加味香連丸對(duì)急性放射性腸炎大鼠NF-κB信號(hào)通路的影響*

蘇景陽(yáng) 傅 越 王夢(mèng)蕾 嚴(yán) 江 王 玨 林勝友

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

放射性腸炎多為腹腔、盆腔及腹膜后惡性腫瘤予以放射線治療后所引起的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制與Toll樣受體（TLRs）[1]亞型中的TLR-4[2]所下調(diào)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）在內(nèi)的多種炎癥因子有關(guān)。腸道黏膜炎癥損傷后表現(xiàn)為受累組織黏膜炎癥水腫、壞死，甚至組織纖維化。林勝友名醫(yī)工作室主要開(kāi)展中醫(yī)藥抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，放化療增效減毒的臨床及基礎(chǔ)研究。林勝友教授為浙江省名中醫(yī)，強(qiáng)調(diào)放射線歸屬于“火熱毒邪”，自擬放射性腸炎經(jīng)驗(yàn)方——加味香連丸，由炒川連、廣木香、紅藤、蒲公英、敗醬草、馬齒莧6味藥組成，治以清熱解毒、澀腸止瀉，在放射性腸炎患者的治療中取得了顯著療效，明顯提高了患者生活質(zhì)量。為進(jìn)一步研究加味香連丸治療放射性腸炎的作用機(jī)制，本團(tuán)隊(duì)制備急性放射性腸炎大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。每籠飼養(yǎng)5只，SPF飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲用蒸餾水，室溫恒定26℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照為12 h明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，定期觀察大鼠外形、體形、行動(dòng)、有無(wú)異常損傷等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味香連丸，組方：炒川連6 g，廣木香 9 g，紅藤 15 g，蒲公英 15 g，敗醬草 15 g，馬齒莧30 g。藥材煎汁、過(guò)濾，濃縮至100%濃度，置4℃冰箱備用。思密達(dá)，博福一益普生（天津）制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000690，規(guī)格：3 g×10袋。

1.3 試劑及儀器 試劑：TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α試劑盒（福建省泉州市睿信生物科技有限公司）。儀器：醫(yī)用直線加速器（瓦里安），光學(xué)顯微鏡（Nikon），恒溫生化培養(yǎng)箱（博迅），冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo），洗板機(jī)（美國(guó)Bio-Rad），移液器（德國(guó)，Eppendorf）。

1.4 模型制備 40只大鼠禁食12 h后，隨機(jī)選取10只設(shè)為正常組，腹腔注射3%戊巴比妥1.5 mL/kg全麻后固定于有機(jī)玻璃板上，除正常組外，其余3組大鼠予直線加速器12-MV的X射線單次照射全腹部，腹部給予1 cm組織補(bǔ)償，調(diào)整準(zhǔn)直器光柵大小，上達(dá)劍突下，下至恥骨聯(lián)合，范圍大約5 cm×8 cm，源皮距100 cm，劑量率 200 cGy/min[3]。

1.5 分組與給藥 照射后12 h，將大鼠隨機(jī)分為模型組、加味香連丸組、思密達(dá)組，各10只。正常組、模型組予5 mL/kg生理鹽水灌胃；加味香連丸組按照60 kg成人-動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥效比例表?yè)Q算大鼠灌胃劑量。思密達(dá)組根據(jù)黃繼漢等[4]藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，由標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量到非標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的公式為Db′=Da·Rab·Sb，按大鼠實(shí)際體質(zhì)量算出所需思密達(dá)劑量并制成思密達(dá)混合液，每1 mL含0.283 g思密達(dá)，按0.283 g/kg灌胃。各組灌胃量均為5 mL/kg，每日1次，持續(xù)5 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）觀察各組大鼠一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食進(jìn)水、毛色、反應(yīng)靈敏程度、排便情況、體質(zhì)量變化等。正常大鼠糞便為棕褐色，粒狀；腹瀉表現(xiàn)為含不消化食物、黏液樣便、黃綠色稀水樣便、膿血便等。精神狀態(tài)、飲食進(jìn)水、排便情況分為好、較好、一般、較差、很差，分別對(duì)應(yīng)0分、1分、2分、3分和4分，評(píng)分越高，一般情況越差[5]。2）實(shí)驗(yàn)記錄至大鼠大量死亡當(dāng)天，剩余大鼠予CO2處死。在嚴(yán)格無(wú)菌條件下迅速打開(kāi)腹腔，取出空腸中段及回盲部近端回腸中段組織后用10%甲醛固定液固定48 h，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察并記錄各組大鼠腸組織病理改變。光鏡下評(píng)估絨毛水腫程度，絨毛疏密度、高矮、脫落情況，隱窩結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織出血及潰瘍等情況。按Chiu標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)各組腸黏膜損傷分為6級(jí)。3）另取部分空腸、回腸組織用預(yù)冷的0.9%NaCl溶液沖洗干凈后配置組織勻漿，根據(jù)TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α試劑盒（酶聯(lián)免疫分析法）說(shuō)明書(shū)配置試劑進(jìn)行檢測(cè)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用2019版EXCEL匯總數(shù)據(jù)，SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析，結(jié)果以（）表示。P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠形態(tài)學(xué)改變 見(jiàn)表1，表2。造模后大鼠精神狀態(tài)較前萎靡，造模當(dāng)晚模型組死亡1只；照射后第1天思密達(dá)組死亡1只，除正常組外各組大鼠飲食量減少，精神較前萎靡，大便成形。第2天大鼠體質(zhì)量減輕，模型組大鼠可見(jiàn)水樣便，加味香連丸、思密達(dá)組大鼠大便尚成形。照射后第3天模型組大鼠死亡2只，3組大鼠體質(zhì)量持續(xù)性降低，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡膽怯，成群蜷縮抱團(tuán)，各組大鼠均出現(xiàn)水樣便，模型組最明顯。照射后第4天大鼠死亡12只（模型組5只、加味香連丸組4只、思密達(dá)組3只），大鼠均出現(xiàn)水樣便，部分大鼠甚至出現(xiàn)膿血便，直腸脫垂，不欲飲食，體質(zhì)量明顯降低，呈嗜睡瀕死狀態(tài)。照射后第5天思密達(dá)組大鼠死亡4只，剩余大鼠極度萎靡，停止實(shí)驗(yàn)。放射后3組大鼠體質(zhì)量、癥狀評(píng)分較正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），加味香連丸組與思密達(dá)組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），癥狀評(píng)分存在明顯差異（P＜0.05）。

表1 各組急性放射性腸炎大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組急性放射性腸炎大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常組模型組加味香連丸組思密達(dá)組10 10 10 10 254.12±4.54 254.62±5.72 250.60±10.60 253.11±5.30 255.40±4.70 245.67±4.87*238.50±8.42*242.00±4.03*257.00±4.97 233.33±6.28*230.50±6.45*233.78±4.55*265.50±7.91 210.89±15.14*207.20±10.00*207.44±5.61*272.30±8.76 191.00±5.67*192.50±4.18*194.60±3.51*

表2 各組急性放射性腸炎大鼠癥狀評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組急性放射性腸炎大鼠癥狀評(píng)分比較（分，±s）

組 別n 照射后第0天 照射后第1天 照射后第2天 照射后第3天 照射后第4天正常組模型組加味香連丸組思密達(dá)組10 10 10 10 0 0 0 0 0 1.00±0.47*0.30±0.48*△0.44±0.53*△0 2.11±0.60*1.00±0.47*△1.22±0.67*△0 3.00±0.82*2.10±0.86*△2.56±0.88*0 3.50±0.71*2.83±0.75*3.00±0.63*

2.2 各組急性放射性腸炎大鼠大體解剖觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。模型組、加味香連丸組及思密達(dá)組大鼠均可見(jiàn)胃內(nèi)容物堆積、胃擴(kuò)張，3組大鼠腸道組織較正常組增粗水腫、淤血青紫，其中模型組腸道組織青紫最明顯，加味香連丸組表現(xiàn)相對(duì)較輕。

圖1 大鼠大體解剖觀察結(jié)果

2.3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織病理結(jié)果 見(jiàn)圖2，圖3。根據(jù)Chiu標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分級(jí)：正常組絨毛密集、高度相似，無(wú)脫落情況，隱窩結(jié)構(gòu)正常，組織無(wú)出血及潰瘍，評(píng)為0級(jí)；模型組絨毛脫落、腺體萎縮明顯，回腸部分可見(jiàn)固有層消化崩解，點(diǎn)狀出血及壞死，淋巴組織增生，肌層、漿膜層破壞缺失，評(píng)為5級(jí)；加味香連丸組絨毛結(jié)構(gòu)尚存，絨毛脫落變鈍，部分血管暴露，評(píng)為4級(jí)；思密達(dá)組絨毛破壞明顯，隱窩結(jié)構(gòu)異常，淋巴組織增生顯著，固有層消化崩解，可見(jiàn)點(diǎn)狀出血，評(píng)為5級(jí)。

圖2 各組大鼠回腸組織病理學(xué)觀察（HE染色，100倍）

圖3 各組大鼠空腸組織病理學(xué)觀察（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠小腸組織 TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α含量比較 見(jiàn)表3，表4。加味香連丸組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κBp65含量及相關(guān)炎癥因子IL-6、TNF-α含量較正常組無(wú)明顯差異（P＞0.05），加味香連丸組各項(xiàng)指標(biāo)較思密達(dá)組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κB p65含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織TLR-4、NF-κB p65含量比較（pg/mL，±s）

組別n TLR-4回腸 空腸NF-κB p65回腸 空腸10正常組模型組加味香連丸組思密達(dá)組2 6 2 545.57±29.86 509.71±10.01 518.29±17.00 505.06±9.47 506.13±21.70 510.30±11.34 504.57±20.15 540.85±44.84 38.02±1.59 37.34±0.31 36.49±1.94 36.87±0.39 36.16±1.72 36.79±1.31 34.69±1.56 36.56±0.85

表4 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織炎癥因子含量比較（pg/mL，±s）

表4 各組急性放射性腸炎大鼠腸組織炎癥因子含量比較（pg/mL，±s）

組別n正常組模型組加味香連丸組思密達(dá)組10 2 6 2 IL-6回腸31.77±1.45 32.24±0.06 31.81±1.19 31.48±0.40空腸30.77±0.98 32.53±0.86 31.14±1.41 31.60±0.27 TNF-α回腸65.27±2.91 67.45±0.94 66.15±2.09 65.10±2.88空腸63.01±2.27 67.34±1.79 65.67±3.43 65.85±3.45

3 討論

加味香連丸組TLR-4、NF-κBp65及相關(guān)炎癥因子IL-6、TNF-α含量與正常組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），提示加味香連丸對(duì)NF-κB信號(hào)通路有一定影響，可能存在抗炎效果。惡性腫瘤多為“癌毒”內(nèi)生所致[7-8]，放射線為火熱毒邪，火毒外侵，直接損傷腸道，導(dǎo)致腸道清濁不分，傳化失司，故大便稀溏或如水樣，次數(shù)增多，腹脹腹痛。放射性腸炎急性期邪氣亢盛，以祛邪為要。加味香連丸方中黃連清熱燥濕，瀉火解毒；木香辛行苦降，善行大腸之滯氣；紅藤善治腸癰，清熱活血；蒲公英、敗醬草、馬齒莧清熱消腫排膿。本方以清熱解毒，祛濕止瀉為主，能夠有效針對(duì)放射性腸炎熱毒外侵的發(fā)病機(jī)制。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為電離輻射能促使過(guò)量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產(chǎn)生從而誘導(dǎo)以NF-κB為核心的信號(hào)通路啟動(dòng)，促使TNF-α、IL-6等相關(guān)炎癥因子釋放，加重腸道黏膜炎癥損傷。因此，急性放射性腸炎可以通過(guò)阿米福汀清除ROS減少炎癥所致相關(guān)不良反應(yīng)[9]、口服益生菌制劑促進(jìn)黏膜成纖維細(xì)胞釋放環(huán)氧合酶介導(dǎo)的前列腺素E2維持黏膜上皮完整性和耐受性[10]及健康人群菌群移植調(diào)節(jié)腸道菌群[11]等治療。

Fiorino等[12]臨床研究表明，小腸受照劑量≥5 Gy時(shí)，隨著放射劑量的增加，不良反應(yīng)逐漸增加，當(dāng)放射劑量＞50 Gy時(shí)，可并發(fā)急性放射性腸炎。積極調(diào)控不同部位放射線劑量有利于減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。Chopra等[13]人員進(jìn)行的一項(xiàng)多因素研究中表示約束V15＜250 cc、V30＜100 cc以及V40＜90 cc可使大腸三級(jí)毒性由26.7%降至5.4%。Mouttet-Aldouard等[14]臨床也發(fā)現(xiàn)乙狀結(jié)腸V30～40 Gy與“消化道毒性”顯著相關(guān)（P＜0.006）。Smeenk等[15]則通過(guò)限制肛周不同肌肉照射放射劑量改善括約肌緊張度，同時(shí)降低大小便失禁的發(fā)生率。調(diào)強(qiáng)適形放療因靶區(qū)精確劑量治療以提高臨床療效并減少周圍器官并發(fā)癥而被推廣開(kāi)來(lái)。模型組、思密達(dá)組大鼠突然大量死亡考慮與放射線劑量過(guò)大、沒(méi)有調(diào)強(qiáng)適形放療有關(guān)，且與徐偉等[3]文獻(xiàn)報(bào)道的12 Gy是最佳造模劑量有所差異，表明單次放射線最佳劑量選定仍需進(jìn)一步證實(shí)。加味香連丸組大鼠癥狀改善不明顯考慮與大劑量放射線超過(guò)個(gè)體可調(diào)節(jié)閾值、導(dǎo)致個(gè)體無(wú)法耐受致使免疫系統(tǒng)損害有關(guān)。加味香連丸組大鼠大體解剖及病理組織損害相對(duì)模型組及思密達(dá)組大鼠較輕，TLR-4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α相關(guān)指標(biāo)含量與正常組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），可見(jiàn)加味香連丸能影響急性放射性腸炎大鼠NF-κB信號(hào)通路的炎癥指標(biāo)，起到一定的保護(hù)治療作用，但加味香連丸組大鼠相關(guān)檢驗(yàn)指標(biāo)與思密達(dá)組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），考慮可能與最終存活的大鼠耐受性較高或檢驗(yàn)指標(biāo)改善晚于臨床有關(guān)，還需進(jìn)一步延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期加以證明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還可選用不同大鼠，如SD、Wistar大鼠[16]進(jìn)行研究，不同品種大鼠差異性尚未比較，存在一定局限性。本研究以60 kg成人體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)治療劑量，給藥劑量是由林教授臨床不斷積累經(jīng)驗(yàn)后得出的結(jié)論，以此標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥效比例表?yè)Q算成大鼠灌胃的劑量，初步對(duì)比加味香連丸湯劑與常用西藥思密達(dá)對(duì)放射性腸炎的治療效果，但后期仍需增設(shè)不同濃度劑量組別進(jìn)行比較。此外后期應(yīng)建立腫瘤相關(guān)大鼠放射性腸炎動(dòng)物模型模擬人體腫瘤微環(huán)境，增設(shè)不同放射劑量、不同品種大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，增加常用中藥組與加味香連丸進(jìn)行比較以證實(shí)加味香連丸療效，突顯藥物特色；檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)更加全面，進(jìn)一步探查并確定加味香連丸相關(guān)藥物成分與NF-κB信號(hào)通路上相關(guān)位點(diǎn)及檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系。