按隨機(jī)原則取低、中、高值的UFC 檢測(cè)標(biāo)本23 例,其中男性10 例、年齡均數(shù)為(44.60±14.27)歲;女性13 例、年齡均數(shù)為(50.77±18.99)歲,具體信息、分組情況及24 h 尿量見(jiàn)表1。

    表1 患者的臨床特征參數(shù)Tab 1 Clinical characteristics of patients

    2.2 改良萃取法與原方法的萃取后分層效果比較 改良法(恒速回旋振蕩)的萃取分層與原方法(渦旋振蕩后)的分層效果對(duì)比如圖1 所示,A 管為改良法,B 管為原萃取法中常出現(xiàn)的混合物結(jié)晶不分層現(xiàn)象(其發(fā)生概率據(jù)本實(shí)驗(yàn)室工作的統(tǒng)計(jì)不低于10%)。二氯甲烷所萃取的Cor(正常如圖1 中A管底部,非正常如B 管底部)若出現(xiàn)晶狀體將出現(xiàn)無(wú)法自然揮發(fā)現(xiàn)象,即使在65℃水浴鍋中也無(wú)法揮發(fā)。C 管為原萃取法成功案例的分層效果圖,但普遍可見(jiàn)仍有部分晶狀體現(xiàn)象?,F(xiàn)采用改良法后再未出現(xiàn)晶狀體帶過(guò)寬的現(xiàn)象,即提升萃取成功率至100%。

    圖1 改良法與原方法的Cor 萃取分層效果對(duì)比圖Fig 1 Comparison of Cor extraction layering effect between improved method and original method

    2.3 改良法與原方法的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)及質(zhì)量控制指標(biāo)的分析 改良法與原方法的各組檢測(cè)結(jié)果并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;其中低值組差異P=0.667,中值組差異P=0.693,高值組差異P=0.967,不同水平組P 均大于0.05,合計(jì)時(shí)P>0.05。兩種檢測(cè)方法的具體結(jié)果見(jiàn)表2。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果相關(guān)性分析見(jiàn)圖2所示,其相關(guān)性系數(shù)為R2=0.998 9。

    表2 兩種萃取方法的結(jié)果比較(μg/24 h)Tab 2 Comparison of the results of the two extraction methods(μg/24 h)

    圖2 兩種方法學(xué)檢測(cè)值的相關(guān)性分析Fig 2 Correlation analysis of detection values between two methods

    2.4 改良法提升檢測(cè)精密度 從UFC 臨床標(biāo)本中選取低(L=30 μg/24 h)、中(M=112 μg/24 h)與高(H=914 μg/24 h)3 個(gè)不同濃度的樣本,用兩種方法分別同時(shí)檢測(cè)20 次,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation,CV);將3 個(gè)濃度的樣本連續(xù)檢測(cè)10 d,每天測(cè)定2 次,計(jì)算批間CV,詳情見(jiàn)表3 所示。結(jié)果顯示原方法的批間精密度在低、中值上CV 均大于了25%,而改良法批內(nèi)和批間CV 均低于原方法。

    表3 兩種萃取方法的精密度評(píng)估(μg/24 h,±s)Tab 3 Precision evaluation of two extraction methods(μg/24 h,±s)

    表3 兩種萃取方法的精密度評(píng)估(μg/24 h,±s)Tab 3 Precision evaluation of two extraction methods(μg/24 h,±s)

    注:L、M、H 分別代表低、中、高值組;CV:變異系數(shù)

    濃度次數(shù)原方法批內(nèi)批間LMHLMH CV(%)改良法CV(%)31.76±4.28 13.48 93.96±8.388.92 920.59±44.70 4.86 34.00±5.46 16.07 20 123.87±34.8828.16105.5±12.65 11.98 20 937.44±119.57 12.76 900.05±76.70 8.52 2027.99±5.30 2099±16.49 20 981.72±78.17 2033.05±8.48 18.95 16.65 7.96 25.65

    2.5 改良法提升檢測(cè)準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度的評(píng)估采用Cor 質(zhì)控品(伯樂(lè)免疫多項(xiàng)質(zhì)控,批號(hào)40363)和尿基質(zhì)(1 例臨床UFC 標(biāo)本,用過(guò)量二氯甲烷萃取除去Cor)按比例自行配制成5 例覆蓋低中高值的樣品(值分別為12、75、107、165、210 μg/24 h),以Cor檢測(cè)行規(guī)所規(guī)定的1/4 總TEA 為差異判讀標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷各檢測(cè)值是否符合,采用兩種萃取方法處理后同時(shí)檢測(cè),以檢測(cè)值在1/4 總TEA 內(nèi)即為合格,5 例樣本中80%合格則判讀為該方法準(zhǔn)確度評(píng)估通過(guò)。檢測(cè)結(jié)果顯示,原方法中兩例與理論值中TEA 超過(guò)25%。未能通過(guò)準(zhǔn)確度驗(yàn)證,而改良法通過(guò)準(zhǔn)確度評(píng)估。

    表4 兩種方法的準(zhǔn)確度驗(yàn)證(μg/24 h)Tab 4 Accuracy verification of the two methods(μg/24 h)

    2.6 改良法與LC-MS/MS 法的比對(duì) 本研究對(duì)15例標(biāo)本同時(shí)送檢廣州金域檢驗(yàn)公司,采用LCMS/MS 法檢測(cè),儀器型號(hào)如上文所述,操作方法按相應(yīng)說(shuō)明書進(jìn)行,根據(jù)反饋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異值及相關(guān)性分析。其結(jié)果詳情如表5 所示。兩種方法下各水平間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

    表5 改良法與LC-MS/MS 的結(jié)果差異(μg/24 h)Tab 5 Difference of the results between improved method and LC-MS/MS(μg/24 h)

    將兩種方法學(xué)比較下的3 個(gè)不同檢測(cè)水平的值(來(lái)源于上表)合并后做了相關(guān)性分析,其結(jié)果如下圖所示。兩種方法間相關(guān)性好,相關(guān)系數(shù)R2值可達(dá)0.992 2。

    2.7 標(biāo)本留置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 取一組低、中、高值標(biāo)本留樣1 周,間隔24 h 檢測(cè),所有UFC標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3 次,其結(jié)果的變化見(jiàn)圖4,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)不同組別、不同留置時(shí)間與原值相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并未出現(xiàn)值的下降,4℃封蓋冷藏條件下,尿Cor 檢測(cè)值穩(wěn)定,受標(biāo)本留置時(shí)間影響較小。

    圖3 改良法與LC-MS/MS 檢測(cè)值的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis of improved method and LC-MS/MS

    圖4 尿Cor 標(biāo)本不同留置時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Detection results of urine Cor specimens with different indwelling times

    2.8 尿蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 取1 例UFC 已知值(100 μg/24 h)標(biāo)本,同時(shí)檢測(cè)其尿蛋白=150 mg/24 h,以其作為尿基質(zhì)添加胎牛血清(BSA)蛋白干粉,配制成不同濃度的蛋白尿(命名為P1~5)。按改良法萃取后上機(jī)檢測(cè),觀察各自檢測(cè)值與期望值的差異,計(jì)算各濃度水平的回收率,結(jié)果顯示平均回收率為95.85%,初步揭示尿蛋白對(duì)Cor 檢測(cè)的影響較小,見(jiàn)表6。

    表6 尿蛋白對(duì)尿Cor 干擾性分析Tab 6 Analysis of the interference of urine protein on Cor

    2.9 尿潛血對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 本研究取臨床血常規(guī)標(biāo)本1 例(離心后去上清,得1 例Hb 檢測(cè)高值標(biāo)本250 g/L),經(jīng)反復(fù)凍融裂解紅細(xì)胞離心后取溶血標(biāo)本上清與尿蛋白干擾實(shí)驗(yàn)中的尿基質(zhì)Hb 為0且已知UFC 的標(biāo)本配制成不同梯度濃度Hb 值潛血尿標(biāo)本(命名為H1~5),其檢測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)表7。同理也僅計(jì)算平均回收率。在本干擾實(shí)驗(yàn)中,其平均回收率為89.85%。尿Hb 濃度在2 000 μg/mL 時(shí)會(huì)出現(xiàn)下降10%左右(89.4%),尿Hb 達(dá)4 000 μg/mL 時(shí)會(huì)出現(xiàn)顯著性下降(65.1%)。

    表7 血紅蛋白濃度對(duì)尿Cor 干擾性分析Tab 7 Analysis of the interference of urine Hb on Cor

    3 討論

    目前檢測(cè)UFC 最為經(jīng)濟(jì)、便捷的方法仍是萃取24 h 尿的化學(xué)發(fā)光免疫分析法。我國(guó)多家知名醫(yī)院仍還采用此方法,所介紹的萃取步驟中均使用的是漩渦混合器,甚至部分實(shí)驗(yàn)室所提及的漩渦混合器與本實(shí)驗(yàn)室原方案中該儀器同型號(hào)(XW-80A)[6-8]。

    本實(shí)驗(yàn)室原方案中,渦旋混合會(huì)導(dǎo)致1/10 萃取失敗率如二氯甲烷萃取后液面不分層,出現(xiàn)晶體狀物質(zhì),更換不同的實(shí)驗(yàn)員也不可避免。漩渦混合(XW-80A)沒(méi)有參數(shù)設(shè)置,效果取決于試管與軟墊的壓觸程度及時(shí)間,易導(dǎo)致乳化現(xiàn)象使萃取失敗。為提高效率,原方案常10 管/捆把進(jìn)行渦旋震蕩,加劇了萃取失敗的概率,未見(jiàn)到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究設(shè)想采用HY-5A 回旋式振蕩器替代漩渦混合器(XW-80A)。該回旋式振蕩器具有轉(zhuǎn)速可調(diào)、通量高優(yōu)勢(shì),但渦旋效果稍不如前者;二氯甲烷萃取UFC是否需要如此劇烈和時(shí)長(zhǎng)的渦旋震蕩?改用此溫和振蕩方法是否影響檢測(cè)結(jié)果?改良法能改善UFC 萃取后的分層效果,但對(duì)檢測(cè)結(jié)果是否存在影響?筆者在低、中、高3 組合計(jì)15 例臨床標(biāo)本中進(jìn)行了兩種方法學(xué)的比對(duì)分析。結(jié)果證實(shí),改用HY-5A 回旋式振蕩器(設(shè)定轉(zhuǎn)速250 r/min,5 min)滿足萃取需求提升了工作效率,兩方法的相關(guān)系數(shù)高達(dá)R2=0.998 9。檢測(cè)結(jié)果顯示差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且相關(guān)性較好,為排除偶然性誤差影響,考慮到改良僅針對(duì)萃取步驟,可能改變實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性及重復(fù)性,本研究進(jìn)一步對(duì)質(zhì)量控制中的評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了考察。結(jié)果提示,改良法批內(nèi)和批間CV 均低于原方法,具有更高的精密度和準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度的評(píng)估方面存在一些困難,主要是暫無(wú)UFC 溯源化的標(biāo)準(zhǔn)品,但本研究采用Cor 質(zhì)控品和尿基質(zhì)自行配制的方法加以了解決。對(duì)改良法與LC-MS/MS 法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且相關(guān)系數(shù)可達(dá)R2= 0.992 2,改良法不僅使得萃取失敗現(xiàn)象消失而且使日常檢測(cè)工作變得更高通量(可達(dá)80 個(gè)/次)。LC-MS/MS 是現(xiàn)階段最先進(jìn)的方法,因LC-MS/MS 檢測(cè)的成本較高導(dǎo)致送檢的例數(shù)偏少,使得本研究存在一定局限性,但提示改良法幾乎等同于LC-MS/MS 的檢測(cè)效能??傮w來(lái)說(shuō),改良法提高了萃取成功率、檢測(cè)通量并提升了方法學(xué)的精密度與準(zhǔn)確度。

    在臨床工作中會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)值與臨床預(yù)判不符的現(xiàn)象,因而常需要對(duì)保留的標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查,標(biāo)本留置時(shí)間過(guò)久是否影響復(fù)查?尿皮質(zhì)醇未見(jiàn)報(bào)道;庫(kù)欣綜合征患者約3/4 會(huì)出現(xiàn)高血壓,繼而可能引起腎臟損傷出現(xiàn)蛋白尿,蛋白尿是否會(huì)影響UFC 的萃取及檢測(cè)也尚未見(jiàn)報(bào)道;尿標(biāo)本潛血對(duì)結(jié)果影響也未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)標(biāo)本在4℃冷藏保留8 d 及高蛋白尿?qū)z測(cè)結(jié)果影響微乎其微;在尿蛋白干擾實(shí)驗(yàn)中所配制的尿蛋白濃度≥3.5 g/24 h(大量尿蛋白定義,P5 干擾蛋白的濃度乘以尿量),在潛血干擾實(shí)驗(yàn)中所配制的血紅蛋白尿的Hb 濃度大于了3 840 μg/mL(血皮質(zhì)醇檢測(cè)干擾下限),最大限度地證明了這些干擾因素的不會(huì)產(chǎn)生影響。但潛血尿會(huì)使檢測(cè)值與理論值偏低,特別是當(dāng)尿Hb達(dá)4 000 μg/mL 時(shí)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)誤差大于Cor 檢測(cè)所規(guī)定25%的TEA 值??傮w來(lái)說(shuō),這些結(jié)果證實(shí)皮質(zhì)醇的穩(wěn)定性好,二氯甲烷萃取-化學(xué)發(fā)光免疫分析法受標(biāo)本留置時(shí)間、高蛋白尿的因素影響基本可忽略不計(jì)。但血尿標(biāo)本可能對(duì)萃取或檢測(cè)環(huán)節(jié)存在影響,不建議對(duì)尿路出血或其他原因所致的嚴(yán)重潛血尿做UFC 檢查。

    綜上所述,本研究首次改良了現(xiàn)有的UFC 萃取方法并對(duì)標(biāo)本留置時(shí)間、尿蛋白及潛血這3 個(gè)潛在的檢測(cè)干擾因素進(jìn)行分析。方法學(xué)的改進(jìn)提升了萃取效率及檢測(cè)結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度,干擾因素的分析為臨床標(biāo)本收集、復(fù)查及結(jié)果分析提供了重要的指導(dǎo)意義。

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