miR-370-3p和FOXM1 mRNA對人成骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響觀察及其靶向關(guān)系驗(yàn)證

王曉欣，劉紅艷，朱興

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250062；2 煙臺(tái)市萊陽中心醫(yī)院病理科；3 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（青島）病理科

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性骨腫瘤［1］。目前無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的五年生存率為70%，但發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者的五年生存率仍然維持在20%左右［2］。因此，探尋骨肉瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的具體發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)。微小RNA（miRNA）是一類含有18～25 個(gè)堿基的非編碼單鏈RNA。miRNA 可通過與編碼mRNA 的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）結(jié)合，干擾編碼RNA 的翻譯過程，甚至導(dǎo)致編碼RNA 的直接降解［3］。miR-133a、miR-93等miRNA 的表達(dá)失調(diào)可能與骨肉瘤的發(fā)生相關(guān)，可用作預(yù)測骨肉瘤發(fā)生、評價(jià)預(yù)后的生物標(biāo)志物［4］。研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p 在乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌等多種癌組織中異常表達(dá)，作為抑癌微小基因在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但miR-370-3p在骨肉瘤發(fā)生及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制目前鮮有報(bào)道。我們前期通過TargetScan 軟件預(yù)測miR-370-3p 的潛在靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)叉頭框蛋白M1（FOXM1）可能是miR-370-3p的靶基因［7］。FOXM1是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)控細(xì)胞周期。研究［8］發(fā)現(xiàn)，許多中晚期癌組織中存在FOXM1 異常高表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡，抑制癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2017年9月—2020年6月，我們觀察了骨肉瘤組織中miR-370-3p、FOXM 1 mRNA 的表達(dá)變化，觀察miR-370-3p 促進(jìn)表達(dá)及FOXM1 抑制表達(dá)的人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63 增殖、遷移及侵襲能力變化，驗(yàn)證MG63細(xì)胞中miR-370-3p與FOXM1的靶向關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 骨肉瘤組織miR-370-3p及FOXM1 mRNA表達(dá)觀察

1.1.1 臨床資料 選取2016 年4 月—2020 年5 月萊陽中心醫(yī)院擬行腫瘤切除術(shù)的37例骨肉瘤患者，均經(jīng)明確病理診斷為骨肉瘤，患者中男11 例、女26例，年齡≤18 歲27 例、>18 歲10 例；腫瘤直徑≤50 mm者12 例，>50 mm 者25 例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)確立TNM 臨床分期為Ⅰ/ⅡA 期9例、ⅡB/Ⅲ期28例，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移27例。納入者術(shù)前均未經(jīng)過放化療，患者或其家屬已簽署知情同意書。術(shù)中保存骨肉瘤及其癌旁組織。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.1.2 骨肉瘤及癌旁組織中miR-370-3p 及FOXM1 mRNA 檢測 采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）法。 使用TRIzol 試劑（Life Technologies 公司）提取骨肉瘤及癌旁組織總RNA，用PrimeScript RT Reagent 試劑盒（TAKARA 公司）將1 μg 的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-370-3p以U6作為內(nèi)參，F(xiàn)OXM1 mRNA以β-actin 作為內(nèi)參，引物由生工生物工程股份有限公司合成，F(xiàn)OXM1 正向引物：5’-CAGTCC‐GATTAGTCAGCTCCT-3’，反向引物：5’-GTCATT‐TAGCTCCTTGTGCTG-3’；β-actin 正向引物：5’-CT‐GATATAGCCGCGCTCG-3’，反向引物：5’-CACTCG‐GTGCCGGATCATCA-3’；miR-370-3p 正向引物：5’-ACACTCCAGCTGGGGCCTGCTGGGGTGGAACCCT -3’，反向引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6正向引物：5’-CCTGCTTCGGGAGCCCA-3’，反向引物：5’-ACCGCTCCACGTATTAGCGT-3’。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA 公司）在StepOne‐PlusTM real-time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)os‐ter City，CA，USA），反應(yīng)體系30 μL，反應(yīng)條件：95 ℃持續(xù)30 s，95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt代表miR-370-3p和FOXM1 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.1.3 miR-370-3p 表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系 通過Kaplan-Meier 曲線分析骨肉瘤與癌旁組織FOXM1 mRNA 表達(dá)與miR-370-3p 表達(dá)的相關(guān)性。收集37 例骨肉瘤患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，根據(jù)骨肉瘤組織miR-370-3p 相對表達(dá)量，將miR-370-3p 分成高表達(dá)（>0.502）及低表達(dá)（≤0.502），采用Kaplan-Meier 曲線、Log-Rank 檢驗(yàn)分析miR-370-3p 表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1.2 miR-370-3p過表達(dá)及FOXM1抑制表達(dá)的人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63增殖、遷移及侵襲的影響

1.2.1 骨肉瘤細(xì)胞分組及miR-370-3p mimic、FOXM1 siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將MG63（武漢普諾賽科技生命有限公司）細(xì)胞分為1～4組，2×104/孔接種于6孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至待細(xì)胞貼壁率達(dá)到70%時(shí)，1～4組通過miR-370-3p mimic、mimic NC、空白對照組及FOXM1 siRNA 干擾質(zhì)粒（上海吉瑪基因公司）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，以2×103/孔接種到96 孔板中。將含有10%CCK-8（北京索萊寶公司）的培養(yǎng)基加入96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h時(shí)在酶標(biāo)儀中于450 nm 處測量各組光密度OD 值。以O(shè)D450 代表各組細(xì)胞的增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.3 各組細(xì)胞遷移能力觀察 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，重懸后2×104/孔種植于6孔板中，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使用100 μL移液管尖端與尺子于孔板底部平行劃痕，分別于劃痕0、48 h時(shí)于光學(xué)顯微鏡（200×）下觀察拍照各組細(xì)胞的劃痕愈合情況，測算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell 小室。取40 μL 的Matrige 基質(zhì)膠（1：4 稀釋，美國密理博公司）均勻涂抹于預(yù)冷的Transwell 腔室上部，于培養(yǎng)箱孵育30 min。取各組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸至2×105/mL，取300 μL 加入上部Transwell 腔室中，下室中加入20%胎牛血清培養(yǎng)基700 μL，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h。于光學(xué)顯微鏡（200×）下觀察細(xì)胞的侵襲情況，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 MG63 細(xì)胞miR-370-3p 與FOXM1 靶向關(guān)系驗(yàn)證 miR-370-3p 與FOXM1 靶向結(jié)合能力觀察 檢索TargetScan 等數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)miR-370-3p 與FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子mRNA 的3’UTR 區(qū)域存在7 個(gè)連續(xù)的互補(bǔ)配對堿基，提示理論上miR-370-3p 能夠與FOXM1 靶向結(jié)合。①pmirGLO-FOXM1-野生型/突變型質(zhì)粒構(gòu)建 將含有miR-370-3p 結(jié)合位點(diǎn)的FOXM1 片段擴(kuò)增并克隆到雙熒光素酶pmirGLO 載體中，獲得pmirGLO-FOXM1-野生型（pmirGLOFOXM1-WT）質(zhì)粒。利用QuikChange 定點(diǎn)突變試劑盒對FOXM1 中miR-370-3p 的假定結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，合成pmirGLO-FOXM1- 突變型（pmirGLOFOXM1-MUT）質(zhì)粒。②MG63 細(xì)胞分組及pmirGLOFOXM1-WT/MUT、miR-370-3p mimc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 調(diào)整MG63 細(xì)胞密度為5×103/孔，培養(yǎng)24 h 時(shí)將細(xì)胞分為4 組，每組6 個(gè)復(fù)孔。A、B、C、D 組分別用1 μL pmirGLO-FOXM1-WT+200 nmol miR-370-3p mimic、1 μL pmirGLO-FOXM1-WT + mimic NC、1 μL pmir‐GLO-FOXM1-MUT + 200 nmol miR-370-3p mimic、1 μL pmirGLO-FOXM1-MUT+200 nmol mimic NC 與脂質(zhì)體Lipofectamine3000共轉(zhuǎn)染。③各組細(xì)胞熒光活性觀察 轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)根據(jù)說明書步驟，采用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)測算各組熒光活性，熒光活性下降說明miR-370-3p mimc與FOXM1發(fā)生靶向結(jié)合作用，如無熒光活性改變則證明兩者無靶向結(jié)合作用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)對比采用獨(dú)立或配對樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。生存曲線分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤及癌旁組織miR-370-3p、FOXM1 mRNA表達(dá)

2.1.1 骨肉瘤及癌旁組織miR-370-3p、FOXM1 mRNA 相對表達(dá)量比較及其相關(guān)性 骨肉瘤組織miR-370-3p、FOXM1 mRNA 相對表達(dá)量分別為0.50 ± 0.28、2.26 ± 0.16，癌旁組織分別為1.26 ±0.21、1.63 ± 0.17。與癌旁組織比較，骨肉瘤組織miR-370-3p相對表達(dá)量低、FOXM1 mRNA 相對表達(dá)量高（t=4.66，3.41；P 均<0.05）。隨miR-370-3p表達(dá)量升高，骨肉瘤組織FOXM1 mRNA表達(dá)量呈下降趨勢（R2=0.6481，P=0.1284）。

2.1.2 miR-370-3p 表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系 miR-370-3p表達(dá)與骨肉瘤患者年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)（χ2=2.862、0.014、1.117；P均>0.05），與臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（χ2=4.430、6.027；P均<0.05）。miR-370-3p 低表達(dá)的骨肉瘤患者預(yù)后比miR-370-3p 高表達(dá)患者差（P<0.05）。

2.2 各組細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力比較 轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h 時(shí)各組細(xì)胞OD450 值比較見表1。 1、2、3、4 組劃痕愈合率分別為23.77% ±1.18%、50.02% ± 2.64%、51.73% ± 1.88%、24.17%±5.20%，與2、3 組相比，1、4 組劃痕愈合率低（P 均<0.05）。1、2、3、4 組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為91±9、157±11、163±9、95±7。與2、3組相比，1、4組穿膜細(xì)胞數(shù)少（P均<0.05）。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h時(shí)各組細(xì)胞OD450值比較（±s）

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h時(shí)各組細(xì)胞OD450值比較（±s）

注：與3組比較，＊P<0.05；為與2組比較，ΔP<0.05。

組別轉(zhuǎn)染72 h 0.798±0.05 ＊Δ 1.163±0.03 1.111±0.11 0.745±0.05 ＊Δ 1組2組3組4組轉(zhuǎn)染96 h 0.933±0.07＊Δ 1.270±0.07 1.303±0.08 0.829±0.07＊Δ轉(zhuǎn)染0 h 0.344±0.02 0.353±0.04 0.329±0.03 0.241±0.02轉(zhuǎn)染24 h 0.498±0.03＊Δ 0.513±0.02 0.531±0.02 0.384±0.04＊Δ OD450值轉(zhuǎn)染48 h 0.603±0.03＊Δ 0.830±0.03 0.837±0.03 0.594±0.08＊Δ

2.3 各組細(xì)胞熒光活性比較 轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)A、B、C、D 組細(xì)胞熒光活性分別為0.516 ± 0.105、1.004 ± 0.032、0.948 ± 0.06、1.015 ± 0.008。與B組比較，A 組細(xì)胞熒光活性降低（t=9.42，P<0.05）；與D 組比較，C 組細(xì)胞中熒光活性變化不明顯（t=1.294，P=0.392）。

3 討論

微小非編碼RNA（miRNA）及其下游調(diào)控的功能性靶基因表達(dá)失衡是導(dǎo)致許多癌癥發(fā)生重要因素之一。正常情況下，miRNA 在細(xì)胞的增殖分化過程中通過堿基互補(bǔ)配對靶向結(jié)合mRNA 的3’UTR 端來實(shí)現(xiàn)對mRNA 的翻譯抑制或是降解的作用［9］。miR-370 在不同癌癥的發(fā)生過程中扮演著雙重角色的作用。作為致癌基因，WEI 等［10］通過qRTPCR 檢測了41 例惡性黑色素瘤患者腫瘤組織及癌旁組織中miR-370 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-370在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且miR-370 的高表達(dá)與TNM 高分期有明顯相關(guān)性，此外降低miR-370 的表達(dá)能夠抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞Sk-MEL-1 和A375 的增殖、侵襲及凋亡，同樣miR-370 高表達(dá)能夠在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長以及抑制其凋亡的發(fā)生，此表明miR-370 在惡性黑色素瘤中扮演著致癌基因的作用。作為抑癌因子，長鏈非編碼RNACircMYO10 可以通過競爭性抑制miR-370-3p 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其主要機(jī)制為抑制miR-370-3p/RU‐VBL1 軸致使染色質(zhì)重構(gòu)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-370-3p 在骨肉瘤組織中表達(dá)相比于癌旁正常組織表達(dá)明顯降低，miR-370-3p 的低表達(dá)與患者的高臨床分期及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p 低表達(dá)患者預(yù)后生存要差于miR-370-3p 高表達(dá)的患者。外源性miR-370-3p 模擬物能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞系MG63 的增殖、遷移、侵襲能力，提示miR-370-3p 在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的作用。

FOXM1是叉頭框（forkhead box M1）蛋白家族成員之一，作為轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXM1 參與多重細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控過程，包括細(xì)胞周期過渡、有絲分裂紡錘體完整性的維護(hù)、血管生成、轉(zhuǎn)移、凋亡和DNA 損傷修復(fù)［12］。HU等［13］研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在肝細(xì)胞癌中過度表達(dá)能夠激活下游驅(qū)動(dòng)蛋白4A 導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖。 LIN 等［14］研究表明FOXM1 能夠激活A(yù)MPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬發(fā)生來促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞多西他賽耐藥的發(fā)生。FOXM1 可通過調(diào)控三磷酸腺苷結(jié)合盒家族成員A8（ABCA8）參與骨肉瘤化療耐藥［15］。FOXM1 可能與ABCA8 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合調(diào)控ABCA8 轉(zhuǎn)錄，用FOXM1 抑制劑Thiostrepton處理細(xì)胞或者shRNA 敲低ABCA8 的表達(dá)能夠提高骨肉瘤耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性。FOXM1 還可能通過調(diào)控DNA 修復(fù)基因Rad51 參與骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的化療耐藥［16］。有研究［17］發(fā)現(xiàn)，miR-361-5p 靶向負(fù)性調(diào)控FOXM1 表達(dá)，單獨(dú)沉默F(xiàn)OXM1 增加抗輻射骨肉瘤細(xì)胞株HOS-R 細(xì)胞的放射敏感性，F(xiàn)OXM1 可逆轉(zhuǎn)miR-361-5p 對HOS-R 放射敏感性的促進(jìn)作用。本實(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXM1 在骨肉瘤組織中的表達(dá)較癌旁正常組織中相比明顯升高，干擾FOXM1的表達(dá)能夠明顯抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

通過線性回歸分析37 例患者骨肉瘤組織中miR-370-3p 與FOXM1 的表達(dá)量（骨肉瘤/癌旁正常）變化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 的表達(dá)量與miR-370-3p的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，即為miR-370-3p 的表達(dá)量升高，F(xiàn)OXM1 的表達(dá)量呈下降趨勢，提示miR-370-3p與FOXM1 可能有靶向調(diào)控關(guān)系，隨后通過TargetScan 查找到miR-370-3p 與FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子mRNA 的3’UTR 區(qū)域存在7 個(gè)連續(xù)的互補(bǔ)配對堿基，提示理論上miR-370-3p 能夠與FOXM 轉(zhuǎn)錄因子靶向結(jié)合，miR-370-3pmimic 能夠抑制FOXM1野生型3’UTR 報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光酶活性，但無法抑制FOXM1 突變型報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光酶活性，MG63 細(xì)胞中過表達(dá)miR-370-3p 可以下調(diào)FOXM1 的蛋白表達(dá)。以上提示miR-370-3p 可通過靶向結(jié)合FOXM1 的3’UTR 端來抑制FOXM1 的基因表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63 的遷移、侵襲、增殖。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-370-3p 表達(dá)下降、FOXM1 mRNA 表達(dá)升高。上調(diào)miR-370-3p表達(dá)及抑制FOXM1 表達(dá)的MG63 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均降低。miR-370-3p 可能通過靶向抑制MG63細(xì)胞FOXM1表達(dá)發(fā)揮腫瘤抑制作用。