乙酰水楊酸姜黃素酯通過TLR4/NF-κB 通路拮抗LPS 誘導的BV2 小膠質細胞炎癥損傷

何超平，陳 煜，彭 莎，石 哲，李亞梅*，廖端芳*

（湖南中醫(yī)藥大學藥學院湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

神經免疫反應對于中樞神經系統(tǒng)（central nervous system, CNS）的發(fā)育、清除以及各項正常生理功能的維持都具有十分重要的作用。 而小膠質細胞作為一個主要的神經免疫細胞，能夠迅速感知腦部免疫微環(huán)境的改變并作出響應，對于神經系統(tǒng)免疫環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用[1]。 但另一方面，活化的小膠質細胞可以通過增加炎性細胞因子和介質的釋放從而產生并加劇神經炎癥，小膠質細胞所介導的神經炎癥也與各種中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制有關，例如抑郁癥、藥物成癮等，抑郁癥的發(fā)病機制與炎癥相關[2-3]，因此，介導神經炎癥反應的小膠質細胞已經成為抑郁癥等一系列精神疾病的重要治療靶點[4]。

乙酰水楊酸是最普通也是應用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，其藥理作用包括解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等，藥效迅速且穩(wěn)定。而姜黃素的抗炎效果已經在很多研究中得以證實，近年來對于姜黃素抑制核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）活性的研究也比較深入[5]，但其缺點在于機體對姜黃素的吸收少、代謝快，并且生物利用度較低，這些缺點限制了姜黃素的臨床應用。而本課題組將乙酰水楊酸基團與姜黃素結合，人工半合成新型藥物乙酰水楊酸姜黃素酯（curcumin acetylsalicylate,CA；專利申請?zhí)?01210365392.2）[6]，在一定程度上克服了姜黃素吸收少的缺點，且本課題組前期研究已證實CA 可能通過抑制NF-κB p65蛋白水平，調節(jié)肝臟脂質代謝及炎癥反應從而抑制高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠所致的動脈硬化斑塊的形成[7]。因此，本研究通過分析CA 與相關炎性分子對接結果，發(fā)現(xiàn)CA 與NF-κB 和Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4, TLR4）對接良好，進一步采用體外LPS 誘導的BV2 小膠質細胞炎癥模型，探究CA 抗神經細胞炎癥的效果及其潛在機制。

1 材料

1.1 細胞與藥物

小鼠BV2 小膠質細胞株來源于湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院；CA 由本課題合成并純化，純度為99.99%，溶于DMSO 中（DMSO 終濃度小于0.1%）。

1.2 試劑與儀器

LPS（貨號：L2880-10MG，美國Sigma 公司）；CCK-8（貨號：E-CK-A362，美國Bio-Sharp 公司）；NO 檢測試劑盒（貨號：S0021S，碧云天公司）；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（貨號：70-EK201B/3-96）、TNF-α ELISA 檢測試劑盒（貨號：70-EK282/3-96 均購自）聯(lián)科生物公司；NF-κB p65（貨號：ab16502）、p-NFκB p65（貨號：ab86299）、TLR4（貨號：ab13556）、MYD88（貨號：ab133739）、iNOS（貨號：ab178945）均購自英國Abcam 公司；IκB-α（貨號：L35A5）、p-IκB-α（貨號：14D4）均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

倒置熒光顯微鏡（型號：IX83，美國Olympus 公司）；酶標儀（型號：ELX800，美國Bio-tek 公司）；細胞培養(yǎng)箱（型號：HERAcell 150i，美國Thermo Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分子對接方案

本課題組基于前期研究基礎，并通過查閱與炎癥相關靶標的文獻，篩選出NF-κB、TLR4、Toll 樣受體2（Toll-like receptors 2, TLR2）、胰島素誘導基因2（nsulin inducible gene 2, Insig2）、尼曼匹克C1 型L1（Niemann-Pick C1 like 1, NPC1-L1）、Wnt 信號蛋白（Wnt），對目標蛋白活性位點進行分析（三維結構來源于蛋白質晶體結構數(shù)據(jù)庫、PDB 數(shù)據(jù)庫），后應用LibDock 模塊（來源于Discovery Studio 3.0）將配體CA 與受體蛋白分子對接[8]。 選取與CA 對接吻合度前2 名的蛋白分子，并在BV2 小膠質細胞中進行驗證。

2.2 細胞培養(yǎng)

BV2 小膠質細胞在DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%無菌胎牛血清和1%雙抗）置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞融合度達到80%～90%時傳代，隔日更換培養(yǎng)基。 待細胞生長狀態(tài)良好時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰蛋白酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集（r=8.5 cm，1000 r/min，8～10 min），去除上清液，加入90% FBS+10% DMSO 吹勻后保存于凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 藥物干預及分組

根據(jù)細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8, CCK-8）檢測結果計算細胞存活率，選取安全用藥范圍內濃度20、40、60 μmol/L 作用2 h 后，10 mg/L LPS 作用24 h 進行造模。 將BV2 小膠質細胞分為對照組（細胞培養(yǎng)液）、模型組（10 mg/L LPS 細胞培養(yǎng)液）、CA 干預組（20、40、60 μmol/L CA 細胞培養(yǎng)液作用2 h+10 mg/L LPS 細胞培養(yǎng)液）。

2.4 藥物處理

當BV2 小膠質細胞融合度達到80%～90%時，預先用不同濃度的CA 處理細胞2 h，再加入400 ng/mL 的LPS 刺激24 h，收集細胞上清液或提取細胞蛋白作為檢測樣本，后續(xù)實驗皆為此藥物處理方案。

2.5 CCK-8 法檢測細胞活力

將BV2 小膠質細胞以每孔8×103細胞密度將細胞接種于96 孔板內，次日按“2.4”項方法處理后，棄去上清液， 每孔重新加入含10% CCK-8 的DMEM培養(yǎng)基，孵育1 h 后，使用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光值，計算細胞生存率。

2.6 ELISA 法檢測細胞TNF-α、IL-1β 水平

將BV2 小膠質細胞以每孔8×103細胞密度將細胞接種于96 孔板內，次日按“2.4”項方法處理后收集細胞上清液，離心去除細胞碎片后將上清液作為檢測樣本，按照試劑盒說明書采用ELISA 法檢測TNF-α 和IL-1β 水平。

2.7 Griess 法檢測細胞NO 水平

將BV2 小膠質細胞以每孔8×103細胞密度將細胞接種于96 孔板內，次日按“2.4”項方法處理后收集細胞上清液，離心去除細胞碎片后將上清液作為檢測樣本，按照試劑盒說明書采用Griess 法測定NO 濃度。

2.8 Western blot 檢測NF-κB 通路及TLR-4/MYD88通路表達

取各組實驗處理后細胞，用預冷的PBS 洗3次，加入RIPA 裂解液和PMSF 的混合液100 μL（比例為100∶1）置于冰上裂解30 min，用細胞刮刮下蛋白，4 ℃離心（r=8.5 cm，1 2000 r/min，15 min），收集上清液。 BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。 每個樣品取30 μg 并加入5×SDS 凝膠上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，使其變性。 配制5%濃縮膠、8%分離膠，進行電泳分離（濃縮膠80 V，分離膠120 V），0.22 μm PVDF 膜200 mA 濕轉120 min，5%脫脂牛奶慢搖封閉1 h，加入一抗NF-κB p65（1∶1000）、IκB-α（1∶1000）、p-IκB-α （1∶1000）、p-NF-κB p65 （1∶2000）、TLR-4（1∶1000）、MYD88（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗5 次，每次5 min，按1∶5000 的比例加入稀釋過的二抗室溫孵育1 h，然后用TBST 洗膜5次，每次5 min，用化學發(fā)光顯影法進行顯影，結果用Image J 測量灰度值，以目的蛋白與β-actin 的比值進行統(tǒng)計學分析。

2.9 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 以及SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以“±s”表示，兩組樣本均數(shù)間比較采用t 檢驗進行統(tǒng)計分析，多組之間比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 CA 結構以及分子對接結果

通過CA 結構式可以看出，乙酰水楊酸與姜黃素通過酯健結合形成CA（圖1）。 如表1 所示，在蛋白對接結果中，NF-κB 和TLR4 與CA 的對接吻合度值高達99.58%和92.71%，而其他幾個蛋白與CA對接吻合度值相對較低，故之后的研究僅針對吻合度高的NF-κB 和TLR4 在BV2 小膠質細胞中進行驗證。

表1 CA 與受體蛋白對接結果

圖1 CA 與炎癥通路相互作用分子對接分析

3.2 不同濃度CA 對BV2 小膠質細胞存活率的影響

經不同濃度CA 干預24 h 后，在0～80 μmol/L 濃度范圍內，CA 沒有顯示明顯的細胞毒性，當CA濃度大于80 μmol/L 時，細胞活性受到抑制（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 CA 對BV2 小膠質細胞活力的影響（±s，n=3）

3.3 各組IL-1β、TNF-α、NO 表達水平比較

與對照組相比，LPS 刺激后的細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α 和NO 水平明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預組上清液中的TNF-α、IL-1β、NO炎癥分子水平下降（P＜0.05）。在CA 濃度為60 μmol/L時，CA 對IL-1β 對抑制率達74.89%、對TNF-α 抑制率達56.73%、對NO 抑制率達72.64%。 說明CA 能夠抑制LPS 所引起的炎癥因子的上調。 詳見圖3。

圖3 不同濃度CA 對LPS 誘導BV2 小膠質細胞IL-1β、TNF-α、NO 水平的影響（±s，n=3）

3.4 各組NF-κB、TLR4 的蛋白表達水平比較

與對照組相比， 模型組p-NF-κB p65 與NF-κB p65 蛋白表達量比值以及p-NF-κB p65 蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預組p-NFκB p65 與NF-κB p65 蛋白表達量比值明顯降低（P＜0.05），p-IκB-α 蛋白含量明顯下降（P＜0.01）。 與對照組相比，模型組的TLR4 和MYD88 表達量都有明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，CA 干預組TLR4蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。 詳見圖4、圖5。

圖4 不同濃度CA 對LPS 誘導BV2 細胞NF-κB/IκB-α 表達及其磷酸化的影響（±s，n=3）

圖5 不同濃度CA 對LPS 誘導BV2 細胞TLR-4、MYD88 的影響（±s，n=3）

4 討論

適度的炎癥反應可以幫助大腦維持穩(wěn)態(tài)，保護神經元功能，而過度的炎癥反應被認為是大部分中樞神經系統(tǒng)疾病的一個重要病理特征，例如帕金森綜合征、抑郁癥等[9]，且主要由膠質細胞介導[10]，持續(xù)的炎癥反應會釋放出大量的炎癥因子，損傷神經元，導致一系列病理變化。 所以，針對小膠質細胞調控神經炎癥達到治療腦部疾病的治療方案研究具有廣闊的發(fā)展前景。

姜黃素是姜黃的主要成分，已被證實其藥理作用包括抗炎、調脂等[11]。盡管已有文章表明姜黃素對于抑郁癥患者具有一定療效[12]，但是其臨床應用并不廣泛的一個重要原因是其生物利用度低[13-14]。 而姜黃素的酯化物在提高生物利用度的同時，也可以達到抗炎、調脂等一系列效果[15]。乙酰水楊酸已被證實具有良好的抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等藥理作用，但是其缺點在于體內代謝速度快，因此，為了更好地提高兩種物質的療效，我們將其合成CA，也達到了比較可觀的合成率[16]。

LPS 可以激活小膠質細胞并觸發(fā)促炎信號傳導級聯(lián)反應[17]，在小膠質細胞釋放大量炎癥介質時，這些介質也受NF-κB 的調節(jié)，NF-κB 是炎癥的中央調節(jié)因子，它控制趨化因子、細胞因子、促炎酶、黏附分子和促炎轉錄因子的基因轉錄[18-19]。 而Toll 樣受體是與病原體相關分子模式（pathogen-associated m olecular patterns, PAMPs） 識別有關的關鍵模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs），可以識別多種病原體，并通過激活NF-κB 和其他引起促炎分子合成的轉錄因子來啟動促炎免疫應答[20]。 在我們前期的分子對接結果中，CA 與NF-κB 以及TLRs 皆具有比較高吻合度的對接結果，基于此結果，我們對CA 抑制LPS 誘導的BV2 小膠質細胞炎癥的初步機制做了簡單的探索。 實驗結果表明CA對BV2 小膠質細胞毒性作用較小，可以降低細胞炎癥因子水平，其機制可能與抑制NF-κB 的磷酸化、減少IκB-α 的磷酸化降解以及TLR4 通路的激活有關。 本課題組前期針對CA 調脂、抗炎的效果已發(fā)表相關論文[7]，本文首次提出將CA 運用到體外神經炎癥模型當中，并且在此研究中也證實其具有良好的抗炎效果，對于中樞神經系統(tǒng)疾病可能具有較好的療效。

本研究應用體外LPS 誘導BV2 小膠質細胞炎癥模型，觀察了CA 的抗炎作用，并證實了CA 可以通過抑制NF-κB/TLR4 通路減少炎癥介質的釋放從而降低細胞炎癥水平，CA 抗BV2 小膠質細胞炎癥作用機制如圖6 所示，但其更深入的機制有待進一步研究。

圖6 模式示意圖