畢赤酵母單寧酶工程菌在固、液發(fā)酵中的性質差異分析

王玉印，盧海強，陳 偉，張莉娟，田洪濤，谷新晰*

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001）

單寧酶（EC3.1.1.20）是單寧生物降解中最主要的一類酶，又被稱為單寧?；饷?，可水解單寧底物，產(chǎn)生沒食子酸和葡萄糖以及對應的醇等產(chǎn)物。單寧酶能降低高單寧食物在儲存過程中形成渾濁、沉淀和令人感到不悅的味道，如茶飲料的“冷渾濁”果汁的“脫澀”等，單寧酶在食品行業(yè)中具有巨大應用潛力。然而，單寧酶制劑制備加工技術難度較高，限制了該酶的進一步應用。

目前，國內(nèi)主要以黑曲霉的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶為主，液態(tài)發(fā)酵研究的主要方向為大規(guī)模生產(chǎn)高純度的酶，如Liu Fengling等探究了黑曲霉Bdel4液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶，其產(chǎn)酶水平在168 h可達到111.5 U/mL。而國外則主要以黑曲霉的固態(tài)發(fā)酵為主，固態(tài)發(fā)酵的主要研究方向為“循環(huán)經(jīng)濟”，分解農(nóng)業(yè)廢棄物回收高附加值產(chǎn)物，如Figueroa等以石榴皮為底物誘導黑曲霉GH1產(chǎn)生單寧酶并對酶促反應條件進行了初步探討，其產(chǎn)酶水平在44 h最適條件下測得最高酶活力0.5 U/mL。雖然兩種發(fā)酵方式各有利弊，但固態(tài)發(fā)酵所特有的低能耗、低廢料及低成本等特性越來越受到人們的重視。隨著生物技術的發(fā)展，工程菌株的出現(xiàn)為單寧酶的高效制備提供了一條捷徑。到目前為止，多種來源的單寧酶已經(jīng)被成功實現(xiàn)了異源表達，如Shao Yuan等研究黑曲霉FJ0118中的單寧酶在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達；本課題組前期也開展了相關研究，分別對煙曲霉和茶樹中的單寧酶進行了高效表達，取得了一定效果。

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，廣泛用于生產(chǎn)異源蛋白質，具有技術簡單、生產(chǎn)大量重組蛋白質的能力，而且其具有強大的翻譯后修飾過程，以及最終用于構建重組菌株的特定試劑盒的商業(yè)可用性。液態(tài)發(fā)酵是畢赤酵母傳統(tǒng)發(fā)酵方式，其優(yōu)點是可以獲得大量的發(fā)酵產(chǎn)物，但是其高能耗、高成本及高污染等問題也越來越嚴重，而固態(tài)發(fā)酵方式可以降低這些問題的影響，采用工程菌的固態(tài)發(fā)酵成為一個較為理想的策略。到目前為止，畢赤酵母單寧酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鮮有報道。

本研究利用惰性材料聚氨酯海綿為固態(tài)基質，對重組單寧酶工程菌株GS115-AfTan2.0進行固態(tài)發(fā)酵，并且與液態(tài)發(fā)酵相比較，分析畢赤酵母工程菌株固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)缺點，旨在為綠色高效制備單寧酶提供一定的技術指導，也為重組菌株的固態(tài)發(fā)酵提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

工程菌GS115-AfTan2.0由本課題組構建并保存。戊二醛固定液（電鏡專用，2.5%）、甲醇、甘油、檸檬酸、檸檬酸鈉 北京索萊寶科技有限公司；聚氨酯海綿（密度約為0.8 g/cm） 保定市六合儀器經(jīng)銷部；無氨基酸酵母氮源、羅丹寧 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；iMark酶標儀 美國Bio-Rad公司；J600C型電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司；S-3400掃描電鏡日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固、液態(tài)發(fā)酵基質的制備

將聚氨酯海綿切割成約為1 cm的立方體，稱取1.1 g潔凈的聚氨酯海綿立方體置于100 mL錐形瓶中，進行高壓蒸汽滅菌，同時對300 mL空錐形瓶進行滅菌。緩沖復合甘油（buffered minimal glycerol-complex，BMGY）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，無氨基酵母氮源13.4 g，丙三醇10 mL，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 重組菌株生長曲線的差異分析

將活化的工程菌GS115-AfTan2.0以1%接種量接種于BMGY培養(yǎng)基，搖勻后分裝至裝有無菌海綿立方體的錐形瓶和無菌的空錐形瓶。在進行30 ℃靜置的固態(tài)發(fā)酵前，將錐形瓶置于30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 min，使海綿立方體充分吸收BMGY培養(yǎng)；液態(tài)發(fā)酵則置于30 ℃、200 r/min進行培養(yǎng)。固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵在培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、28、32、38、42 h和48 h進行取樣，每個時間點各取3 瓶。將固態(tài)發(fā)酵的海綿立方體轉移至20 mL注射器內(nèi)，擠壓海綿立方體中的發(fā)酵液流入50 mL離心管中，以30 mL無菌蒸餾水沖洗錐形瓶及注射器內(nèi)的海綿立方體，再次擠壓海綿立方體至無液體流出，收集沖洗液匯入50 mL離心管，將液態(tài)發(fā)酵液倒入50 mL離心管中，以30 mL無菌蒸餾水沖洗錐形瓶，沖洗液匯入50 mL離心管，5 000 r/min離心20 min棄上清液，于80 ℃將收集的細胞烘干至質量恒定，繪制固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵條件的生長曲線。

1.3.3 重組菌株電鏡下細胞形態(tài)差異分析

參照1.3.2節(jié)方法進行接菌、分裝和培養(yǎng)。在培養(yǎng)48 h后進行第1次取樣，取樣后均加入1%的甲醇，每24 h補加1%的甲醇，固態(tài)發(fā)酵采用噴壺將甲醇噴灑至海綿立方體表面；在培養(yǎng)96 h后進行第2次取樣。固態(tài)發(fā)酵取樣以無菌剪刀剪切出厚度約3～5 mm聚氨酯海綿，置于無菌1.5 mL離心管中，加入1 mL 2.5%戊二醛固定液（電鏡專用），4 ℃過夜。液態(tài)發(fā)酵取樣吸取適量樣品離心后加入1 mL 2.5%戊二醛固定液，4 ℃過夜。將樣品從2.5%戊二醛中取出，以30%、50%、70%、100%的乙醇溶液進行梯度脫水，放入超臨界干燥機中干燥1.5 h，將干燥處理的樣品濺射噴金后進行電鏡觀察。

1.3.4 重組菌株產(chǎn)酶特性的差異分析

參照1.3.2節(jié)方法進行接菌、分裝和培養(yǎng)誘導，每間隔12 h或24 h取樣，測定發(fā)酵上清液單寧酶活力及蛋白含量。

1.3.5 甲醇體積分數(shù)對重組菌產(chǎn)酶量的差異分析

參照1.3.2節(jié)方法進行接菌、分裝和培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后均加入0.5%、1%、2%、3%、4%的甲醇進行誘導，每隔24 h添加一次甲醇，并對誘導24、48 h和72 h的酶液進行酶活力測定，探討甲醇體積分數(shù)對固、液發(fā)酵條件下產(chǎn)酶量差異的影響。

1.3.6 重組菌株發(fā)酵液SDS-PAGE差異分析

選取1.3.3節(jié)誘導72 h的固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的酶液，分別吸取21 μL酶液用于后續(xù)電泳分析。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）對固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的單寧酶進行蛋白分子質量差異性分析。

1.3.7 固、液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶學性質分析

1.3.7.1 單寧酶活性的測定

參考Sharma等的方法并稍作調(diào)整。取100 μL適當稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液（1.25 mmol/L，pH 6.0）混勻，于30 ℃反應，10 min后加入300 μL羅丹寧甲醇溶液（50 mmol/L）終止反應，加入200 μL的KOH（0.5 mol/L）溶液顯色，穩(wěn)定5 min后在520 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.7.2 溫度對單寧酶活性的影響

分別測定固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)酶在不同溫度下（0、10、20、30、40、50、60、70 ℃）的酶活力，確定其最適反應溫度；將兩種發(fā)酵方式的重組單寧酶分別在50 ℃和60 ℃條件下，處理0、5、10、20、30 min和60 min，測定酶活力，分析其穩(wěn)定性。

1.3.7.3 pH值對單寧酶活性的影響

分別在最適溫度下測定固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)酶在不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）緩沖液中的酶活力，分析兩種發(fā)酵方式所產(chǎn)酶的最適pH值；將兩種發(fā)酵方式重組酶在pH 2.0～12.0的緩沖液中處理1 h，測定殘存酶活力，以未處理酶液的酶活力為100%。

1.3.8 固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵單寧酶動力學參數(shù)的測定

在最適條件下，以不同濃度（0.25～5 mmol/L）的沒食子酸丙酯溶液為底物測定酶活力，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）求得和。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 固、液態(tài)發(fā)酵對重組菌生長規(guī)律的影響

測定固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵不同生長時間的細胞干質量，使用Prism 8.0擬合出固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的畢赤酵母重組菌的Logistic生長曲線。如圖1所示，相比于液態(tài)發(fā)酵的生物量，固態(tài)發(fā)酵的生物量提高了約22.3%。這與已經(jīng)報道的一些研究一致，López等對生產(chǎn)漆酶的畢赤酵母重組菌進行固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的研究，發(fā)現(xiàn)相對于液態(tài)發(fā)酵的生物量，固態(tài)發(fā)酵的生物量提高了約38%；Guerrero-Urrutia等對巴西曲霉產(chǎn)菊粉酶的固、液態(tài)發(fā)酵進行了探究，發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵的生物積累量超過液態(tài)發(fā)酵的生物積累量。上述結果充分說明重組畢赤酵母在固態(tài)發(fā)酵中具有巨大的內(nèi)在潛力。

圖1 畢赤酵母重組菌的生長曲線Fig.1 Cell growth curves of recombinant P.pastoris

2.2 固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵畢赤酵母細胞聚集性差異的分析

如圖2所示，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)48 h，畢赤酵母細胞分布相對分散，形成較小的畢赤酵母細胞聚集體；培養(yǎng)96 h，觀察畢赤酵母細胞聚集體有所增大。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)48 h，畢赤酵母細胞在聚氨酯海綿較為平坦的結構上相對分散，但形成了簇狀細胞聚集體，而在聚氨酯海綿凹陷的結構上形成了體積較大細胞聚集體或生物膜；培養(yǎng)96 h，觀察到聚氨酯海綿上細胞簇狀聚集體和生物膜進一步增大和增厚。目前對于酵母生物膜的研究主要集中在致病酵母。酵母細胞的附著是由被稱為黏附素的特定黏附分子介導。根據(jù)已經(jīng)報道關于釀酒酵母的文獻中，酵母生物膜的形成有多種蛋白的參與，包括Flo11p和Ccw14p等，其中Flo11p直接參與了固體或半固體瓊脂、塑料表面以及氣液界面上生物膜的形成。

圖2 固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵畢赤酵母的電鏡照片F(xiàn)ig.2 Morphological differences between cellular aggregates in SSF and SMF

2.3 固、液態(tài)發(fā)酵對重組菌產(chǎn)酶量的影響

如圖3所示，兩種發(fā)酵方式誘導期間細胞干質量均無明顯變化，其原因為BMGY培養(yǎng)基中的甘油會抑制畢赤酵母中AOX1啟動子，當培養(yǎng)48 h后，甘油幾乎消耗殆盡，此時加入甲醇，AOX1失去了甘油的抑制后開始啟動，對目的基因進行表達，此時的酵母細胞更多的能量用來表達蛋白而不是自身的生長繁殖。所以誘導期間固液兩種發(fā)酵方式的重組菌細胞干質量均無明顯變化。液態(tài)發(fā)酵在誘導144 h發(fā)酵上清液單寧酶活力達到最大值8.93 U/mL，此時發(fā)酵上清液的總蛋白質量濃度為0.59 g/L（圖3A）。固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵上清液單寧酶活力同樣在誘導144 h達到最大值2.43 U/mL，其總蛋白質量濃度為0.26 g/L（圖3B）。固態(tài)發(fā)酵在其生物量平均高出液態(tài)發(fā)酵生物量約22.3%的情況下，單寧酶表達量只達到液態(tài)發(fā)酵的單寧酶表達量的27.2%。相同情況也出現(xiàn)在López等研究中，在固態(tài)發(fā)酵生物量（49 g/L）高出液態(tài)發(fā)酵生物量（35 g/L）約38%的情況下，固態(tài)發(fā)酵時單寧酶表達量不及液態(tài)發(fā)酵時單寧酶表達量的50%。

圖3 液態(tài)發(fā)酵（A）和固態(tài)發(fā)酵（B）的產(chǎn)酶曲線Fig.3 Tannase-producing curves in SSF (A) and SMF (B)

2.4 甲醇體積分數(shù)對重組菌固、液發(fā)酵產(chǎn)酶量的影響

由表1可知，隨著誘導劑甲醇添加量的升高，誘導出的酶活力也在提高，其中液態(tài)發(fā)酵過程在甲醇添加量為3%時酶活力達到最大值，在48 h和72 h分別達到了3.34 U/mL和5.30 U/mL；但是固態(tài)發(fā)酵過程中畢赤酵母在甲醇添加量為2%時有最高酶活力，分別為0.72、1.86 U/mL和2.23 U/mL。一般認為甲醇是大多數(shù)巴斯德畢赤酵母發(fā)酵策略中的主要碳源和基因表達誘導劑，但高濃度甲醇對細胞有毒性，會導致甲醛和過氧化氫的積累，從而導致細胞死亡。同時，死亡的細胞還包含自噬的情況存在，在細胞的高密度培養(yǎng)中出現(xiàn)細胞自噬的情況是被探究過的。隨著甲醇添加量的增加，在添加量為4%時兩種發(fā)酵方式的酶活力均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。

表1 甲醇添加量對畢赤酵母產(chǎn)酶固、液態(tài)的影響Table 1 Effect of methanol addition at the beginning of each fermentation running on the growth of P.pastoris in SSF and SMF

2.5 SDS-PAGE分析

為進一步分析固、液態(tài)發(fā)酵的差異，將兩者發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示。兩者均產(chǎn)生了80 kDa的蛋白，但固態(tài)發(fā)酵液中在50 kDa分子質量處也出現(xiàn)了蛋白條帶。由上述結果推測，固態(tài)發(fā)酵使得單寧酶產(chǎn)生了更多的修飾，而這很可能是造成酶性質發(fā)生改變的原因。

圖4 重組單寧酶菌株在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵SDS-PAGE的差異分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of tannases produced in SSF and SMF

2.6 固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵單寧酶酶學性質差異分析

為分析固態(tài)發(fā)酵是否會對單寧酶的酶學性質產(chǎn)生變化，測定1.3.3節(jié)所取樣品（誘導72 h的發(fā)酵上清液）的酶學性質，結果如圖5所示。由圖5A可知，固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的單寧酶最適溫度為30 ℃，液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的單寧酶最適溫度為20 ℃，固態(tài)發(fā)酵的方式使單寧酶的最適溫度提高了10 ℃。由圖5B可知，固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的單寧酶的最適pH值均為6.0。由圖5C可知，在50 ℃的處理條件下，兩發(fā)酵方式所產(chǎn)的單寧酶殘余酶活力無差異，而在60 ℃的處理條件下，兩發(fā)酵方式所產(chǎn)的單寧酶殘余酶活力下降趨勢相同，但液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶的熱穩(wěn)定性略優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的單寧酶。由圖5D可知，兩發(fā)酵方式所產(chǎn)的單寧酶殘余酶活力下降趨勢相同，整體看，在pH 4～11的范圍內(nèi)液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶的pH值穩(wěn)定性略優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵。

圖5 重組菌株在固液發(fā)酵條件下的單寧酶酶學性質差異Fig.5 Enzymatic properties of tannases produced in SSF and SMF

以沒食子酸丙酯為底物經(jīng)雙倒數(shù)法擬合，測得液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶為17.85 mmol/（Lgmin），為9.93 mmol/L，固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶為11.93 mmol/（Lgmin），為10.07 mmol/L。值并無太大差異，說明所產(chǎn)單寧酶的底物親和度相同。而出現(xiàn)差異是因為固態(tài)發(fā)酵中50 kDa蛋白分子的存在使得整體催化效率降低。

3 討 論

單寧酶在食品產(chǎn)業(yè)中應用潛力巨大，如何降低單寧酶的生產(chǎn)成本，一直被人們所關注。其中優(yōu)化單寧酶的生產(chǎn)方式是主要的策略之一。近些年來，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，對能源的需求日益增強，因此，尋求更加綠色高效的單寧酶生產(chǎn)方式，對于我國食品酶制劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關重要。

在本研究發(fā)現(xiàn)，相比于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵使得重組菌的生物量提高了約22.3%。在Lima-Pérez等的研究中，當培養(yǎng)基中甘油質量濃度為100 g/L時，固態(tài)發(fā)酵的畢赤酵母生物量最高為35 g/L，而液態(tài)發(fā)酵的畢赤酵母生物量最高為15 g/L。這些結果表明，使用固態(tài)發(fā)酵可以在不額外通氧氣的情況下獲得高密度畢赤酵母細胞。培養(yǎng)環(huán)境中氧氣的可用性取決于每個培養(yǎng)體系面積/體積比特性的差異。在固態(tài)發(fā)酵中液態(tài)培養(yǎng)基吸附在蓬松的基質（聚氨酯海綿）上，面積/體積比較高，培養(yǎng)基中的氧氣含量更高；而液態(tài)發(fā)酵由于面積/體積比較低，培養(yǎng)基中的氧氣含量較低，酵母將消耗大量能量用于細胞維持。因此，相比于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵在細胞維持上消耗較低的能量，同時獲得了更多的生物量。

對于已經(jīng)獲得較高生物量的固態(tài)發(fā)酵，理應得到更高的酶表達量，然而本研究并未獲得相應的實驗結果。分析可能是物質傳質不均所造成，López-Pérez等研究發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵之間的生理差異與兩個獨立過程的傳質現(xiàn)象相關，其一為空氣和液體培養(yǎng)基之間的氧氣傳質，其二為液體培養(yǎng)基和酵母細胞之間的誘導劑（甲醇）傳質。在聚氨酯海綿中，固態(tài)發(fā)酵的面積/體積比比液態(tài)發(fā)酵高近100 倍，氧氣可以充分傳質到吸附在整個聚氨酯海綿網(wǎng)絡中的液體培養(yǎng)基，提高了氧氣可用性，使固態(tài)發(fā)酵獲得更高的生物量。固態(tài)發(fā)酵的基質是獨立的立方體，這種基質是不連續(xù)的，使甲醇向酵母細胞擴散不均勻；而液態(tài)發(fā)酵的基質是液態(tài)的培養(yǎng)基，這種基質是連續(xù)流動的，有利于甲醇在酵母細胞間擴散。同時，在圖2中觀察到固態(tài)發(fā)酵的聚氨酯海綿基質上形成了數(shù)量較多和體積較大的畢赤酵母細胞聚集體或生物膜，這不利于甲醇在酵母細胞間擴散?？赡芏鄶?shù)情況下只有聚集體表面的畢赤酵母細胞可以獲得甲醇，而聚集體內(nèi)部畢赤酵母細胞無法獲得或獲得少量甲醇，使得固態(tài)發(fā)酵雖然具有較高的生物量卻難以發(fā)揮其優(yōu)勢。甲醇的擴散得到抑制不理想，因為之前有研究報道揮發(fā)性有機物可以部分分散在環(huán)境中。

在探究甲醇添加量的過程中，相同甲醇添加量隨著時間的延長，酶活性會增加，這是由于畢赤酵母不斷地利用甲醇表達分泌酶，造成了酶的積累，提高了基質中酶濃度。隨著甲醇添加量的增加，各組所獲得的酶活力隨著誘導時間的延長均出現(xiàn)了先升高后下降的趨勢，下降的原因是在低甲醇情況下，甲基營養(yǎng)型酵母會優(yōu)先表達基因，而在高甲醇體積分數(shù)的條件下，會在基因表達之前優(yōu)先表達基因，從而導致甲醛的積累，進而對酵母細胞產(chǎn)生毒害作用。固態(tài)發(fā)酵過程隨著甲醇添加量的提高，酶活力峰值更早，是由于甲醇分布不均勻，部分聚集體表面的酵母細胞接觸到相對更高的甲醇體積分數(shù)，使得細胞死亡現(xiàn)象出現(xiàn)更早。

對于固、液兩種發(fā)酵方式產(chǎn)生酶的酶學性質研究中，固態(tài)發(fā)酵單寧酶的最適溫度比液態(tài)發(fā)酵高10 ℃。推測固態(tài)發(fā)酵單寧酶在排出細胞的過程中酵母細胞對其進行了某種特殊的修飾，這種修飾是在液態(tài)培養(yǎng)中并未發(fā)生的。畢赤酵母強大的修飾系統(tǒng)會使得外源蛋白在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)出蛋白的結構有輕微差異。Maffucci等研究表明酶的熱適應涉及分子結構和反應性質的復雜變化。Siadat等在改變畢赤酵母表達的纖維二糖脫氫酶的糖基化位點的過程中，發(fā)現(xiàn)減少糖基化位點的同時會降低酶的熱穩(wěn)定性。同樣，在Rana等的報道中，固態(tài)發(fā)酵的單寧酶也因為在酶蛋白被分泌出的過程中產(chǎn)生了與液態(tài)發(fā)酵不同的修飾而導致兩種發(fā)酵方式所產(chǎn)酶的性質出現(xiàn)輕微差異。同時，酶最適溫度的升高也降低了其工業(yè)應用的成本。在溫度穩(wěn)定性的比較中，50 ℃處理，二者的相對酶活力變化無差異；60 ℃處理時，二者具有相同的下降趨勢，但是固態(tài)發(fā)酵酶活力喪失更快，原因是固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的酶在構象上發(fā)生的輕微變化使得酶分子的熱穩(wěn)定性出現(xiàn)輕微降低，但這種降低并不明顯。

通過對畢赤酵母單寧酶固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的比較分析，推測固態(tài)發(fā)酵具有較高生物量卻未獲得較高酶活力的原因是多方面的，比如誘導劑甲醇的分布不均勻、固態(tài)發(fā)酵基質的差異及氧氣含量的分布不均等，仍需開展進一步研究分析。

4 結 論

對畢赤酵母工程菌分別進行固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，分別比較了生物量、產(chǎn)酶量、所產(chǎn)酶蛋白分子質量和酶性質的差異。固態(tài)發(fā)酵得到了較高生物量卻沒有得到較高酶活力，并且由于固態(tài)發(fā)酵條件下蛋白被過度修飾導致了其所產(chǎn)酶的最適溫度升高。后續(xù)可以開展實驗對固態(tài)發(fā)酵的工藝條件進行探究，對固態(tài)發(fā)酵蛋白分子改變的原因進行深入挖掘，這對模式菌株的固態(tài)發(fā)酵以及酶的高效生產(chǎn)都有積極意義。