芪歸銀方治療膿毒癥機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

楊亮亮 劉清泉

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010）

膿毒癥是引起全身炎癥反應(yīng)綜合征的最急性、危 重的疾病并發(fā)癥之一，通常由各種微生物引起，如細(xì)菌、真菌等。膿毒癥能引起多器官損傷和（或）衰竭[1]。它是導(dǎo)致膿毒癥患者發(fā)病和死亡的主要原因，尤其是年長(zhǎng)者和危重癥患者[2-3]。全世界膿毒癥發(fā)病率每年都在增加[4-5]，有報(bào)道稱膿毒癥的發(fā)病率約為1/1 000人，在中國(guó)膿毒癥住院死亡率約為48.7%[6]。

芪歸銀方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院劉清泉教授根據(jù)細(xì)菌感染性病癥創(chuàng)建的中藥復(fù)方，以扶正透邪為法，臨床應(yīng)用于感染性疾病及膿毒癥的治療。但鑒于中藥復(fù)方成分繁雜，運(yùn)用傳統(tǒng)科學(xué)研究手段仍無(wú)法全面闡述其復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)理，本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，通過(guò)建立芪歸銀方藥材-成分-靶點(diǎn)-病理相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究了芪歸銀方治療膿毒癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 芪歸銀方的有效藥物成分篩選 將組成芪歸銀方的各藥物輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中[7]，檢索芪歸銀方劑中的全部藥物活性成分。以“化合物口服生物利用度（OB）≥30%”和“化合物類藥性（DL）≥0.18”為條件篩選芪歸銀方的各藥物活性成分，對(duì)于不符合OB和DL篩選條件的成分結(jié)合查閱文獻(xiàn)予以補(bǔ)充，避免遺漏重要藥物成分。

1.2 藥物有效活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將有效活性成分導(dǎo)入 SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[8]檢測(cè)有效活性成分的作用靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）[9]規(guī)范名稱。

1.3 膿毒癥疾病靶基因的篩選 利用TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drug bank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/），關(guān)鍵詞“sepsis”，找到與膿毒癥發(fā)病相關(guān)的靶基因[10]。把3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的靶基因在Excel軟件中取并集，去除重復(fù)值，以靶基因與疾病之間的相關(guān)度為依據(jù)，從高到低排序，篩選出了相關(guān)度排名在前列的253個(gè)靶基因。

1.4 藥物與疾病交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將篩選出的方劑靶基因和膿毒癥疾病靶基因使用Excel軟件進(jìn)行合并，提取交集靶基因，得到芪歸銀方治療膿毒癥的交集靶基因數(shù)據(jù)。利用Cytoscape軟件繪制“藥物-活性成分-疾病基因”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點(diǎn)相互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵節(jié)靶點(diǎn)的篩選將篩選后獲得的芪歸銀方膿毒癥的交集靶基因，輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)（https：//string-db.org/）[11]以分析蛋白質(zhì)之間的相互作用。將得到的疾病靶基因PPI結(jié)構(gòu)圖導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中，使用“Notework Analyzer”工具拓?fù)浞治鯬PI網(wǎng)絡(luò)，指標(biāo)為節(jié)點(diǎn)連接度，篩選出前30個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)構(gòu)建核心靶點(diǎn)相互作用圖。

1.6 芪歸銀方治療膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)的富集分析 將芪歸銀方治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/）中進(jìn)行 KEGG 信號(hào)通路和GO生物過(guò)程富集分析，以P＜0.01為臨界值，通過(guò)篩選得到芪歸銀方治療膿毒癥的KEGG信號(hào)通路和GO生物過(guò)程，利用 bioinformatics（http：//www.bioinformatics.com.cn）獲取可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 有效活性成分篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到芪歸銀方總計(jì)636種藥物活性成分，其中黃芪87個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，金銀花236個(gè)，青蒿126個(gè)，虎杖62個(gè)。篩選出黃芪20個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，金銀花22個(gè)，青蒿22個(gè)，虎杖7個(gè)共73個(gè)有效活性成分，去除6個(gè)重復(fù)的成分，剩67個(gè)有效活性成分。

2.2 有效活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，得到有效活性成分作用靶點(diǎn)共有7 052個(gè)，其中黃芪2 000個(gè)、當(dāng)歸200個(gè)、金銀花1 924個(gè)、青蒿2 100個(gè)、虎杖828個(gè)，去掉共同靶基因后有922個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)Swiss Target Prediction得到75個(gè)藥物與疾病交集靶基因，構(gòu)建芪歸銀方治療膿毒癥的靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 構(gòu)建中藥-成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape3.7.2軟件建立藥物-成分-靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。深藍(lán)色菱形代表靶基因；淡綠色圓形代表藥材，六邊形表示藥材的有效活性成分，粉色六邊形代表黃芪的活性成分，橙色六邊形代表青蒿的活性成分，紫色六邊形代表金銀花的活性成分，墨綠色六邊形代表虎杖的活性成分，淡黃色六邊形代表幾種藥物的共有活性成分。

圖1 中藥-成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及其核心靶點(diǎn)的篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)并分析得出蛋白相互作用圖（PPI），節(jié)點(diǎn)為靶基因，“邊”是與靶基因作用，共有75個(gè)節(jié)點(diǎn)、646條邊，見(jiàn)圖2。分別算出網(wǎng)絡(luò)圖中各個(gè)靶基因Degree，利用degree計(jì)算可以得到重要的膿毒癥關(guān)鍵蛋白質(zhì)作用靶點(diǎn)，按Degree數(shù)值排序，前30位的核心節(jié)點(diǎn)分別為TNF、MAPK3、ALB、MAPK1、CASP3、STAT3、TLR4、MMP9、NOS3、ICAM1、MPO、MTOR、RELA、MMP2、SIRT1、SERPINE1、HIF1A、JAK2、CTNNB1、HMOX1、TLR9、EP300、CASP8、F2、PIK3R1、CASP1、NLRP3、NR3C1、ELANE、CXCR2。

圖2 芪歸銀方治療膿毒癥的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO生物功能注釋 將芪歸銀方對(duì)膿毒癥治療的99個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P＜0.01為篩選要求，得到1 730條GO生物學(xué)過(guò)程，其中分子功能90條、生物過(guò)程1 576條、細(xì)胞組成64條（見(jiàn)圖3）。取P值最低的10個(gè)條目注釋（見(jiàn)表1），潛在靶點(diǎn)在生物過(guò)程中主要富集于細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、凋亡信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；分子功能中主要富集為肽鏈內(nèi)切酶活性、肽酶活性等；在細(xì)胞組成中主要富集條目為膜筏、膜微結(jié)構(gòu)閾等。

圖3 芪歸銀方治療膿毒癥的GO富集分析

表1 芪歸銀方治療膿毒癥的GO生物功能注釋（前10名）

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析（P＜0.01），得出252條芪歸銀方治療膿毒癥的信號(hào)通路。按照從小到大的次序?qū)值進(jìn)行排列，并取P值最小的前20個(gè)通路進(jìn)行分析（見(jiàn)表2）和得到可視化結(jié)果，見(jiàn)圖4，節(jié)點(diǎn)越大代表富集基因數(shù)量就越多，顏色越紅代表富集越明顯。共同靶點(diǎn)主要富集在癌癥、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等疾病及HIF-1信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、血小板活化信號(hào)通路等信號(hào)通路上。

圖4 芪歸銀方治療膿毒癥的KEGG分析氣泡圖

表2 芪歸銀方治療膿毒癥的主要作用靶點(diǎn)KEGG富集結(jié)果（前20位）

3 討論

芪歸銀方是劉清泉教授在細(xì)菌感染疾病的病機(jī)基礎(chǔ)上，以扶正透邪為法研究創(chuàng)建的方劑，在臨床上主要用來(lái)防治感染性疾病和膿毒癥[12]。芪歸銀方藥物組成：黃芪、當(dāng)歸、金銀花、虎杖、青蒿。黃芪、銀花、當(dāng)歸3味藥為本方的主體。氣與血在機(jī)體中是互根互用，互為因果的關(guān)系，氣為血之帥，血為氣之母，氣盛則血充；血液的運(yùn)行亦離不開(kāi)氣的推動(dòng)作用，氣虛氣滯，都會(huì)導(dǎo)致血瘀，氣的充盈且氣機(jī)調(diào)暢可以推動(dòng)血液在體內(nèi)的暢通循環(huán)運(yùn)行。黃芪為補(bǔ)氣的圣藥，方中大量運(yùn)用黃芪為君藥健脾補(bǔ)氣，補(bǔ)益體內(nèi)元?dú)?，以滋養(yǎng)生血之源，并與血中氣藥當(dāng)歸配伍，氣藥、血藥合而為用，血得氣速生；另一方面，氣旺則血行，氣的推進(jìn)是血液運(yùn)行的動(dòng)力，氣的溫煦功也能促進(jìn)血液的運(yùn)行，黃芪與當(dāng)歸合用，補(bǔ)氣生血，行血活血，使補(bǔ)而不滯，疏而不損，很好的印證了西醫(yī)免疫與凝血系統(tǒng)的相互作用關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，芪歸銀方防治膿毒癥的重要靶點(diǎn)和重要通路，主要參加了炎癥和凝血的過(guò)程。

膿毒癥是機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡的結(jié)果，在早期由于大量炎癥因子釋放后作用于機(jī)體的主要臟器，從而造成了器官功能不全，同時(shí)由于巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎性介質(zhì)參與固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了炎癥介質(zhì)瀑布效應(yīng)，最后造成膿毒癥休克和多器官功能衰竭[13]。膿毒癥致病過(guò)程的核心通路是核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）[14]。NF-κB參與膿毒癥的病理生理的主要機(jī)制，調(diào)節(jié)了大量炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)[15]。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）能激活NF-κB[16]。AGEs和RAGE作用后能夠引起氧化應(yīng)激，從而激活p38 ras蛋白和絲裂原活化蛋白（MAP）激酶激活NF-κB，NF-κB的活化可以使一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞克隆刺激因子等炎癥因子以及VCAM-1、ICAM-1等分泌增加，同時(shí)大量炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和黏附分子的表達(dá)釋放能引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，并持續(xù)導(dǎo)致機(jī)體功能失調(diào)和細(xì)胞破壞，從而引起組織器官損害的產(chǎn)生[17]。首先，芪歸銀方可能通過(guò)作用于HIF-1信號(hào)通路及AGE-RAGE信號(hào)通路調(diào)節(jié)其下游的NF-κB信號(hào)通路，使其活性降低，減少NF-κB在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中介導(dǎo)IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，阻斷了“炎癥瀑布”的形成。方中君藥黃芪的主要成分為黃芪總皂苷，被證明能降低性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脾臟組織和血清中IL-1β的表達(dá)，升高IL-10的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控促炎和抗炎因子水平，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎性反應(yīng)微環(huán)境[18]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明芪歸銀能影響IL-1β及TNF-α血清濃度，有效調(diào)節(jié)機(jī)體炎性免疫應(yīng)答，可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)使自噬減少，使膿毒癥急性腎損傷得到改善[19-20]。

其次，芪歸銀方可能通過(guò)作用于血小板活化通路發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，芪歸銀方與膿毒癥的核心靶點(diǎn)TLR4可以促進(jìn)血小板的活化和釋放，是介導(dǎo)血小板活化通路的模式識(shí)別受體[21]。此外，芪歸銀方的核心靶點(diǎn)MAPK介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶通路已被證實(shí)與血小板顆粒分泌有關(guān)[21]。血小板活化在膿毒癥產(chǎn)生和進(jìn)展過(guò)程中有著重要意義，血小板活化后在膿毒癥中將發(fā)揮雙重作用，首先，血小板活化后可通過(guò)激活凝血系統(tǒng)及參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)限制血液中病原體的播散，從而協(xié)助吞噬細(xì)胞吞噬并分解病原體；但是活化后的血小板卻可以通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致凝血功能失調(diào)、免疫功能失衡及炎性反應(yīng)過(guò)度，損害機(jī)體器官功能，導(dǎo)致膿毒性休克和MODS[22]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞損害及炎癥、凝血反應(yīng)均會(huì)激活血小板，當(dāng)血小板被激活后又與炎癥介質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，進(jìn)而加重凝血功能紊亂和全身炎性反應(yīng)，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的微循環(huán)功能障礙和器官功能損害[23]。血小板還參與了多種免疫過(guò)程，有證據(jù)表明血小板參與了：1）對(duì)微生物威脅的干預(yù)；2）招募和促進(jìn)固有效應(yīng)細(xì)胞功能；3）調(diào)節(jié)抗原提呈；4）增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并表達(dá)多種功能性免疫受體，使其在有效地與其他細(xì)胞溝通和調(diào)節(jié)其功能方面發(fā)揮重要作用，并在調(diào)節(jié)免疫方面執(zhí)行哨兵任務(wù)[24]。

降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）是臨床常用的感染相關(guān)性指標(biāo)，其中PCT具有高敏感性和高特異性，CRP敏感性較高而特異性較低，課題組臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果[25]顯示芪歸銀方聯(lián)合抗生素可以減輕膿毒癥心肌抑制患者的炎癥反應(yīng)，在常規(guī)應(yīng)用抗感染藥物的同時(shí)，加用芪歸銀方組患者PCT顯著下降出現(xiàn)在第3天，CRP顯著下降出現(xiàn)在第7天，治療7 d后兩組患者的PCT、CRP及肌鈣蛋白I（cTnI）、肌鈣蛋白T（cTnT）均較治療前明顯下降，兩組患者治療7 d后的CRP及cTnT出現(xiàn)顯著差異，相比于對(duì)照組，芪歸銀顆?？梢约铀傺装Y因子的清除，與芪歸銀方能調(diào)節(jié)膿毒癥患者機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程的網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)果相互印證。

炎癥與凝血系統(tǒng)是機(jī)體完成生命活動(dòng)主要的生理、病理系統(tǒng)，它們之間既彼此獨(dú)立又存在著復(fù)雜的相互作用，其中任何一個(gè)系統(tǒng)功能失調(diào)，都可能引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜的病理性改變[26]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)芪歸銀方治療膿毒癥的機(jī)制可能是通過(guò)潛在靶點(diǎn)和HIF-1、AGE-RAGE及血小板活化信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥和凝血間的相互關(guān)系治療膿毒癥的，本研究首次發(fā)現(xiàn)了芪歸銀方能夠作用于血小板活化通路，可能通過(guò)血小板活化通路發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究芪歸銀方通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥與凝血相互作用關(guān)系治療膿毒癥開(kāi)辟了新的研究方向，還需在此基礎(chǔ)上開(kāi)展深入探究，并進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。