一種西葫蘆根腐病病原鑒定及其致病范圍

耿麗華，史 越，張國裕，李海真，宋順華

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室·農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室·北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所 北京 100097）

西葫蘆（L.）是我國重要的經(jīng)濟作物之一，在北京的生產(chǎn)以果實作為蔬菜為主，其含有較多的維生素C，具有較高的栽培價值，深受廣大消費者的喜愛。近年來，由于長期的連作使得土傳病害日益蔓延，因此在栽培過程中容易受到病害的危害，并造成極大的損失。西葫蘆根腐病一直是保護地種植中西葫蘆的重要病害，主要造成植株萎蔫和爛根，國內(nèi)外均有研究報道。該病發(fā)病率高，往往導(dǎo)致發(fā)病植株死亡，嚴重影響產(chǎn)量。迄今為止，國內(nèi)外已報道可引起西葫蘆萎蔫和根腐的病原菌很多，而且差異很大，主要的病原菌有疫霉菌、露濕擬漆斑菌和腐皮鐮刀菌，均為常見的土壤習(xí)居菌，但導(dǎo)致北京地區(qū)西葫蘆根腐病的病原菌種類尚未見報道。

2020 年5 月，京郊四季青試驗基地溫室栽培的西葫蘆出現(xiàn)了一種新的根部病害，該病害在初花期開始發(fā)生，當發(fā)現(xiàn)有植株萎蔫時，病株率已經(jīng)達到30%以上。仔細觀察萎蔫植株，其根部腐朽，用手輕輕向上拉動植株地上部分，植株可以從莖基部斷開，切開其莖基部可見維管束褐化。為弄清京郊發(fā)生的西葫蘆根腐病病原，筆者采集典型發(fā)病植株，對病原菌進行分離鑒定，并進一步對該病原菌的致病范圍進行了測定,以期為該病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試發(fā)病植株：具有典型發(fā)病癥狀的西葫蘆植株于2020 年5 月在京郊四季青試驗農(nóng)場的溫室內(nèi)采集。

供試品種：試驗所用的西葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜、番茄、辣椒、茄子、白菜、油菜、甘藍、蘿卜等26 個品種（表1），均從京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司購買。

表1 供試蔬菜品種

試劑及儀器：真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，北京新時代眾合科技有限公司；其他無機試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂17 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL；康乃馨水瓊脂培養(yǎng)基（carnation leaf agar，CLA）：瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、每個6 cm 直徑的培養(yǎng)基平板上加入大小約為4 mm的康乃馨葉片4～5 塊。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose，PD）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL。所有培養(yǎng)基使用之前均于120 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法，從典型發(fā)病植株根莖的病健交界處取小塊組織，在75%乙醇溶液中浸泡2 s，用滅菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，放置在PDA 平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長出，分離菌株并單孢純化。

1.2.2 分離物致病性測定 將分離物在25 ℃條件下PDA 培養(yǎng)7 d，從菌落邊緣取直徑為5 mm 左右的菌絲塊5 個，加入裝有250 mL PD 液體培養(yǎng)基的平底瓶（500 mL）中，120 r·min、25 ℃振蕩培養(yǎng)7 d后過濾，將過濾液離心收集孢子，加無菌水配制成濃度為1×10個·mL的孢子懸浮液，備用。將滅菌的栽培土（∶∶＝4∶2∶1）按10∶1 的比例與孢子懸液混合均勻，裝入口徑210 mm 營養(yǎng)缽供播種用。將供試種子分別于2%NaCl 溶液浸泡5 min，撈出控干水分，催芽后播種；每缽播10 粒出芽種子，每個品種播種2 缽（接菌和不接菌對照各1缽），置于25～30 ℃溫室中常規(guī)管理。3 次重復(fù)，隨機區(qū)組設(shè)置。

播種后，觀察植株的發(fā)病情況，同時對發(fā)病植株進行癥狀觀察、病原菌分離及病原菌形態(tài)觀察和比較。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：在25 ℃黑暗條件下，PDA 培養(yǎng)病原菌，觀察菌落形態(tài)并測量其7 d 的平均生長速率；在25 ℃黑暗條件下，CLA 培養(yǎng)病原菌，顯微觀察大型分生孢子、小型分生孢子，在倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式。依據(jù)Leslie 和Summerell 等相關(guān)分類方法進行種類鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：在25 ℃條件下，PDA 培養(yǎng)病原菌5 d，收集菌絲體，加液氮研磨成粉末，用試劑盒提取其DNA；采用真菌通用引物ITS1/ITS4進行該病原菌rDNA 核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR 擴增，并進一步采用翻譯延伸因子-引物EF-1/EF-2進行-序列的PCR 擴增。反應(yīng)體系及擴增參照耿麗華等的方法進行。擴增片段由北京新時代眾合科技有限公司進行測序，將得到的序列在NCBI 中檢索并下載同源序列，然后使用MEGA 7 軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自舉法對發(fā)育樹進行1000 次重復(fù)檢驗。

1.2.4 病原菌致病范圍測定 每個品種挑選10 粒經(jīng)過催芽的種子用于播種。病原菌接種方法、播種和管理方法同1.2.2。試驗均設(shè)不接種作為對照。播種后，觀察記錄植株的發(fā)病和死亡情況。以地上部出現(xiàn)萎蔫、植株死亡或莖基部出現(xiàn)褐化為發(fā)病標準，發(fā)病率為發(fā)病株數(shù)占供試株數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物及其致病性測定

取西葫蘆發(fā)病植株莖基部的病健交接處進行分離培養(yǎng)，獲得2 個分離物。經(jīng)過致病性測定，其中1 個分離物能夠使西葫蘆發(fā)病，可觀察到接種發(fā)病的西葫蘆幼苗的莖基部褐化，同時，所設(shè)未接種的對照生長正常、沒有任何癥狀（圖1）。對接種發(fā)病植株進行分離培養(yǎng)，再次獲得的分離物與所接種的分離物形態(tài)一致，證明該分離物為病原菌。另一個分離物不能使西葫蘆發(fā)病，不是該病害的病原菌。

圖1 致病性測定

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 由圖2 可以看出，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落為圓形，邊緣整齊，菌絲呈灰色絨毛狀，從菌落背面可以觀察到棕色色素；25 ℃條件下PDA 培養(yǎng)7 d，其生長速率為9.8 mm·d左右。

圖2 菌落形態(tài)

由圖3 可以看出，病原菌在CLA 培養(yǎng)基上，大型分生孢子稍彎曲，3～7 個隔，以4～5 個隔為多；小型分生孢子橢圓形、腎形或卵形，0～1 個隔，多數(shù)無隔；小型分生孢子最初聚生在長單瓶梗上的圓形假頭內(nèi)，隨著小型分生孢子的成長，假頭的包膜逐漸變薄，最后包膜徹底溶解，小型分生孢子分散出來。

圖3 病原菌分生孢子顯微形態(tài)特征

上述形態(tài)特征與腐皮鐮刀菌相符。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 提取該病原菌的DNA，對rDNA-ITS 和-序列進行PCR 擴增，獲得片段大小分別為587 bp 和726 bp。將這2 個序列分別提交至NCBI 進行同源序列檢索，結(jié)果均與腐皮鐮刀菌的序列同源性最高，達到99%。

基于該病原菌的-序列與NCBI 中屬的相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），該病原菌（Xh-EF）與KF372878 腐皮鐮刀菌菌株聚在同一分支，表明該病原菌為腐皮鐮刀菌。

圖4 基于TEF-1α 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病原菌致病范圍測定

由表2 可以看出，在接種后第21 天時，供試的4 個西葫蘆品種發(fā)病程度有較大差異，京葫1 號、京珠、京碧和京葫2 號植株發(fā)病率分別為70.00%、20.00%、10.00%和0。發(fā)病率隨著時間的延長而增加，接種后第35 天時，4 個品種的發(fā)病率均達到100.00%。南瓜和黃瓜在接種后第28 天時開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病率在品種間存在較大的差異，到接種后第42 天，黃瓜京研綠玲瓏2 號和京研優(yōu)勝的發(fā)病率分別為100.00%和60.00%；接種后第49天時，南瓜京欣砧6 號和京欣砧4 號的發(fā)病率分別為100.00%和10.00%。供試西瓜和甜瓜品種發(fā)病較晚，分別在接種后第42 天和第49 天才開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，西瓜華欣和京穎的植株發(fā)病率均為60.00%，2 個品種的發(fā)病率沒有差異；甜瓜京玉30和京玉綠寶的植株發(fā)病率分別為20.00%和25.00%，品種間發(fā)病率差別較小。供試的十字花科和茄科蔬菜的所有品種到接種后第49 天時都沒有出現(xiàn)發(fā)病癥狀，植株發(fā)病率均為0。

表2 人工接種后不同蔬菜品種的植株病死率 %

3 討論與結(jié)論

針對京郊發(fā)生的西葫蘆根腐病，筆者通過病原菌分離，并對其進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明病原菌為腐皮鐮刀菌，這與我國已報道的西葫蘆根腐病病原菌不同，而與西班牙Ana 等報道的結(jié)果相同。

已有的研究表明，腐皮鐮刀菌的寄主范圍非常廣泛。據(jù)國內(nèi)報道，它可導(dǎo)致甜瓜、西瓜、番茄和辣椒的根腐病，國外也有該菌為害西瓜、黃瓜、甜瓜和南瓜，引起根腐病的研究報道，但腐皮鐮刀菌導(dǎo)致西葫蘆根腐病在我國尚屬初次報道。致病范圍研究結(jié)果表明，引起西葫蘆根腐病的腐皮鐮刀菌能導(dǎo)致葫蘆科蔬菜的所有供試品種發(fā)病，但是不能導(dǎo)致茄科蔬菜和十字花科蔬菜的所有供試品種發(fā)病，這與Ana 等報道的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果還表明，該病原菌在葫蘆科的不同品種之間表現(xiàn)出致病性的差異。其中西葫蘆發(fā)病最早，病情發(fā)展迅速，而其他葫蘆科蔬菜均比西葫蘆發(fā)病晚，發(fā)病率也較低。同一種類的不同品種也存在感病性的差異，在接種后21 d 時，4 個西葫蘆品種的植株發(fā)病率為0～70.00%，2 個南瓜品種在接種后49 d 時，發(fā)病率分別為10.00%和100.00%，因此，不同品種間的感病性有非常明顯的差別。本研究的致病范圍測定是在病原菌孢子接種壓力極大的條件下進行的，進一步研究可通過適當降低接種壓力對葫蘆科蔬菜進行品種抗病性鑒定，從而篩選出相對抗病的品種或種質(zhì)資源。

腐皮鐮刀菌根腐病是土傳病害，在發(fā)病初期不容易被生產(chǎn)者發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)植株萎蔫癥狀，殺菌劑的防治效果不理想。筆者通過病原菌分離鑒定、較為系統(tǒng)的病原菌致病范圍測定，對于有針對性地防治該病害具有指導(dǎo)性的意義。依據(jù)本文的研究結(jié)果，為了有效防控腐皮鐮刀菌根腐病，在生產(chǎn)上可以采用不同種類瓜菜進行輪作，在茬口安排上西葫蘆不可與黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物輪作，可以與茄科作物、十字花科作物輪作，以減輕腐皮鐮刀菌根腐病的危害。