基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討降糖通脈方治療糖尿病肺損害的作用機(jī)制

丁 念，鄭承紅

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000;2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430014）

1976 年，Schuyler 提出糖尿病肺損害屬于糖尿病微血管病變，因肺臟血供豐富，所以肺臟也是糖尿病損害的靶器官之一[1]。 肺臟有豐富的血管系統(tǒng)，極易受到高糖狀態(tài)的影響。 糖尿病微血管病變是造成糖尿病肺損害的主要原因。 彭麗媛等[2]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的肺臟微血管通透性及肺臟結(jié)構(gòu)破壞明顯高于健康對(duì)照組。 KODOLOVA 等[3]觀察了不同嚴(yán)重程度和不同病程的糖尿病患者肺血管組織，發(fā)現(xiàn)這些肺血管組織的微血管病變與其他臟器(如腎臟)的微血管病性改變極其相似。 糖尿病肺損害的基本病機(jī)是陰虛燥熱、絡(luò)脈瘀阻，陰虛為本，燥熱、氣滯、痰濕、瘀血為其標(biāo)，而瘀血貫穿疾病的始終。針對(duì)“虛”“瘀”兩個(gè)核心， 臨床采用降糖通脈方以滋陰清熱、 活血化瘀。 降糖通脈方主藥為女貞子12 g、黃連5 g、川芎10 g，其中：女貞子補(bǔ)肝腎之陰、清虛熱，發(fā)揮養(yǎng)陰之力，以治其本；消渴日久，臟腑虛弱，必生痰濕、瘀血等內(nèi)毒，黃連清熱解毒燥濕；川芎行氣活血化瘀治其標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn)，降糖通脈方可以下調(diào)糖尿病大鼠TGF-β1 表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，改善血管的超微病理結(jié)構(gòu)來(lái)干預(yù)糖尿病微血管病變[4]。 臨床研究也發(fā)現(xiàn)，降糖通脈方可以改善糖尿病患者的肺功能損害。為進(jìn)一步探究降糖通脈方治療糖尿病肺損害的分子學(xué)機(jī)制，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究降糖通脈方治療糖尿病肺損害的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，并結(jié)合糖尿病肺損害模型大鼠對(duì)其中的關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，可為后續(xù)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康的SPF 級(jí)雄性8 周齡SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180～200 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104，購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，人工光照明、暗各12 h。 在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)與處置。

1.2 主要試劑

戊巴比妥鈉（批號(hào)P3761）、鏈脲佐菌素(STZ)（批號(hào)S0130）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；二甲雙胍（批號(hào)M107827，阿拉丁試劑有限公司）；二甲苯（批號(hào)10023418）、無(wú)水乙醇（批號(hào)10009218）、碳酸鋰（批號(hào)20022818）、冰乙酸（批號(hào)10000218）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；伊紅（批號(hào)E8090）、中性樹脂（批號(hào)G8590）、蘇木素（批號(hào)G1004）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；蛋白質(zhì)Marker（批號(hào)X1109A，美國(guó)Helix 公司）；十二烷基硫酸鈉(SDS)（批號(hào)1019Y032）、TEMED（批號(hào)CT29143440）、過(guò)硫酸銨（批號(hào)603B0313）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)120720210514）、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液（批號(hào)20201027）、Tween-20（批號(hào)C2011141）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PVDF 轉(zhuǎn)移膜（批號(hào)R9JA64128）、化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)20345A4/20345A4）均購(gòu)自德國(guó)Millipore 公司；TGF-β 一抗（批號(hào)20201014）、SnoN 一抗（批號(hào)20200312）、Smad2一抗（批號(hào)20200525）、Smad3 一抗（批號(hào)20200218）、Smad7 一抗（批號(hào)20200622）、p-Smad2 一抗（批號(hào)GR200003-85）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；p-Smad3 一抗（批號(hào)15，CST）、p-Smad7一抗（批號(hào)20201012）、GAPDH 一抗（批號(hào)20200525）、Goat anti-Rabbit IgG（批號(hào)20200507）均購(gòu)自華聯(lián)科股份有限公司。

1.3 主要儀器

正置顯微鏡（型號(hào)DM1000，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；TB-718L 型生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)、GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱均購(gòu)自泰維科技股份有限公司；電泳儀（型號(hào)mini protean 3 cell，美國(guó)BIO-RAD 公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)Tanon-5200，上海天能有限公司）。

2 方法

2.1 降糖通脈方治療糖尿病肺損害的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 藥物有效活性成分的篩選 應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmsp-e.com/)及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索藥物方中主要藥物女貞子、黃連、川芎的所有活性成分。 根據(jù)研究結(jié)果，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)＞30%、類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18 為限制條件進(jìn)行篩選，得到藥物的有效活性成分。

2.1.2 藥效成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)檢索藥物所有活性成分的靶基因，并將TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選所得所有靶蛋白名稱導(dǎo)入DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/) 以及UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org），設(shè)置物種為人類（Homo sapiens），對(duì)得到的靶蛋白進(jìn)行比對(duì)和基因名校正，轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)的基因名，并刪除無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的靶蛋白。

2.1.3 糖尿病肺損害的疾病靶點(diǎn)篩選 設(shè)置檢索詞為“type 2 diabetes lung injury”，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)進(jìn)行檢索，篩選得到糖尿病肺損害疾病靶點(diǎn)，并應(yīng)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，獲得Swiss-Prot ID。

2.1.4 活性成分與疾病的共同靶點(diǎn)篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 明確糖尿病肺損害相關(guān)靶點(diǎn)與藥物潛在靶點(diǎn)之間的相互作用，應(yīng)用R 語(yǔ)言(https://www.r-project.org/)軟件及Perl 語(yǔ)言程序?qū)⒓膊“悬c(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行交集，并輸入Venny 2.1 軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。 應(yīng)用STRING(https://string-db.org/) 插件構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將Settings 設(shè)為“high confidence：0.9”，并隱藏?zé)o關(guān)系的靶點(diǎn)，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。 應(yīng)用count.R 插件獲得共同蛋白靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻次。

2.1.5 GO 生物功能分析和KEGG 富集 應(yīng)用R 語(yǔ)言(https://www.r-project.org/)軟件中clusterProfiler GO.R 包及Perl 語(yǔ)言對(duì)活性成分與糖尿病肺損害的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，GO 分析主要用于描述基因產(chǎn)物的功能， 其中包括細(xì)胞組分 （cellular component, CC）、分子功能（molecular function, MF）和生物學(xué)過(guò)程（biological process, BP），并應(yīng)用clusterProfiler KEGG.R 包進(jìn)行KEGG 富集分析。 利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建核心靶基因-信號(hào)通路互作網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度，查閱相關(guān)文獻(xiàn)， 基于構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)探討降糖通脈方治療糖尿病肺損害的潛在機(jī)制。

2.2 降糖通脈方治療糖尿病肺損害藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 大鼠糖尿病肺損害模型的復(fù)制與鑒定 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法取10 只大鼠作為正常對(duì)照組（NC組），另取50 只大鼠作為糖尿病造模組。大鼠均予高糖高脂飼料（含蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1.5%、膽酸鈉0.5%、全價(jià)飼料68%）喂養(yǎng)4 周，后造模，大鼠禁食不禁水12 h 后，在配制好的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.2)的基礎(chǔ)上，配制1% STZ溶液，按照35 mg/kg 腹腔注射1% STZ 溶液，72 h后采尾靜脈血及檢測(cè)，隨機(jī)血糖值大于16.7 mmol/L、尿糖≥（+++）的大鼠為糖尿病造模成功[5]。 大量研究表明持續(xù)高糖環(huán)境可以直接引起糖尿病肺損傷[6-8]。本實(shí)驗(yàn)研究，在制備出具有2 型糖尿病特征的大鼠模型后，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 周。 在飼養(yǎng)第8周末，取大鼠肺組織做病理檢查，發(fā)現(xiàn)肺泡腔減少，肺泡腔增厚，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷，有大量炎性細(xì)胞滲透、纖維組織增生，纖維細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，說(shuō)明已經(jīng)成功復(fù)制了大鼠糖尿病肺損害模型。

2.2.2 動(dòng)物分組和樣本采集 造模成功后，將大鼠分為6 組進(jìn)行藥物干預(yù)，每組10 只大鼠。 （1）NC組：不給藥，普通飼料喂養(yǎng)；（2）糖尿病模型組（DM組）：等體積生理鹽水灌胃，每天灌胃一次，連續(xù)8周，繼續(xù)使用高脂飼料喂養(yǎng)；（3）降糖通脈方低劑量組（JTTM 低劑量組）：JTTM 63 mg/mL 混懸液灌胃給藥1 mL/(kg·d)，持續(xù)8 周后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；（4）降糖通脈方中劑量組（JTTM 中劑量組）：JTTM 126 mg/mL混懸液灌胃給藥1 mL/(kg·d)，持續(xù)8 周后高脂飼料喂養(yǎng)；（5）降糖通脈方高劑量組（JTTM 高劑量組）：JTTM 252 mg/mL 混懸液灌胃給藥1 mL/(kg·d)，持續(xù)8 周后，高脂飼料喂養(yǎng)；（6）二甲雙胍組（Met 組）：二甲雙胍54.3 mg/mL 水溶液灌胃給藥1 mL/(kg·d)，持續(xù)8 周后，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

于第8 周末藥物干預(yù)完成后，頸椎脫臼法處死各組大鼠，將血標(biāo)本離心，取上清液置-80 ℃冰箱保存。 取一側(cè)肺組織用4%多聚甲醛固定，另一側(cè)肺臟組織放入液氮保存。

2.2.3 HE 染色觀察大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化 石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水洗；蘇木素染色8 min，自來(lái)水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s（提插數(shù)下）；溫水返藍(lán)；置伊紅液中2 min；常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；觀察肺組織的病理變化，拍照分析。

2.2.4 Western blot 法檢測(cè)大鼠肺組織中的TGFβ1、Smad2、Smad3、Smad7 和SnoN表達(dá) 將凍存于-80 ℃冰箱的肺組織取出備用，使用RIPA 裂解液將細(xì)胞裂解，按說(shuō)明書步驟配制總蛋白溶液，置于組織勻漿器中，13 800 r/min， 離心15 min 離心半徑6 cm，取上清液，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 取總蛋白上樣、電泳分離、切膠，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入TGF-β1 一抗（1∶1000）、Smad2 一抗（1∶1000）、Smad3 一抗（1∶1000）、Smad7一抗（1∶1000）、p-Smad2 一抗（1∶1000）、p-Smad3一抗（1∶1000）、p-Smad7 一抗（1∶1000）、GAPDH一抗（1∶1000），4 ℃搖床過(guò)夜；PBST 洗膜， 加二抗（1∶20 000），4 ℃搖床過(guò)夜，PBST 洗膜, ECL 發(fā)光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值來(lái)表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以“±s”表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 降糖通脈方治療糖尿病肺損害的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制分析

3.1.1 降糖通脈方活性成分篩選 通過(guò)TCMSP、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)女貞子、黃連、川芎的活性成分進(jìn)行檢索，并以O(shè)B＞30%和DL≥0.18 為限制條件進(jìn)行篩選，其中得到川芎8 種有效活性成分、黃連14 種有效活性成分、女貞子14 種有效活性成分。詳見表1。

表1 有效活性成分信息表

3.1.2 糖尿病肺損害的疾病靶點(diǎn)篩選 通過(guò)檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到2 型糖尿糖肺損害的疾病治療靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)后共得到584 個(gè)與2 型糖尿病肺損害的疾病治療靶點(diǎn)。

3.1.3 共同靶點(diǎn)篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 得到的109個(gè)藥物活性成分靶點(diǎn)與584 個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)，分別導(dǎo)入在線韋恩圖制作網(wǎng)站InteractiVenn，相匹配映射得到降糖通脈方治療2 型糖尿病肺損害的潛在作用靶點(diǎn)共95 個(gè)，藥物有效活性成分-疾病交集靶點(diǎn)Venny 圖（圖1）。 將95 個(gè)潛在靶基因?qū)隨TRING在線分析網(wǎng)站（https://string-db.org/），設(shè)置隱藏未連接的靶點(diǎn)，設(shè)定最低互作評(píng)分中的“highest confidence＞0.900”，并導(dǎo)出PPI 結(jié)果數(shù)據(jù)（圖2）。進(jìn)一步通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件得到潛在靶基因的PPI，運(yùn)用其中的cytoHubba 插件篩選Hub 基因，使用Degree算法，得出排名前20 位潛在核心靶基因（圖3）。

圖1 藥物活性成分靶點(diǎn)與2 型糖尿病肺損害疾病靶點(diǎn)Venny 圖

圖2 共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Degree 值排名前20 的靶點(diǎn)

3.1.4 活性成分-肺損害-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.2 軟件在中藥活性成分-2 型糖尿病肺損害-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得121 個(gè)節(jié)點(diǎn)、415 條邊（靶點(diǎn)95 個(gè)，活性成分24 個(gè)）（圖4）。

圖4 中藥活性成分-2 型糖尿病肺損害-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)

3.1.5 藥物治療糖尿病肺損害的生物功能（GO）分析及核心通路篩選 運(yùn)用R 語(yǔ)言中的Bioconductor包、clusterProfiler 包對(duì)24 個(gè)中藥活性成分-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果顯示：95個(gè)潛在靶基因GO 分析可見其主要富集于DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、SMAD 結(jié)合等（圖5）。 而KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)其主要集中于糖尿病并發(fā)癥中的TGF-β 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路以及TNF 信號(hào)通路等（圖6）。并對(duì)“3.1.3”中篩選得到的核心靶基因Smad2、Smad3、Smad7、Skil 相關(guān)蛋白(Ski-related novel protein,SnoN)中富集的信號(hào)通路進(jìn)行展示，利用Cytoscape

圖5 GO 生物功能分析氣泡圖

圖6 KEGG 富集分析氣泡圖

3.7.2 軟件構(gòu)建核心靶基因-信號(hào)通路互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。

圖7 核心靶點(diǎn)與2 型糖尿病相關(guān)性肺損害信號(hào)通路之間的關(guān)系

3.2 降糖通脈方對(duì)糖尿病肺損害大鼠的干預(yù)作用

3.2.1 各組糖尿病大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)的變化 NC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常。 與NC 組相比，DM 組的肺泡腔減少，肺泡腔增厚，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷，有大量炎性細(xì)胞滲透，纖維組織增生。 與DM 組相比，JTTM 各劑量組和Met 組均有明顯改善。 隨著JTTM 劑量的增加，肺組織損害明顯改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維組織增生減少，肺泡間距恢復(fù)正常。詳見圖8。

圖8 各組大鼠肺組織HE 染色病理結(jié)構(gòu)改變（200×）

3.2.2 各組TGF-β1/Smads 信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白表達(dá) 與NC 組相比，DM 組的Smad2、Smad3 和Smad7差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而p-Smad2 和p-Smad3 在DM組中顯著升高（P＜0.01）。 p-Smad2 和p-Smad3 在JTTM 組和Met 組中的表達(dá)均較DM 組降低（P＜0.05）。隨著JTTM 劑量的增加，p-Smad2 和p-Smad3 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。 而p-Smad7在DM 組中的表達(dá)低于NC 組，JTTM 組和Met 組p-Smad7 水平高于DM 組，隨著JTTM 劑量的增加，p-Smad7 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。 DM組SnoN的表達(dá)低于NC 組（P＜0.01），但JTTM 組和Met 組SnoN 表達(dá)較DM 組增加（P＜0.05），與p-Smad7 的表達(dá)相一致。 與DM 組相比，JTTM 各劑量組中TGFβ1 降低（P＜0.05）。 詳見圖9。

圖9 各組大鼠TGF-β1/Smads 信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白表達(dá)

4 討論

現(xiàn)代研究認(rèn)為，糖尿病引起的免疫功能下降、氧化應(yīng)激和微血管病變均可導(dǎo)致肺損害，高血糖會(huì)導(dǎo)致肺泡慢性損傷，而細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉淀增多，破壞肺泡的正常結(jié)構(gòu)，使其順應(yīng)性降低，最終導(dǎo)致肺通氣和彌散功能喪失而危及生命[9]。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病位在肺，涉及脾腎，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以肺脾腎虧虛為主，而陰虛血瘀貫穿糖尿病微血管病變始終，在治療糖尿病肺損害的過(guò)程中以滋陰化瘀為主要治法[10]。 降糖通脈方以女貞子滋陰、黃連清熱、川芎活血化瘀，標(biāo)本兼顧，共奏滋陰化瘀之效，與糖尿病肺損害的病機(jī)對(duì)應(yīng)。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，建立了“化合物-靶點(diǎn)”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，為降糖通脈方多成分的復(fù)雜性、多靶點(diǎn)的不確定性、多通路的交叉性提供了科學(xué)依據(jù)。由“3.1.4”可知降糖通脈方的活性成分中阿魏酸、川芎嗪、小檗堿和女貞苷等與糖尿病肺損害的關(guān)系程度明顯高于其他。 研究表明，川芎提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有明顯降血糖作用[11]。 阿魏酸通過(guò)抑制JAK2/STAT6 免疫信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。 川芎嗪可有效阻斷大鼠氣道壁中Ⅲ型膠原的合成，抑制網(wǎng)狀基底膜層增厚，進(jìn)而抑制氣道重塑早期纖維化的發(fā)生[13]。 小檗堿通過(guò)cAMP/GP 信號(hào)通路可改善2 型糖尿病小鼠的肝糖原結(jié)構(gòu)，修復(fù)受損糖原結(jié)構(gòu)以調(diào)節(jié)肝糖代謝，從而發(fā)揮降糖作用[14]。 小檗堿可能通過(guò)與AngⅡ誘導(dǎo)IL-1β/NF-κB 通路介導(dǎo)的促炎性反應(yīng)顯著降低2 型糖尿病小鼠血糖[15]。 黃連素可抑制LPS 刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞促凝及纖溶抑制相關(guān)因子表達(dá)凝和纖溶抑制[16]。 女貞苷通過(guò)提高細(xì)胞中AMP 與ATP 濃度的比值激活A(yù)MPK 通路從而促進(jìn)脂聯(lián)素的高聚化，而脂聯(lián)素的高聚化對(duì)于提高葡萄糖耐受性和胰島素敏感性具有重要意義[17]。女貞子通過(guò)上調(diào)T-bet 基因表達(dá)和下調(diào)GATA3 基因表達(dá)， 調(diào)節(jié)Th1/Th2 之間的平衡，抑制IgE 生成和炎性細(xì)胞因子表達(dá)，減輕肺和氣道的炎癥反應(yīng)[18]。由此可以發(fā)現(xiàn)，降糖通脈方的活性成分在治療糖尿病肺損害方面可能發(fā)揮了重要的作用。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選得到的核心基因Smad2、Smad3、Smad7、SnoN（Skil）等靶點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[19]。 GO 生物功能分析中，與降糖通脈方作用靶點(diǎn)即相關(guān)聯(lián)的有DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、 配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、Smad 結(jié)合等。 KEGG 信號(hào)通路分析得出，降糖通脈方作用靶點(diǎn)主要通過(guò)TGF-β 信號(hào)通路、AGERAGE 信號(hào)通路以及TNF 信號(hào)通路等干預(yù)糖尿病肺損害，同時(shí)也與糖尿病其他微血管并發(fā)癥存在密切的關(guān)系[20]。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)篩選，降糖通脈方中共得到36 個(gè)活性分子、作用靶點(diǎn)有109 個(gè)，其中與糖尿病肺損害相關(guān)的作用靶點(diǎn)有95 個(gè)。 PPI 網(wǎng)絡(luò)中主要節(jié)點(diǎn)有Smad2、Smad3、Smad7、SnoN（Skil）等。分析結(jié)果顯示，降糖通脈方主要通過(guò)蛋白質(zhì)異二聚化活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、Smad 結(jié)合等BP 參與糖尿病肺損害，通過(guò)TGF-β 信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路以及TNF 信號(hào)通路等干預(yù)糖尿病肺損害。前期研究發(fā)現(xiàn)，此方可以下調(diào)TGF-β1 基因表達(dá)來(lái)干預(yù)糖尿病血管損害[21-22]。相關(guān)研究也表明，SnoN(Skil)和TGF-β1/Smads 通路與糖尿病肺損害最為密切，可能是其危險(xiǎn)因素或共用信號(hào)通路[23]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DM 組肺組織病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織的肺泡腔縮小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔被破壞增厚，大量膠原纖維增生，顯示早期肺纖維化表現(xiàn)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的糖尿病肺損害大鼠肺組織病理結(jié)果是一致的[24-26]。隨著JTTM 藥物干預(yù)劑量的增加，各炎癥因子的表達(dá)逐漸減少，降糖通脈方可以減輕糖尿病肺損害，有助于糖尿病肺損害的治療和預(yù)后。Smads 作為TGF-β1 家族的下游信號(hào)分子，也是TGF-β1 的唯一底物[27]。 在外界刺激下，TGF-β1 受體Ⅰ直接磷酸化Smad2 和Smad3，最后與Smad4 形成三聚體，并在內(nèi)部轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[28]。 Smad7 是一個(gè)抑制Smads 的蛋白，可降低TGF-β1 的表達(dá)，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)糖尿病肺組織起到保護(hù)作用[29]。

本研究表明，DM 組TGF-β1 蛋白水平明顯高于NC 組，提示糖尿病肺損害與TGF-β1 的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)。 糖尿病大鼠Smad2/3 表達(dá)增加、Smad7表達(dá)降低，提示TGF-β1 參與糖尿病的肺損害的機(jī)制是上調(diào)Smad2/3 的表達(dá)和下調(diào)Smad7 表達(dá)。 各組經(jīng)JTTM 干預(yù)后，Smad2/3 表達(dá)降低、Smad7 表達(dá)上調(diào)[30-32]。SnoN 蛋白屬于Ski 蛋白家族，它最重要的功能是通過(guò)結(jié)合Smad 蛋白相互作用，以負(fù)向調(diào)控TGFβ1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效抑制糖尿病肺損害的發(fā)生[33]。 未受TGF-β1 刺激時(shí)，SnoN 蛋白與Smad4 結(jié)合在DNA 特異性結(jié)合位點(diǎn)(Smad binding element, SBE)上，SBE 是Smad2、Smad3、Smad4 多聚體與Smad7基因啟動(dòng)因子的結(jié)合位點(diǎn)；反之，SnoN 會(huì)與SBE 分離，而Smad2、Smad3、Smad4 多聚體與SBE 結(jié)合，使負(fù)調(diào)控因子Smad7 基因的轉(zhuǎn)錄蛋白啟動(dòng)，Smad7 表達(dá)增多從而抑制TGF-β1 信號(hào)傳導(dǎo)[34-35]。 在本研究中，當(dāng)糖尿病肺損害發(fā)生時(shí)，TGF-β1/Smads 信號(hào)通路與SnoN 蛋白相互作用，可以抑制炎癥信號(hào)。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)降糖通脈方治療糖尿病肺損害的作用機(jī)制，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)降糖通脈方治療糖尿病肺損害的作用效果和潛在的信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，為中醫(yī)藥治療糖尿病肺損害提供了新的思路。