子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT的表達(dá)變化及其意義

李玉英，趙麗，王蕾，焦今文，袁芳

1 青島大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東青島 266071；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科

子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)宮頸鱗癌）是女性最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，是女性第四大常見(jiàn)癌癥，目前發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年宮頸惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升［1］。免疫治療已成為目前宮頸癌治療的研究熱點(diǎn)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cy‐totoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）抑制劑和程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡受體配體-1（Programmed death-li‐gand1，PD-L1）抑制劑目前已用于黑色素瘤、肺癌、腎癌和霍奇金淋巴瘤［2］等的治療中。CTLA-4 可與CD28 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD80、CD86，抑制CD28 將活化的信號(hào)傳遞給T 細(xì)胞，使T 細(xì)胞不能徹底活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的“免疫逃逸”［3］。僅10%～30 的宮頸鱗癌患者采用CTLA-4、PD-1/PD-L1 免疫治療效果較好。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin do‐main and mucin domain containing molecule 3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸基抑制模體（T-cell immunoglobulin and immuno Tyrosine inhibitory motif（ITIM）domain）是最新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制分子。目前TIM-3、LAG-3 及TIGIT 在宮頸鱗癌中相關(guān)研究報(bào)道較少。我們觀察了宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3和TIGIT的表達(dá)變化，并分析其與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，旨在為宮頸鱗癌的免疫治療提供新靶點(diǎn)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸鱗癌、子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、正常宮頸組織均來(lái)自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2013年3月—2016年8月份存檔的手術(shù)切除或活檢保存的蠟塊標(biāo)本。宮頸鱗癌及CIN 患者均不合并其他類(lèi)型腫瘤，術(shù)前均未接受放化療治療，且臨床資料完整。因?qū)m頸癌行子宮切除且術(shù)后病理證實(shí)為宮頸鱗狀細(xì)胞癌、有完整隨訪資料的鱗癌患者40 例，年齡33～70歲（50.23±7.87），其中腫瘤高分化3 例、中分化23例、低分化14 例；根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Internation‐al Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）2009年分期標(biāo)準(zhǔn)為ⅠA～ⅠB1患者34例，ⅠB2～ⅡA患者6 例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例；浸潤(rùn)肌層程度<1/2患者21 例，≥1/2 患者19 例。子宮頸錐切術(shù)后且術(shù)后病理證實(shí)為CIN 的患者20 例，因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)為子宮平滑肌瘤患者的正常宮頸組織30 例。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，征得患者及其家屬的知情同意、醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 宮頸鱗癌、CIN 及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法。TIM-3、LAG-3抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TIGIT 抗體購(gòu)自美國(guó)abcam 公司，超敏兔及鼠兩分法試劑盒（PV-9001）、DAB 試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。將石蠟切片標(biāo)本于二甲苯及乙醇中脫蠟水化，PBS 浸泡抗原修復(fù)，一抗（TIM-3 抗體、LAG-3抗體及TIGIT抗體）以1∶50濃度滴于標(biāo)本載玻片上，4 ℃過(guò)夜，恢復(fù)室溫培養(yǎng)后滴加二抗，DAB 顯色劑顯色，蘇木素再次復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。TIM-3、LAG-3、TIGIT 主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。細(xì)胞染色強(qiáng)度為無(wú)著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比得分為<5%計(jì)0 分、5%～25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4 分。將細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比的得分乘積為最終半定量分析結(jié)果，乘積0 分計(jì)為細(xì)胞陰性，成績(jī)≥1 分計(jì)為陽(yáng)性。測(cè)算TIM-3、LAG-3、TIGIT的陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.3 資料收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 收集納入者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移等資料。采取電話詢(xún)問(wèn)、短信等方式對(duì)宮頸鱗癌患者進(jìn)行隨訪，患者手術(shù)日期為隨訪起點(diǎn)，死亡為隨訪終點(diǎn)，2020 年1 月為隨訪截止時(shí)間。采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或者是Fisher’s 確切概率法。TIM-3、LAG-3 和TIGIT 表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行單因素生存分析，并繪制生存曲線，采用逐步回歸法建立COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析宮頸鱗癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)率比較 宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.5%（23/40）、65.0%（26/40）、65.0%（26/40）；CIN 組織TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)率分別為25.0%（5/20）、30.0%（6/20）、30.0%（6/20）；正常宮頸組織TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)率分別為3.3%（1/30）、3.3%（1/30）和6.67%（2/30）。與正常宮頸組織比較，頸鱗癌組織、CIN 組織及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)率均升高（P均<0.05）；與CIN 組織比較，宮頸鱗癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT陽(yáng)性表達(dá)率均升高（P均<0.05）。

2.2 不同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 表達(dá)情況比較 同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT表達(dá)情況見(jiàn)表1。TIM-3、TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)與宮頸鱗癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān)（χ2=3.879，5.871；P均<0.05），與患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)情況均無(wú)關(guān)（P均>0.05）。LAG-3 陽(yáng)性表達(dá)與宮頸鱗癌患者各臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)（P均>0.05）。

表1 不同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT表達(dá)情況（例）

2.3 不同TIM-3、LAG-3 表達(dá)的宮頸鱗癌患者的預(yù)后 40 例宮頸鱗癌患者隨訪時(shí)間為1～62 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間30 個(gè)月，TIM-3、LAG-3 陽(yáng)性表達(dá)宮頸鱗癌患者的生存曲線明顯低于陰性表達(dá)者（P均<0.05）。不同TIM-3、LAG-3 表達(dá)的宮頸鱗癌患者的生存曲線見(jiàn)圖1。

圖1 不同TIM-3、LAG-3表達(dá)的宮頸鱗癌患者的生存曲線

2.4 宮頸鱗癌患者預(yù)后的影響因素分析 單因素分析結(jié)果提示，宮頸鱗癌患者的生存時(shí)間與TIM-3陽(yáng)性表達(dá)、LAG-3陽(yáng)性表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)（P均<0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)無(wú)關(guān)（P均>0.05）。COX 多因素回歸分析結(jié)果為，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TIM-3 陽(yáng)性表達(dá)實(shí)影響宮頸鱗癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR分別為4.553，3.979，0.285；95%CI分別為0.994～20.843，1.051～15.064，0.109～0.750；P均<0.05）。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率呈逐年遞增。與手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療方法不同，免疫治療可通過(guò)調(diào)節(jié)或者操縱患者的免疫系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮治療作用［4］，在腫瘤微環(huán)境中，免疫檢查點(diǎn)可以抑制T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)；而免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過(guò)阻斷這些分子，可以從一定程度激活T 細(xì)胞，恢復(fù)其抗腫瘤免疫效能［5］；目前應(yīng)用于臨床的抗PD-1、PD-L1和CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌等應(yīng)用在病理應(yīng)答率和無(wú)復(fù)發(fā)生存期等方面取得顯著的臨床效果［6］，且目前針對(duì)PD-1、PD-L1 等免疫檢查點(diǎn)的治療已經(jīng)應(yīng)用于宮頸癌的治療，但是由于不同患者具有多樣的抗原，相同抗原的一致率較低，以致單藥治療的應(yīng)答率較低，部分患者出現(xiàn)不良反應(yīng)甚至產(chǎn)生獲得性耐藥性。目前對(duì)于轉(zhuǎn)移性宮頸癌免疫治療［7］，已有免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用于臨床，但是隨著免疫相關(guān)不良反應(yīng)事件發(fā)生以及較低的免疫應(yīng)答率，研究者們開(kāi)始尋找新的免疫檢查點(diǎn)。

TIM-3 蛋白是TIM 家族中的主要組員［8］，在免疫抑制反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TIM-3 是由N 端免疫球蛋白可變區(qū)、粘蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞尾部構(gòu)成［9］。其不僅直接表達(dá)于Th1 細(xì)胞，在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor infiltrating leukocytes，TILs）、巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）等分子上廣泛地表達(dá)。表達(dá)于TILs表面TIM-3主要通過(guò)與其配體半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9）結(jié)合調(diào)控免疫細(xì)胞的功能，下調(diào)對(duì)Th1細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)Th1 細(xì)胞凋亡，抑制T 細(xì)胞抗腫瘤活性［10］。TIM-3 參與自身免疫性疾病發(fā)展過(guò)程，且隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，TIM-3 陽(yáng)性表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在艾滋病病毒感染患者中，TIM-3 作為一種免疫受體可以抑制T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)T 細(xì)胞的衰竭。對(duì)TIM-3 的阻斷作為PD-1 和CTLA-4 抑制劑之外新型腫瘤免疫治療策略正在進(jìn)行研究。本研究中，在宮頸鱗癌中TIM-3的陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN組和正常組織，CIN 組高于正常宮頸組，由此結(jié)果分析TIM-3 可能在宮頸鱗癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。我們還分析了TIM-3 與宮頸鱗癌等各種臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)TIM-3陽(yáng)性表達(dá)率主要與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)表明隨著浸潤(rùn)深度的增大，其陽(yáng)性表達(dá)也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。據(jù)TIM-3陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)，可能參與疾病的發(fā)展進(jìn)程。但是TIM-3 在臨床研究中的作用同樣存在相互矛盾之處，食管鱗狀細(xì)胞癌患者TIM-3蛋白的表達(dá)與患者PFS無(wú)明顯相關(guān)性。在本研究結(jié)果中，TIM-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)宮頸鱗癌患者的PFS 顯著短于TIM-3陰性患者，與其在鼻咽癌、肝癌中的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果相一致［11］，表明其在宮頸癌發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)單一因素和多因素的回歸模型分析，TIM-3可成為評(píng)估宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，預(yù)測(cè)其可成為宮頸癌免疫治療的檢查點(diǎn)之一。

LAG-3 是一種由498 個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白［12］，主要表達(dá)于活化T 細(xì)胞（CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞）、NK 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC），與CD4 蛋白具有高度的結(jié)構(gòu)同源性，能夠結(jié)合MHCII 類(lèi)分子，抑制T 細(xì)胞的增殖及活化［13］；大量研究表明，除MHCII類(lèi)分子以外，半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）和α-突觸核蛋白纖維也作為L(zhǎng)AG-3 配體［14］，目前對(duì)于LAG-3 作用機(jī)制尚不清楚，仍然需要大量的數(shù)據(jù)研究。WOO 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在臨床研究中，免疫蛋白LAG-3 與PD-1 在TILs 中共表達(dá)，此結(jié)果為后續(xù)LAG-3 免疫檢查點(diǎn)抑制劑與其他ICIs聯(lián)合應(yīng)用奠定了臨床試驗(yàn)基礎(chǔ)。目前已經(jīng)研究出了針對(duì)兩種蛋白作用途徑的阻斷劑，但是尚未應(yīng)用于臨床。在惡性腫瘤與慢性感染等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均存在T 細(xì)胞的失活與衰竭，PD-1呈高表達(dá)，免疫蛋白LAG-3作為PD-1共抑制受體在惡性腫瘤或慢性感染患者免疫微環(huán)境中T細(xì)胞上高表達(dá)，嚴(yán)重影響患者生存時(shí)間及不良預(yù)后。目前對(duì)于LAG-3 作用機(jī)制尚不清楚，仍然需要大量的數(shù)據(jù)研究。本研究結(jié)果示，在宮頸鱗癌中LAG-3 的陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN 組和正常組織，CIN 組高于正常宮頸組，表明LAG-3在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起促進(jìn)作用。在40例宮頸鱗癌患者樣本中，免疫蛋白LAG-3陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)等無(wú)明顯關(guān)系。K-M生存分析結(jié)果顯示LAG-3 陰性表達(dá)的宮頸鱗患者PFS較LAG-3陽(yáng)性宮頸鱗癌患者PFS生存時(shí)間更長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），預(yù)示LAG-3 可能影響患者生存預(yù)后。多因素結(jié)果分析顯示各臨床病理因素均不是LAG-3 陽(yáng)性表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與DATAR［15］在非小細(xì)胞肺癌中得出的結(jié)論不一致，這可能與選取樣本量不足以及實(shí)驗(yàn)方法等有關(guān)。在未來(lái)的研究中可以在大樣本中進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)論。

TIGIT（又稱(chēng)VSIG9，VSTM3，WUCAM）是TIGIT基因編碼的免疫球蛋白PVR（脊髓灰質(zhì)炎病毒受體）家族成員之一［16］，主要表達(dá)于CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞上，TIGIT 通過(guò)結(jié)合兩個(gè)配體CD115 和CD112 傳遞抑制信號(hào)，發(fā)揮抗腫瘤免疫效［17］。目前TIGIT 信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制上不清楚，一些實(shí)驗(yàn)證明，TIGIT 在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫方面具有抑制作用，正如在免疫檢查點(diǎn)TIM-3 中觀察到的結(jié)果一致，抑制TIGIT 會(huì)加劇自身免疫疾病的發(fā)生。在晚期胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者活化T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的免疫蛋白TIGIT，提示其可作為一種免疫治療策略改善患者生存預(yù)后。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常宮頸、CIN組和宮頸鱗癌患者中，TIGIT蛋白表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TIGIT 可能在宮頸癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用；在40例宮頸鱗癌患者中，TIGIT陽(yáng)性表達(dá)率在肌層浸潤(rùn)深度≥1/2中為84.21%，在肌層浸潤(rùn)深度<1/2患者陽(yáng)性表達(dá)率為47.62%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明浸潤(rùn)深度可能促進(jìn)宮頸鱗癌進(jìn)一步發(fā)展；此對(duì)照分析食管鱗癌組織中的免疫調(diào)節(jié)蛋白TIGIT陽(yáng)性表達(dá)率結(jié)果相一致，可以得出TIGIT蛋白陽(yáng)性表達(dá)與子宮頸鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)等一系列過(guò)程過(guò)程有關(guān)［18］；但是免疫檢查點(diǎn)TIGIT陽(yáng)性表達(dá)與患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)等無(wú)明顯關(guān)系。根據(jù)K-M 生存分析結(jié)果示TIGIT 陽(yáng)性表達(dá)與PFS無(wú)明顯相關(guān)。而在急性髓系白血病患者關(guān)于TIGIT 生存因素分析的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，TIGIT蛋白陰性表達(dá)PFS明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性表達(dá)患者，這與本研究課題的結(jié)果相悖；造成這種差異原因可能是基于不同類(lèi)型實(shí)體腫瘤所處的體內(nèi)免疫調(diào)控微環(huán)境不同，且選擇的檢測(cè)診斷方法也不同以及樣本量大小的差異，有待進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本含量深入研究。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中免疫檢查點(diǎn)TIM-3、LAG-3和TIGIT 高表達(dá)，TIM-3、LAG-3與宮頸鱗癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，TIM-3 陽(yáng)性表達(dá)是影響宮頸鱗癌患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3、TIGIT表達(dá)升高。TIM-3、TIGIT陽(yáng)性表達(dá)與宮頸鱗癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)及患者預(yù)后有關(guān)。TIM-3、LAG-3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。TIM-3、LAG-3 和TIGIT 可能成為宮頸鱗癌的治療靶點(diǎn)的。本研究尚存在納入樣本量較少等不足，后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)探究TIM-3、LAG-3和TIGIT在宮頸癌中的作用機(jī)制。