不同方式注射垂體后葉素對大鼠心肌缺血模型影響的研究

朱曉晴，吳 瓊，李 甜，王聰聰，張晨晨，李 武*，李鐵浪*

（湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學國內(nèi)一流建設(shè)學科，湖南 長沙 410208）

心肌缺血是由于心臟血液供需不平衡引起的病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為心絞痛、心律失常等，嚴重者可引起心肌梗死，甚至心力衰竭等多種心血管疾病[1-2]。對個人和醫(yī)療資源造成很大的負擔， 嚴重危害人類的生命健康[3]。 心肌缺血機制的研究一直是心血管方面和科研領(lǐng)域的熱點問題。 其中，構(gòu)建心肌缺血動物模型是研究的基礎(chǔ)，探討有效制備心肌缺血動物模型顯得尤為必要。

垂體后葉素可改善血流動力學，對血管平滑肌有強烈的收縮作用，尤其對冠狀動脈近端作用明顯[4]。垂體后葉素起效快而維持時間短，且收縮冠狀動脈引起的供血不足導致心肌缺血與臨床上患者的病理狀態(tài)比較接近。 腹腔和靜脈注射垂體后葉素制備心肌缺血模型，造模方法成熟，在科研實驗中廣泛使用。腹腔注射給藥簡便微創(chuàng)，利用腹膜及其豐富的血管，具有吸收面積大、能力強等特征，使其快速入血，進入心臟，發(fā)揮藥效[5-6]；靜脈注射給藥，藥物直接入血，通過體循環(huán)到達心臟，起效迅速[7]。 本實驗欲探索不同給藥方式對急性心肌缺血大鼠模型的影響，采用不同的注射給藥方式，包括腹腔注射給藥、尾靜脈注射給藥、股靜脈注射給藥，通過觀察心電圖變化、心肌損傷標志物和心肌組織形態(tài)學的改變，評估垂體后葉素不同給藥方式對心肌缺血模型的影響，為動物模型的制備提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇SPF 級SD 雄性大鼠32 只，鼠齡8～10 周，體質(zhì)量為250～280 g。 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009；倫理審查批準號：LL2020102301]，實驗動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，同等條件下分籠，每籠3 只，室溫24～ 26 ℃，相對濕度50%～70%，適應性喂養(yǎng)1 周。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4 組：正常組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、股靜脈注射組，每組8 只。 實驗過程中對動物的處理嚴格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》中的相關(guān)動物倫理學規(guī)定[8]。

1.2 主要儀器與試劑

ECG-2303B 型數(shù)字心電圖機（廣州市三銳電子科技有限公司）；R500 型瑞沃德通用型呼吸麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；IF50 型多功能酶標分析儀（瑞士帝肯有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋（生物科技有限公司）；TDZ4-WS 型低速離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司]。

垂體后葉素注射液（H34022977，6 U/mL，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司）；異氟烷（R510-22-16，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）； 鈣蛋白I （cardiac tro ponin I, cTn-I, 210218R19）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB, CK-MB，210218R23）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，210218R27）均購自江蘇菲亞生物科技有限公司。

1.3 各組處理方法

正常組：正常飼養(yǎng)，不做任何處理；腹腔注射組：腹腔注射垂體后葉素20 U/kg；尾靜脈注射組：尾靜脈注射垂體后葉素15 U/kg（5 s 恒速注射完畢）；股靜脈注射組：解剖并分離股靜脈，注入垂體后葉素10 U/kg。各組每24 h 注射1 次，連續(xù)注射3 次。 以上操作均在呼吸麻醉下進行（異氟烷麻醉：誘導濃度4%，維持濃度2%）。

尾靜脈注射組和股靜脈注射組造模中各脫落1只，考慮靜脈注射過快，控制藥物推注速度。

1.4 指標檢測

1.4.1 心電圖檢測 異氟烷維持麻醉下，連接數(shù)字心電圖機，對應肢體連接導聯(lián)，在造模前和第3 次注射垂體后葉素2、5、10 min 后分別測心電圖，記錄Ⅱ?qū)?lián)ST 段中J 點的變化幅度。 J 點的變化幅度值在計算時以PR 段為基線，取5 個連續(xù)波形變化的平均值。

1.4.2 血清指標檢測 第3 次給藥前禁食24 h，給藥后30 min，異氟烷維持麻醉下腹主動脈取血，血液樣本靜置30 min 后，3500 r/min，離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書檢測血清cTn-I、CKMB、LDH 的含量。

1.4.3 組織形態(tài)學檢測 處死大鼠后取出心臟，剪去其他不需要的血管和組織，生理鹽水沖洗干凈，放入4%多聚甲醛中固定。 24 h 后制備心肌組織的石蠟切片，進行HE 染色常規(guī)操作，顯微鏡下觀察心肌組織染色情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以“±s”表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布和方差齊性者，用單因素方差分析比較組間差異，多重比較用LSD/SNK 法；不符合方差齊性，則采用dunnet T3 或Tamhane's T2 法；不滿足正態(tài)性者，用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗；重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量計量資料方差分析。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心電圖J 點位移變化幅度值比較

單因素方差分析結(jié)果顯示：（1）腹腔注射組、尾靜脈注射組和股靜脈注射組的J 點位移變化值在2、5、10 min 均高于正常組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；（2）尾靜脈注射組的J 點位移變化值在5 min高于腹腔注射組，股靜脈注射組的J 點位移變化值在2、5、10 min 均高于腹腔注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 尾靜脈注射組與股靜脈注射組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 重復測量計量資料方差分析結(jié)果顯示：（1）造模后J 點位移值不同時間之間存在顯著差異（F=36.513，P＜0.001）；（2）時間與組間存在交互效應（F=4.611，P=0.001）；（3）不同注射方式之間存在顯著差異（F=44.816，P＜0.001）。 垂體后葉素注射后出現(xiàn)J 點位移變化，其幅度變化與心肌缺血程度呈正相關(guān)，而以股靜脈注射組的變化值最明顯，提示心肌損傷程度最高。 詳見表1。

表1 各組心電圖中J 點位移的變化幅度值比較（±s，mV）

表1 各組心電圖中J 點位移的變化幅度值比較（±s，mV）

注：與正常組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與腹腔注射組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別正常組腹腔注射組尾靜脈注射組股靜脈注射組n8877 2 min 0.010±0.007 0.086±0.028**0.111±0.039**0.147±0.086***#5 min 0.013±0.009 0.111±0.028***0.177±0.040***##0.184±0.076***###10 min 0.017±0.010 0.128±0.031***0.160±0.071***0.211±0.087***##

2.2 各組血清cTn-I、CK-MB、LDH 含量比較

腹腔注射組、尾靜脈注射組和股靜脈注組射組的血清cTn-I、CK-MB、LDH 值均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而尾靜脈注射組的血清cTn-I、CK-MB、LDH 含量與腹腔注射組相當， 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；股靜脈注射組的值均高于腹腔注射組，其中股靜脈注射組的血清LDH 含量值高于尾靜脈組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠血清cTn-I、CK-MB、LDH 含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清cTn-I、CK-MB、LDH 含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與腹腔注射組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與尾靜脈注射組相比，△P＜0.05。

組別正常組腹腔注射組尾靜脈注射組股靜脈注射組n8877 cTn-I 110.100±13.750 140.450±12.312**155.200±27.905***167.900±14.794***##CK-MB 26.803±4.602 39.670±4.892***42.015±4.650***46.364±4.345***#LDH 13.247±2.234 20.928±4.540***23.910±2.056***28.915±3.959***###△

2.3 各組心肌組織病理切片染色情況比較

各組大鼠心肌組織病理切片染色如圖1 所示，正常組心肌組織形態(tài)基本正常，細胞核完整，橫紋清楚，心肌纖維排列整齊，心肌結(jié)構(gòu)無明顯病理改變。與正常組對比，各模型組均出現(xiàn)心肌組織結(jié)構(gòu)被破壞的現(xiàn)象。 腹腔注射組的心肌組織內(nèi)可見局灶性炎性細胞；尾靜脈注射組表現(xiàn)為心肌細胞界限不清，炎性細胞成團浸潤明顯；股靜脈注射組的心肌纖維明顯排列紊亂、扭曲、斷裂，甚至部分溶解，心肌組織可見炎性細胞浸潤、水腫明顯。

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片染色情況比較（HE 染色，×200）

3 討論

心肌缺血是心臟的一種病理狀態(tài)，表現(xiàn)為心臟的血液供應減少而導致缺氧，持續(xù)缺氧會引起心肌組織壞死，激活炎癥反應，產(chǎn)生大量炎癥因子，影響心臟的正常功能[9]。 垂體后葉素作用于血管加壓素受體，引起全身血管平滑肌收縮，特別是小血管，使外周阻力增加，加重心臟負荷，也可引起冠狀動脈痙攣、心肌缺血缺氧，加劇心肌損傷，導致心肌缺血[10]。心肌缺血模型制備主要分為手術(shù)造模和藥物造模兩種，手術(shù)造模通過開胸結(jié)扎冠狀動脈，阻斷血流，造成心肌組織缺血壞死；藥物造模經(jīng)常使用異丙腎上腺素和垂體后葉素，靜脈注射、腹腔注射或者皮下注射引起心肌強烈收縮，導致心肌損傷[11]。本實驗采用垂體后葉素制備心肌缺血模型，垂體后葉素為注射劑，可采用多種注射方式給藥。 腹腔注射存在首過效應以及腹膜、腸系膜吸收的個體差異等問題，膜腔注射模型穩(wěn)定性不明確；尾靜脈注射由于大鼠尾部皮膚緊，尾靜脈細小難以暴露清楚，一次性注射成功率不高；股靜脈位置固定，分離肌肉即清晰可見，且管徑較粗，注射成功率高[12]。

ST 段代表心室肌除極完成，細胞之間沒有電位差，復極還未開始的一段時間。 當心室仍存在電位差，導致心電圖上ST 發(fā)生偏移時，提示某部位的心肌缺血或壞死[13-15]。心電圖中J 點位移變化的幅度，引起ST 段改變，反應出心肌缺血性損傷的程度[16]。 3 種注射方式皆引起心電圖心肌缺血樣改變，以股靜脈注射組J 點位移變化幅度值最大，心肌缺血性損傷程度最高。 cTn-I 在心肌損傷時釋放到血循環(huán)中，與心肌損傷程度呈正相關(guān)，是心肌損傷特異性指標之一[17-18]。 CK-MB 主要存在心肌組織中，當心肌組織損傷嚴重時，CK-MB 被釋放入血，是心肌組織損傷的敏感指標之一[19]。LDH 廣泛存在于人體組織中，以腎臟含量最高，其次是心肌和骨骼肌，也可作為心肌損傷的指標之一[20]。 3種注射方式模型大鼠血清中cTn-I、CK-MB、LDH 含量均升高，心肌損傷存在，造模成功，以股靜脈注射組升高最明顯，說明該組造成的心肌缺血效果較好。 從病理結(jié)果來看，各模型組心肌組織皆出現(xiàn)病理性改變，以股靜脈注射組引起的心肌缺血性損傷病理變化最明顯。

綜上所述，從心電圖、心肌損傷標志物及心肌組織形態(tài)學3 方面改變說明垂體后葉素可制備急性心肌缺血大鼠動物模型，而股靜脈注射組在這3 方面的指標變化優(yōu)于尾靜脈注射組和腹腔注射組，顯示股靜脈注射垂體后葉素建立的急性心肌缺血大鼠動物模型的心肌缺血病理和臨床表現(xiàn)最為嚴重，提示采用股靜脈注射垂體后葉素制備心肌缺血大鼠模型更為合適。