傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中嗜鹽四聯(lián)球菌的分離鑒定及增鮮菌株篩選

潘國(guó)楊，安飛宇，曹愷欣，劉進(jìn)昌，趙 越，趙 悅，徐菁雯，王雨生，馬媛媛，武俊瑞，烏日娜,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，沈陽(yáng)市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.煙臺(tái)欣和企業(yè)食品有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

作為傳統(tǒng)調(diào)味品，豆醬因其具有的獨(dú)特的鮮味，至今仍深受大眾青睞。鮮味能使人產(chǎn)生舒服愉快的感覺，是人體必不可少的味覺需求。1978年，Yamasaki等首次從木瓜蛋白酶降解的牛肉水解物中分離純化得到一種氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala的辛肽，將其命名為鮮味肽，近年來(lái)，在許多肉類、豆類、水產(chǎn)品等食物中分離出多種新型鮮味肽。Han Fuliang等在黃酒中發(fā)現(xiàn)了一種僅由Glu組成且具有鮮味的三肽，Su Guowan等從花生中提取到一種鮮味增強(qiáng)肽。有研究發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌（）廣泛存在于豆醬、豆豉、醬油、等發(fā)酵食品中，具有提升發(fā)酵食品風(fēng)味、改善發(fā)酵食品品質(zhì)的功能。

本課題組前期研究表明，嗜鹽四聯(lián)球菌是豆醬發(fā)酵過程中影響風(fēng)味形成的關(guān)鍵菌種，與風(fēng)味肽的合成代謝密切相關(guān)。在豆醬的不同發(fā)酵階段嗜鹽四聯(lián)球菌屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，但是目前還鮮有關(guān)于嗜鹽四聯(lián)球菌在發(fā)酵豆醬中生產(chǎn)鮮味肽提高其鮮味強(qiáng)度的報(bào)道。因此，本研究從96 份傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離出47 株嗜鹽四聯(lián)球菌，通過測(cè)定風(fēng)味指標(biāo)篩選出具有增鮮潛力的最佳菌株，旨在為拓寬嗜鹽四聯(lián)球菌在發(fā)酵食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)我國(guó)新型調(diào)味品的開發(fā)和行業(yè)水平提升，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

豆醬樣品：采自遼寧沈陽(yáng)、本溪、遼中、遼陽(yáng)、大連、錦州、鞍山7 個(gè)地區(qū)96 份自然發(fā)酵豆醬。

標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 33315 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；CICC 10286、CICC 24788 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；CCTCC AB 2011059 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

那他霉素、氯化鈉、酪蛋白、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

改良MRS培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g、無(wú)水乙酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、七水合硫酸鎂0.575 g、一水合硫酸錳0.25 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸三鈉2.42 g、酵母浸粉4.0 g、牛肉浸膏8.0 g、吐溫80 1 g、氯化鈉100 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

產(chǎn)蛋白酶篩選培養(yǎng)基：酪蛋白10.0 g、酵母粉3.0 g、NaHPOg12HO 5.0 g、NaCl 50.0 g、溴麝香草酚藍(lán)0.05 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；紫外-可見分光光度計(jì)龍尼柯（上海）儀器有限公司；電子舌 日本Insent公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 豆醬中嗜鹽四聯(lián)球菌的分離與鑒定

參考GB 4789.35ü2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法處理。挑取菌落較小、有明顯溶鈣圈、呈乳白色且不透明，與乳酸菌菌落形態(tài)相似的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，選取對(duì)狀或四聯(lián)球狀的菌體純化培養(yǎng)保藏。參照《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》及《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，生理生化特征鑒定主要包括：糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、酪蛋白水解實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

參考武俊瑞等的方法稍作修改，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：提取G細(xì)菌DNA，利用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（5’-3’））和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT（5’-3’）），PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列。將PCR產(chǎn)物送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序工作。

1.3.2 高產(chǎn)鮮味肽嗜鹽四聯(lián)球菌篩選

1.3.2.1 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為31 ℃，鹽質(zhì)量濃度為10 g/100 mL，接種量為3%。

1.3.2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)蛋白酶活力測(cè)定

參照張延杰等的方法稍作修改。根據(jù)透明圈與菌落的面積比判斷菌株的產(chǎn)酶能力，從而篩選出具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株。采用酪蛋白法測(cè)定初篩菌株的蛋白酶活力。

1.3.2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（-glutamyl transpeptidase，-GT）活力測(cè)定

參照Li Xuepeng等的方法稍作修改。使用-GT活性檢測(cè)試劑盒（G-CLONE），用分光光度法測(cè)定-GT活性。

1.3.2.4 嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)多肽能力測(cè)定

參考Ruan Siyu等的方法稍作修改。將1 mL稀釋的改良MRS培養(yǎng)基發(fā)酵上清液添加到4 mL雙鎖脲試劑中。充分搖動(dòng)混合物，并在室溫（25f1）℃放置30 min，然后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。將0、2、4、8、10、12、16 mg/mL和20 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每毫升發(fā)酵液中的肽質(zhì)量計(jì)，多肽含量計(jì)算公式如下：

式中：為樣品的吸光度；為樣品的稀釋倍數(shù)；0.000 6為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；0.014 1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.2.5 電子舌測(cè)定

參照安飛宇等的方法稍作修改。對(duì)傳感器進(jìn)行活化，電子舌系統(tǒng)自檢完成后，將發(fā)酵液直接倒入電子舌專用燒杯中，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)4 次，測(cè)試鮮味、咸味、酸味、澀味還有苦味，為減少系統(tǒng)誤差，原始數(shù)據(jù)選取后3 次測(cè)定的數(shù)據(jù)。

1.3.3 因子分析

主要步驟為：1）確定分析變量，收集數(shù)據(jù)資料；2）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；3）計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣；4）計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣的特征值和貢獻(xiàn)率等；5）對(duì)因子載荷矩陣進(jìn)行旋轉(zhuǎn)處理；6）計(jì)算因子得分。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

采用Excel 2019對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，使用IBM SPSS Statistics 21數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析，數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆醬中嗜鹽四聯(lián)球菌的分離鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)7 個(gè)地區(qū)96 份東北自然發(fā)酵豆醬樣品進(jìn)行預(yù)處理后，通過革蘭氏染色對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，共分離出疑似嗜鹽四聯(lián)球菌83 株。檢測(cè)其DNA的濃度和純度，發(fā)現(xiàn)菌株均符合PCR擴(kuò)增體系的要求，后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)16S rDNA區(qū)域進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)菌落形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果對(duì)83 株疑似嗜鹽四聯(lián)球菌進(jìn)行16S rDNA序列同源性對(duì)比分析，得到47 株嗜鹽四聯(lián)球菌，如表1所示。

表1 菌株編號(hào)來(lái)源及16S rDNA序列同源性對(duì)比結(jié)果Table 1 Results of 16S rDNA sequence homology of 47 T.halophilus strains

續(xù)表1

2.1.2 生理生化特征

對(duì)待測(cè)菌株LY9-1進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，結(jié)果如表2所示，菌株LY9-1不具有運(yùn)動(dòng)性，能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不產(chǎn)生吲哚，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)氨氣，過氧化氫酶、淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，不能水解酪蛋白，可發(fā)酵半乳糖、甘露糖、麥芽糖以及果糖，不能發(fā)酵鼠李糖和木糖。根據(jù)細(xì)菌鑒定手冊(cè)可知符合嗜鹽四聯(lián)球菌的生理生化特征。

表2 菌株LY9-1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical test on strain LY9-1

選取菌株LY9-1擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)定所得序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中己知序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株LY9-1與嗜鹽四聯(lián)球菌的模式菌株處于同一分支，相似性達(dá)99.17%，可認(rèn)為是屬內(nèi)同種。同時(shí)，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定菌株LY9-1為嗜鹽四聯(lián)球菌，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

圖1 LY9-1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain LY9-1 and their relatives

2.2 呈鮮潛力最佳嗜鹽四聯(lián)球菌的篩選

2.2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)蛋白酶、-GT、多肽能力及電子舌分析

續(xù)表3

豆醬發(fā)酵中微生物分泌多種蛋白酶，可以將原料中的蛋白質(zhì)水解為肽類，對(duì)改善豆醬風(fēng)味起重要作用，同時(shí)由于豆醬中食鹽濃度較高，會(huì)抑制蛋白酶的活力，而嗜鹽四聯(lián)球菌屬于耐鹽乳酸菌，因此為了使大豆蛋白更好地降解，篩選蛋白酶活力高的耐鹽菌株尤為重要。如表3所示，相較于空白組，所有菌株均有產(chǎn)蛋白酶能力，47 株菌株中SY2-3蛋白酶活力最低，為（6.09f0.02）U/mL；LY9-1蛋白酶活力最高，達(dá)（85.45f0.03）U/mL。ATCC 33315蛋白酶活力為（48.28f0.02）U/mL，活性較高，具有一定代表性。

表3 嗜鹽四聯(lián)球菌產(chǎn)鮮指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Protease-producing capacity, γ-GT activity, peptide production and electronic tongue umami values of T.halophilus

-GT（EC 2.3.2.2）對(duì)發(fā)酵過程中呈鮮和增鮮有重要作用，在生物體的谷胱甘肽代謝途徑中是一個(gè)重要的關(guān)鍵酶。豆醬的鮮味很大程度上取決于Glu的濃度。發(fā)酵過程中，大豆蛋白被多種蛋白酶消化成肽，然后在發(fā)酵過程中肽被肽酶切割成氨基酸，釋放出來(lái)的Gln會(huì)被-GT水解成Glu。如果-GT量不足，則Gln會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)化為無(wú)味或微酸的焦谷氨酸。-谷氨酰肽是一類含有谷氨酸殘基的小分子肽，添加到含有基本味覺物質(zhì)的食品體系中時(shí)，他們能夠與食品中的基本味覺物質(zhì)相互協(xié)同增鮮，賦予其明顯的厚味或者增強(qiáng)厚味。如表3所示，47 株嗜鹽菌中，LY9-3產(chǎn)酶能力最高，達(dá)（53.67f0.02）U/mL，LY9-1產(chǎn)酶能力僅次于LY9-3，為（44.23f0.03）U/mL，遠(yuǎn)超過空白組。菌株LZ7產(chǎn)酶能力最低，為（5.41f0.01） U/mL。

近年來(lái)小分子可溶性肽類物質(zhì)是風(fēng)味研究的重點(diǎn)，其能夠明顯改善食品味感或者掩蓋不良風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)組菌株的多肽質(zhì)量濃度均遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組的（0.75f0.02）mg/mL，即可認(rèn)定47 株嗜鹽四聯(lián)球菌均有產(chǎn)多肽能力。如表3所示，LY9-1發(fā)酵液多肽質(zhì)量濃度最高，達(dá)（17.55f0.13）mg/mL，是ATCC 33315的4.71 倍。BX42-1發(fā)酵液多肽質(zhì)量濃度最低，僅（0.04f0.01）mg/mL。

通過電子舌測(cè)定不同菌株大豆發(fā)酵液的鮮味值，如表3所示，LY9-1的鮮味值最高，高達(dá)15.05f0.02。同時(shí)，為免除培養(yǎng)基中牛肉膏、酵母浸粉對(duì)鮮味強(qiáng)度的干擾，設(shè)置了空白組。結(jié)果也表明其鮮味值遠(yuǎn)大于空白組（9.13f0.00），LZ7鮮味值最低，為6.16f0.07。如圖2所示，對(duì)比LY9-1與ATCC 33315大豆發(fā)酵液以及空白組的9 種滋味，即酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味、澀味、苦回味、澀回味和豐富度，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌以及空白組的回味與咸味差別不大，甜味、酸味、鮮味有較大差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的鮮味高于空白組，同時(shí)厚味也有所提升，可能是鮮味與厚味之間有協(xié)同作用。

圖2 嗜鹽四聯(lián)球菌LY9-1呈味特性Fig.2 Taste characteristics of the fermentation broth of T.halophilus LY9-1

2.2.2 因子分析

針對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同嗜鹽四聯(lián)球菌菌株產(chǎn)風(fēng)味指標(biāo)有所差異，為綜合評(píng)價(jià)不同嗜鹽四聯(lián)球菌菌株對(duì)風(fēng)味的影響，在因子分析基礎(chǔ)上，利用因子得分對(duì)51 株嗜鹽四聯(lián)球菌進(jìn)行風(fēng)味評(píng)價(jià)。因子分析是通過相關(guān)系數(shù)矩陣的內(nèi)在聯(lián)系，能找到少數(shù)幾個(gè)變量描述原始變量間的相關(guān)性。根據(jù)變量間相關(guān)性的大小進(jìn)行分組，根據(jù)因子得分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法。從2010年起，應(yīng)用因子分析法的論文每年有3 000多篇。說(shuō)明因子分析法的應(yīng)用有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和實(shí)踐意義。

2.2.2.1 KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）和Bartlett球形檢驗(yàn)

為確定不同風(fēng)味指標(biāo)數(shù)據(jù)是否適宜進(jìn)行因子分析，首先對(duì)KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。KMO值為0.682，數(shù)值在0.5～1之間且接近于1，表明變量間的相關(guān)性較大。Bartlett球形檢驗(yàn)，顯著性顯示為0.000，小于0.005，說(shuō)明數(shù)據(jù)滿足總體正態(tài)分布。因此，不同嗜鹽四聯(lián)球菌的風(fēng)味指標(biāo)數(shù)據(jù)可進(jìn)行因子分析。

表4 KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)Table 4 Results of KMO and Bartlett tests

2.2.2.2 不同嗜鹽四聯(lián)球菌呈味數(shù)據(jù)因子分析

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析，依據(jù)表5可知，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到83.188%，特征值為2.496，大于1，綜合了菌株呈味指標(biāo)的大部分信息，因此提取1 個(gè)公因子即可。

表5 不同菌株風(fēng)味指標(biāo)的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and variance contribution rates of first three principal factors for flavor indexes of different strains

2.2.2.3 不同嗜鹽四聯(lián)球菌呈味能力綜合評(píng)價(jià)

如表6所示，3 個(gè)公因子載荷均較大，說(shuō)明這3 類風(fēng)味指標(biāo)具有較強(qiáng)相關(guān)性。根據(jù)因子得分系數(shù)矩陣，發(fā)現(xiàn)多肽含量對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌呈味影響因素最大，根據(jù)各風(fēng)味指標(biāo)貢獻(xiàn)率的大小分配其權(quán)重，-GT活性、蛋白酶活性和多肽含量權(quán)重值分別為0.371、0.342和0.382，以此建立因子得分模型=0.371＋0.342＋0.382。

表6 旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣和因子得分系數(shù)矩陣Table 6 Rotated loading and component score coefficient matrix

因?yàn)橹挥? 個(gè)主成分，因此按各公因子對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)數(shù)計(jì)算得綜合統(tǒng)計(jì)量，即值，最后根據(jù)所求值對(duì)菌株呈味效果進(jìn)行排序，如表7所示，標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 33315在所有實(shí)驗(yàn)組中綜合評(píng)分排名第33，推測(cè)其呈味效果適中。在47 株篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的嗜鹽四聯(lián)球菌中，呈味效果最強(qiáng)的菌株是LY9-1，最差的菌株是LZ7。

表7 因子綜合得分Table 7 Comprehensive scores of principal factors for 47 T.halophilus strains in decreasing order

3 結(jié) 論

從采集自7 個(gè)地區(qū)96 份東北自然發(fā)酵豆醬樣品中共分離出疑似嗜鹽四聯(lián)球菌83 株，根據(jù)菌落形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果對(duì)83 株疑似嗜鹽四聯(lián)球菌進(jìn)行16S rDNA序列同源性對(duì)比分析，得到47 株嗜鹽四聯(lián)球菌，同時(shí)對(duì)菌株LY9-1進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，驗(yàn)證其符合嗜鹽四聯(lián)球菌的基本特征。通過對(duì)47 株嗜鹽四聯(lián)球菌進(jìn)行分離篩選，根據(jù)變異系數(shù)大小得出不同菌株對(duì)風(fēng)味指標(biāo)影響順序?yàn)槎嚯暮浚?GT活性＞蛋白酶活性，通過因子得分綜合評(píng)價(jià)了47 株嗜鹽四聯(lián)球菌的產(chǎn)風(fēng)味能力高低，得到產(chǎn)風(fēng)味能力最好的菌株為L(zhǎng)Y9-1，其產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)-GT酶和產(chǎn)多肽能力均較強(qiáng)。同時(shí)電子舌結(jié)果顯示LY9-1發(fā)酵液鮮味值最高，符合上述結(jié)果，推測(cè)嗜鹽四聯(lián)球菌LY9-1擁有產(chǎn)鮮味肽的潛力，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)酵液鮮味的形成。我國(guó)對(duì)鮮味肽的研究尚處于起步階段，并且多數(shù)成果僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，有關(guān)風(fēng)味基因仍處在研究瓶頸期，已證實(shí)的呈鮮基因稀少，關(guān)于鮮味肽呈味機(jī)制等深層次研究仍亟待進(jìn)一步加強(qiáng)。