子癇前期患者血清及胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、高遷移率族蛋白B1表達觀察

李本祥，韓玉珍，高榕悅，游潘，李金鳳，李文雄，黃立鋒

1 貴州省黔西南州人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，貴州興義 562400；2 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院SICU；3 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院婦產科

子癇前期是一種孕期常見的妊娠并發(fā)癥，嚴重威脅孕產婦及新生兒的生命安全。子癇前期的發(fā)病機制復雜，其具體作用機制目前尚未完全明確。研究［1］表明，子癇前期與炎癥免疫過度激活和損傷相關模式分子（DAMPs）緊密相關。DAMPs 是組織或細胞受到損傷、缺氧、應激等因素刺激后釋放到細胞間隙或血液循環(huán)中的一類物質［2］，可通過Toll 樣受體、RIG-1樣受體或NOD 樣受體等模式識別受體，誘導人體自身免疫或免疫耐受，在關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin，S100A8/A9）與高遷移率族蛋白B1（High mobility group box-1 pro‐tein，HMGB1）均屬于DAMPs。與腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等早期炎癥因子比較，感染、創(chuàng)傷患者外周血中鈣衛(wèi)蛋白與HMGB1 水平升高相對滯后但持續(xù)時間較長。因此，鈣衛(wèi)蛋白和HMGB1 被稱為“晚期”炎癥因子［4-6］，在慢性炎性疾病、膿毒血癥、高血壓及免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［7-9］。但目前關于二者在子癇前期發(fā)病中的作用相關研究較少。為此我們觀察了子癇前期患者血清及胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 表達情況，并分析二者與子癇前期患者病情嚴重程度的相關性，為探索氧化應激、免疫調控機制在子癇前期發(fā)病過程中所起作用提供循證學依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年10 月—2021 年10 月間于首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院婦產科病房及門診部就診的子癇前期患者120例（觀察組）。根據《婦產科學》（第8版）子癇前期的診斷標準將子癇前期定義為：妊娠20 周后患者收縮壓≥140 mmHg 和（或）舒張壓≥90 mmHg 伴蛋白尿≥0.3 g/24 h 或隨機尿蛋白≥（+）。排除標準：罹患急慢性感染性疾病、慢性高血壓、腎病、糖尿病、風濕免疫性疾病、胎膜早破、臨產等。觀察組年齡（32.0 ± 0.6）歲，BMI（28.2 ± 0.3）kg/m2；收縮壓（159 ± 13）mmHg，舒張壓（94± 6）mmHg；中晚發(fā)型子癇前期69 例、早發(fā)型子癇前期51 例；輕度子癇前期42 例，重度子癇前期78例；新生兒體質量（2 715±115）g。另選擇正常妊娠孕婦100 例為對照組，其中足月孕婦主要為住院患者，因骨盆狹窄或臀位等因素擬行擇期剖宮產術，對照組未足月孕婦主要為門診患者；對照組年齡（30.0 ± 0.4）歲，BMI（27.0 ± 0.2）kg/m2，收縮壓（121±8）mmHg，舒張壓（70±4）mmHg，新生兒體質量（3 523±238）g。兩組孕婦年齡、孕周及BMI 等一般資料具有可比性（P> 0.05）。與對照組比較，觀察組分娩孕周早，新生兒出生體質量低（P<0.05）。該研究為單中心橫斷面研究，經本院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 兩組孕婦血清及胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1檢測 在終止妊娠前48 小時采集兩組患者空腹狀態(tài)下外周靜脈血15～20 mL；非抗凝管內留取血標本約2 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清，采用ELI‐SA 法檢測兩組血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1。兩組孕婦分娩后，均留取直徑約1 cm 胎盤組織（母體面，避開梗死及鈣化明顯區(qū)域），10%甲醛液固定后，制作石蠟切片并行免疫組化染色。光學顯微鏡下觀察胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 蛋白表達情況，評分標準參照Shimizu方法，綜合陽性細胞所占比例和染色強度進行半定量測定。鈣衛(wèi)蛋白主要表達于胎盤組織間質的中性粒細胞及巨噬細胞中，呈中等強度（++）或弱表達（+）表達。HMGB1在胎盤的滋養(yǎng)細胞、間質細胞及血管內皮細胞的細胞核上均有較強的核染色，將只在核外胞漿內HMGB1染色的細胞作為陽性細胞。陽性細胞所占比例評分標準：未見陽性細胞計0分；陽性細胞表達率<25%計1分；陽性細胞表達率25%～75%計2分；陽性細胞表達率>75%計3分。染色強度評分標準：不著色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計算3分。將陽性細胞所占比例評分與染色強度評分相加即為最終半定量評價結果：0～1分為陰性，2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。檢測均重復3次，取平均值。主要實驗試劑：人鈣衛(wèi)蛋白（S100A8/A9）ELISA 試劑盒購自美國R&D Systems 公司，人HMGB1 ELISA 試劑盒購自北京Expandbio 公司，小鼠抗人鈣衛(wèi)蛋白（S100A8/A9）單克隆抗體和兔抗人HMGB1單克隆抗體購自英國Abcam 公司，3，3 一二氨基苯聯胺（DAB）顯色劑試劑盒和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理。采用非參數檢驗分析數據分布的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，組間比較采用獨立樣本間的t檢驗，多組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布的計量資料用中位數或四分位數表示組間比較采用Mann-Whitney 檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。采用直線相關分析法分析鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 與子癇前期患者病情嚴重程度的相關性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 終止妊娠前48 小時兩組血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 水平比較 終止妊娠前48 小時兩組血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1水平比較見表1。

表1 終止妊娠前48小時兩組血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1水平比較（μg/L，±s）

表1 終止妊娠前48小時兩組血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1水平比較（μg/L，±s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

分組HMGB1 n 鈣衛(wèi)蛋白觀察組對照組72.48±7.57*47.57±3.07 120 100 2 656.76±124.56*1 877.33± 95.69

2.2 兩組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 蛋白表達比較 220例孕婦共收集到195例胎盤組織標本，其中觀察組119 例（其中重度63 例、輕度56 例）、對照組76 例。觀察組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白表達弱陽性、陽性、強陽性分別為35、53及31例，HMGB1弱陽性、陽性、強陽性分別為36、56及27例；對照組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白表達弱陽性、陽性、強陽性分別為26、35及15例，HMGB1 弱陽性、陽性、強陽性分別為31、37 及8例。與對照組比較，觀察組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 表達綜合評價結果在各個水平均較高（P均<0.05）。

2.3 血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 表達與子癇患者臨床有關指標的相關性 血清鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1 水平與子癇前期患者血壓升高持續(xù)時間均呈正相關（r分別0.886、0.838；P均<0.05）；血清鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 水平與子癇前期患者孕周均呈負相關（r分別為-0.723、-0.731；P均<0.05）。

3 討論

子癇前期以妊娠20 周后患者出現高血壓、蛋白尿為主要臨床特征，占孕產婦總數的5%～8%，可導致母體多器官功能損害，增加圍產兒的病死率［10］。子癇前期的病因及病理機制一直以來都是人們研究熱點，但迄今為止其發(fā)病機制尚未完全闡明。目前主要的子癇前期病因學說包括：炎癥免疫過度激活、遺傳因素、營養(yǎng)元素缺乏及胰島素抵抗等。炎性反應水平對胚胎成功著床及正常分娩有重要意義，但是過度炎性反應的激活，可導致血管內皮損傷、過度免疫應答等，對妊娠結局而言則具有不良影響。目前，越來越多的證據［11-13］顯示，炎癥反應的過度激活可能在子癇前期中的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。

近年來關于子癇前期的研究中，比較重要的進展是發(fā)現內源性因素，即非感染性因素，也可以通過與病原體相同的途徑誘發(fā)過度炎性反應，這些內源性分子被稱為DAMPs［14］。常見的DAMPs 包括HMGB1、尿酸及IL-1 等，這些指標均與子癇前期的發(fā)病密切相關。高遷移率族蛋白B1 是存在于真核生物中的一種非組蛋白核蛋白，能參與DNA 的構成、分化、重組、轉錄。HMGB1 向細胞外釋放，可以促進炎性細胞因子分泌，造成組織損傷或壞死。在子癇前期器官缺氧狀態(tài)下，HMGB1可以釋放到母體血液循環(huán)中，進而誘發(fā)炎性反應，加重器官損害及疾病進展。研究［15］發(fā)現，鈣衛(wèi)蛋白也具有DAMPs的特點，并且在炎性反應中與人們所熟知的HMGB1 分泌特征相似，具有出現相對較晚但持續(xù)存在時間較長的特征，因此其與HMGB1 均被稱為“晚期炎癥因子”，在膿毒癥、創(chuàng)傷及慢性炎性疾病等發(fā)病過程中有重要的意義。

目前針對HMGB1 在子癇前期中的作用已開展若干研究，但關于子癇前期患者外周循環(huán)中HMGB1表達水平與正常妊娠孕婦相比是否存在差異，臨床尚存一定爭議。有研究［16］發(fā)現，在子癇前期患者外周血中HMGB1 水平要高于正常妊娠孕婦，且其胎盤滋養(yǎng)細胞中HMGB1、RAGE 受體及TLR4 受體均呈高表達狀態(tài)，有些研究則認為子癇前期與正常妊娠血漿中HMGB1 無顯著差異。另有研究［17］發(fā)現，子癇前期孕婦外周血中鈣衛(wèi)蛋白表達較正常妊娠者明顯升高。還有研究表明，金屬基質蛋白酶（MMPS）對孕早期胎盤絨毛的浸潤及子宮螺旋小動脈的重鑄具有重要的作用，而鈣—鋅結合蛋白質可以抑制MMPS的表達［18］。由于鈣衛(wèi)蛋白也是一種鈣—鋅結合蛋白，因此推測其在子癇前期的發(fā)病過程同樣扮演著重要的角色。

在本研究中，我們檢測了子癇前期患者血清及胎盤中鈣衛(wèi)蛋白表達，并以同類DAMP 分子HMGB1做為對照，以了解二者與子癇前期疾病進展的內在關系，結果發(fā)現，子癇前期患者外周血血清中鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1 均較正常妊娠組升高。本研究同時發(fā)現，子癇前期中鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1水平的升高與子癇前期患者血壓升高持續(xù)的時間呈正相關，與孕周呈負相關。臨床上，患者孕期高血壓病程越長，子癇前期發(fā)病時孕周越小，鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1水平相對越高。由此可見，鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1表達水平與子癇前期疾病進展密切相關［18-19］。胎母界面的炎癥免疫平衡對于正常妊娠的維持及分娩發(fā)揮著至關重要的作用。而過度的炎癥反應、促炎因子的大量釋放則可能誘發(fā)免疫失衡，導致子癇前期或早產等并發(fā)癥［20］。胎盤組織的免疫組化染色中，鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1主要在組織間的中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞中表達，子癇前期中的表達強度高于正常妊娠組，因此推測鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1可能參與了子癇前期胎母界面過度炎癥免疫反應過程。鈣衛(wèi)蛋白和HMGB1 都可以阻斷DC 的分化和抗原提呈作用，進而削弱T 細胞的免疫應答［21］。在變應性過敏性皮炎的的小鼠模型中，發(fā)現S100a9-/-樹突狀細胞可以通過增加細胞因子INF-γ 和IL-17 的分泌，促使T 細胞增殖率升高［22］。單獨的S100A8 和S100A8/A9 都可以誘導成熟的具有免疫原性的DC 向不成熟的亞群轉化。鈣衛(wèi)蛋白水平與mDC/pDC 亞群比例變化呈正相關［23］。因此推測，子癇前期中鈣衛(wèi)蛋白水平的增高，可能影響了DC表型的變化，導致mDC/pDC比例的上調，從而使機體免疫調節(jié)功能下降。

綜上所述，子癇前期患者外周血鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1 水平升高，胎盤組織中鈣衛(wèi)蛋白、HMGB1表達升高。鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1 表達升高與子癇前期病情的進展相關，可能參與了子癇前期疾病發(fā)生、發(fā)展的病理過程。鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1 可能成為預測子癇前期的一種潛在標志物。進一步對不同妊娠時期及子癇前期患者外周血及胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白及HMGB1 表達進行深入的、大樣本研究，對子癇前期患者的早期篩查和及時干預具有積極的臨床意義。