益氣化瘀解毒方拆方對急性呼吸窘迫綜合征大鼠的預(yù)防作用研究*

褚 巖 駱長永 鄒 喬 陳一凡 孔煜榮 陳 瑜 李 雁△

（1.北京市朝陽區(qū)雙橋醫(yī)院，北京 100121；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）屬于一種臨床危重癥，病死率極高，臨床表現(xiàn)以呼吸窘迫、進行性的低氧血癥為主。ARDS的病死率極高，重癥患者的病死率為40%以上，幸存者仍存在認知功能下降、持續(xù)骨骼肌肉無力和抑郁的風險[1]。目前本病尚無特效藥物，以支持肺保護性機械通氣治療為主。隨著中醫(yī)藥研究的進展，中藥單藥、成藥、自擬方等對ARDS體現(xiàn)出確切療效[2]。益氣化瘀解毒方是杜懷棠教授治療ARDS的經(jīng)驗方，該方由黃芪、黃芩、金銀花、三七、赤芍、炒枳實、葶藶子和桑白皮組成。前期我們通過多次動物實驗研究對該方進行藥效學評價，結(jié)果均證明益氣化瘀解毒方能有效減輕ARDS大鼠模型的肺損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)免疫、炎癥等通路相關(guān)[3-6]。為進一步探索該方中不同治法對ARDS大鼠模型的炎癥抑制作用，本研究對益氣化瘀解毒方進行拆分，構(gòu)建ARDS大鼠模型，探討不同拆方組合對ARDS大鼠模型TLR4-NLRP3通路及炎性因子的影響，旨在探索益氣化瘀解毒方中發(fā)揮主要炎癥抑制作用的最佳藥物組合，為科學簡化處方、中藥新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，雄性SD大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量（180±10）g。動物飼養(yǎng)于中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室中心屏障動物房，溫度22～24℃，濕度50%～70%。本動物實驗通過北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會審批通過（審批號：19-54）。

1.2 試藥與儀器 益氣化瘀解毒方拆方——益氣解毒：黃芪30 g，黃芩10 g，金銀花15 g。益氣化瘀解毒方拆方——益氣化瘀：黃芪30 g，三七10 g，赤芍15 g。益氣化瘀解毒方拆方——益氣逐飲組：黃芪30 g，葶藶子15 g，桑白皮15 g，炒枳實15 g。藥材由中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供，并制作成中藥濃縮浸膏。大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖（L6511，Sigma公司）、大鼠Toll樣受體4（TLR4）、NLRP3、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）ELISA試劑盒（MB-1762A/MB-6880A/MB-1588B/MB-1735B，江蘇酶標生物科技有限公司）、藥物天平（HCTP1110，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 分組及給藥 將30只SD大鼠隨機分為5組，即空白對照組、模型組、益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組，每組6只，分別稱量并記錄?？瞻讓φ战M、模型組大鼠予1 mL/100（g·d）蒸餾水灌胃，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組分別予對應(yīng)其治法的1 mL/（100 g·d）中藥液灌胃，按12.2 g/（kg·d）（劑量換算方法：按照成人按體質(zhì)量60 kg計算，以大鼠與成人6倍系數(shù)換算所得，給藥劑量為生藥劑量）予中藥溶液灌胃給藥。各組連續(xù)灌胃7 d。

1.4 模型制備 第7日灌胃后6 h造模，造模方法采用一次尾靜脈注射脂多糖誘導全身炎癥反應(yīng)所致ARDS模型[4]。給予模型組、益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組大鼠脂多糖溶液（2 mg/kg）一次性經(jīng)尾靜脈注射，對照組相應(yīng)給予0.9%氯化鈉注射液（2 mg/kg）尾靜脈注射。

1.5 標本采集及檢測 1）肺組織病理：造模16 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）進行麻醉，取大鼠右下肺，制成病理切片后進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察組織學形態(tài)，包括：肺泡間隔變化情況，局部炎癥細胞浸潤程度，肺毛細血管充血、水腫情況等。2）酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測TLR4-NLRP3通路及炎性因子相關(guān)蛋白：IL-1β、IL-18采取腹主動脈血，TLR4、NLRP3采取肺泡灌洗液及肺組織勻漿，采集的樣本進行ELISA檢測，操作步驟參考試劑盒說明完成。

1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應(yīng)用Graphpad Prism7軟件完成。本實驗結(jié)果均為計量資料，采用（）進行描述性展示，采用單因素方差分析整體進行差異性檢驗，兩兩組間比較時先進行方差齊性檢驗（Levene法），方差齊則釆用LSD-t檢驗，方差不齊則釆用Dunnetts-t檢驗。P＜0.05被認為具有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學觀察 空白對照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)未見組織液，肺間質(zhì)無水腫，肺組織中見少量炎性細胞浸潤。模型組大鼠的肺泡及肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，大多數(shù)肺泡腔縮小變形，部分肺泡塌陷，伴隨有炎性細胞大量浸潤，細支氣管腔和肺泡腔內(nèi)可見分泌物，偶見紅細胞。各拆方組大鼠的肺泡及間質(zhì)水腫較模型組有所改善，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡腔塌陷較少，出血、滲出減少，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理情況（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達水平比較 見表1。與空白對照組相比，模型組肺勻漿中TLR4表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺勻漿中TLR4表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組相比，模型組肺勻漿中NLRP3表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，益氣化瘀組肺勻漿中NLRP3表達水平顯著降低（P＜0.05），益氣解毒組、益氣逐飲組肺勻漿中NLRP3表達平均水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠肺勻漿中TLR4、NLRP3表達水平比較（ng/mL，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組n 6 6 6 6 6 TLR4 770.53±88.27 993.71±60.78△△816.88±54.19**802.21±141.44 878.49±48.56*NLRP3 7.03±0.30 7.37±0.82△7.11±0.38 7.03±0.33*7.13±0.28

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達水平比較 見表2。與空白對照組相比，模型組肺泡灌洗液中TLR4表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺泡灌洗液中TLR4表達水平有不同程度地降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，模型組肺泡灌洗液中NLRP3表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組肺泡灌洗液中NLRP3表達水平均顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中TLR4、NLRP3表達水平比較（±s）

組別空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組n 6 6 6 6 6 TLR4（ng/mL）288.70±27.48 331.44±10.50△△311.42±31.04 321.73±15.78 305.31±24.38 NLRP3（pg/mL）63.03±2.42 71.92±2.68△△62.13±4.99**65.14±1.61**65.10±2.63**

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 見表3。與空白對照組相比，模型組血清IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組血清IL-1β表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組相比，模型組IL-18水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，益氣解毒組、益氣化瘀組、益氣逐飲組IL-18水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18表達水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18表達水平比較（pg/mL，±s）

組別n IL-1βIL-18空白對照組模型組益氣解毒組益氣化瘀組益氣逐飲組6 6 6 6 6 114.43±18.14 154.65±29.55△△109.49±23.96**87.83±19.82**118.90±27.77*170.01±11.06 197.38±24.23△△165.95±10.26**173.72±17.79*176.40±15.21*

3 討論

近年來，ARDS的發(fā)病率呈上升趨勢[7]。ARDS的發(fā)病機制非常復雜，炎癥反應(yīng)貫穿始終，炎癥反應(yīng)失控是ARDS的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[8]。研究表明，TLR4-NLRP3通路在ARDS的過度炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，微生物產(chǎn)物或細胞損傷相關(guān)的內(nèi)源性分子能通過與TLR4結(jié)合，激活先天免疫系統(tǒng)[9]。如細菌內(nèi)毒素脂多糖可激活TLR4受體，并通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB途徑來上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達[10]，進一步促進下游IL-1β和IL-18的成熟和釋放[11]，進而引起急性肺損傷導致ARDS。

根據(jù)ARDS呼吸困難、喘促氣急等臨床表現(xiàn)，可將其歸屬為中醫(yī)“暴喘”“肺衰”等范疇。本病與“虛”“瘀”“毒”“飲”密切相關(guān)，主要病機為感受外來邪氣或遭受外傷，肺失宣降，水液代謝異常，飲邪停肺；肺宣降失司，氣機逆亂，還可致氣血運行不暢，氣滯血瘀，外邪與飲邪、瘀血阻肺，久而化熱，邪熱壅滯肺內(nèi)，耗傷氣陰，瘀滯愈重，瘀熱、飲邪釀而為毒，毒邪阻結(jié)于肺，損傷肺絡(luò)，致使肺氣驟虛、衰敗，進而影響全身臟腑功能，甚則危及生命[12]。因此，“瘀飲化毒，肺氣衰敗”是ARDS的核心病機所在，而本病的治法應(yīng)以“解毒、化瘀、逐飲、大補肺氣”為主。

本研究將益氣化瘀解毒湯拆分為益氣解毒方、益氣化瘀方和益氣逐飲方，3方中均重用黃芪以大補肺氣，挽驟衰之本。研究表明，黃芪可通過降低細胞間黏附分子-1及血管細胞間黏附分子-1表達水平，從而減輕肺損傷[13]。此外，針對“毒”“瘀”“飲”病理因素，不同拆方配以“解毒”“化瘀”“逐飲”治法。益氣解毒方以黃芩、金銀花清熱解毒，研究證明，黃芩苷可抑制脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠TLR4/JNK/ERK/NF-κB通路，發(fā)揮炎癥抑制作用以減輕肺損傷[14]。金銀花提取物可通過抑制IL-1、IL-6和TNF-α炎癥介質(zhì)和細胞因子，發(fā)揮保護ARDS大鼠模型肺組織的作用[15]。益氣化瘀方以三七、赤芍活血化瘀，三七皂苷Rb1可降低ARDS模型大鼠炎癥程度，通過改善肺組織線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮肺保護作用[16]，赤芍可通過促進微循環(huán)，改善組織血流灌注，提高ARDS動物模型的血液氧合功能[17]。益氣逐飲方以葶藶子、桑白皮瀉肺逐飲，有研究表明葶藶子具有改善ARDS患者心臟功能，減少血管外肺水的作用[18]。

本研究結(jié)果提示，各拆方均可降低ARDS大鼠模型炎性因子IL-1β和IL-18的表達水平，其機制可能是通過抑制TLR4的表達進而減少NLRP3的產(chǎn)生來發(fā)揮炎癥抑制作用，其中益氣解毒組對于TLR4-NLRP3通路的抑制作用更為明顯。大量炎癥細胞活化及炎癥介質(zhì)的釋放可視為中醫(yī)的邪毒化火，本研究證實益氣解毒方在各拆方組中抑制炎癥通路及炎癥因子表達的作用最為顯著。此外，ARDS病理環(huán)節(jié)中毒與血瘀和飲邪密切相關(guān)，故化瘀、逐飲可損毒之源，益毒之解，本研究亦證實益氣化瘀方、益氣逐飲方確有一定抗炎作用。

綜上所述，益氣解毒化瘀方不同拆方均可抑制ARDS大鼠模型TLR4、NLRP3的表達，進一步降低IL-1β和IL-18的表達水平，改善肺組織病理學形態(tài)，減輕肺損傷，其中益氣解毒方可能發(fā)揮主要作用。因此，TLR4-NLRP3通路可能是益氣解毒化瘀方不同拆方發(fā)揮抗炎作用干預(yù)ARDS的重要機制之一。