全外顯子組測(cè)序在9p缺失綜合征診斷中的應(yīng)用

易 薇， 番云華， 劉厚昌， 禹崇飛， 楊必清， 葛世軍， 林克勤， 褚嘉祐， 楊昭慶

（1.云南省德宏州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 芒市 678400；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，云南 昆明 650118）

9p部分單體或9p末端缺失可導(dǎo)致9p缺失綜合征。XY核型的男性9p缺失綜合征患者在臨床上會(huì)表現(xiàn)出男性性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致SRXY4綜合征[1]。XX核型的女性9p缺失綜合征患者國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道，因此9p缺失對(duì)女性子宮、卵巢等生殖系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育造成的影響目前尚不清楚。既往對(duì)9p缺失綜合征的報(bào)道多為成年男性，由于總體上報(bào)道的病例數(shù)不多，且不同病例在臨床表現(xiàn)上呈現(xiàn)出異質(zhì)性，除男性性反轉(zhuǎn)外，目前尚未建立起較為明確的9p缺失綜合征的基因型-表型關(guān)聯(lián)性，其分子病理基礎(chǔ)尚不清楚。鑒定9p缺失綜合征表型相關(guān)的候選基因并探討其表型關(guān)聯(lián)性，對(duì)該病的臨床診治、預(yù)后判定和遺傳咨詢具有重要的意義。本研究采用染色體核型分析和全外顯子組測(cè)序相結(jié)合的方法，分析1例具有子宮發(fā)育不全而無面容異常和智力語言障礙的XX核型的女性9p缺失綜合征患者，以提高臨床對(duì)此類疾病的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

患者，女，19歲，以成年后月經(jīng)未來潮就診?；颊咦栽V有癲癇病史。體格檢查未發(fā)現(xiàn)身高、體質(zhì)量、面容、四肢等存在異常。無語言障礙，無智力障礙，無運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩。B超結(jié)果示幼稚子宮。實(shí)驗(yàn)室檢查示血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶、甲狀腺功能無異常。性激素檢測(cè)示性激素異常，無卵泡成熟：雌二醇20.04 pmol/L，促卵泡成熟激素2.51 IU/L，黃體生成激素1.39 IU/L，泌乳素206.9 mIU/L，孕酮0.94 nmol/L，人絨毛膜促性腺激素<0.10 IU/L。臨床診斷為原發(fā)性閉經(jīng)和原發(fā)性性腺功能減退，經(jīng)激素治療，閉經(jīng)癥狀有所緩解并有持續(xù)性月經(jīng)?；颊叩母改附】禒顩r良好，表型正常，否認(rèn)近親婚配，否認(rèn)家族遺傳病史，否認(rèn)孕期感染病史及放射性物質(zhì)和有毒物質(zhì)接觸史。

1.2 方法

1.2.1 染色體G顯帶核型分析 經(jīng)患者及其父母知情同意，采集患者及其父母外周靜脈血進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，用常規(guī)方法制備染色體，并行G顯帶分析。鏡下計(jì)數(shù) 20個(gè)中期分裂相，并分析5個(gè)核型。染色體核型描述參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2016年的標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行。

1.2.2 全外顯子組測(cè)序 提取患者外周靜脈血基因組DNA，經(jīng)DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接、聚合酶鏈反應(yīng)等流程制備測(cè)序文庫，在NovaSeq 6000高通量測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）上進(jìn)行雙末端150 bp長(zhǎng)度測(cè)序，測(cè)序深度為100×。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過濾、質(zhì)控后與UCSC參考基因組（hg19，2009）進(jìn)行比對(duì)，并采用美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）數(shù)據(jù)和疾病相關(guān)的拷貝數(shù)變異（copy number variation disease，CNVD）數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和注釋，確定突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因信息、功能信息及有害性等?？截悢?shù)變異（copy number variation，CNV）結(jié)果的判定規(guī)則為：0（log2值<-1.1）、1（log2值為-1.1～-0.4）、2（log2值-0.4～0.3）、3（log2值為0.3～0.7）。其中0、1、2、3分別表示0、1、2、3個(gè)拷貝（人類中正常為2）。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

本例患者G顯帶的核型為46，XX，del（9）（p23），代表性核型見圖1。其母親的染色體核型為46，XX；父親的染色體核型為46，XY。

圖1 本例患者的染色體核型圖

2.2 全外顯子組測(cè)序結(jié)果

全外顯子組測(cè)序CNV分析結(jié)果顯示，本例患者9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區(qū)域存在單拷貝缺失，缺失片段長(zhǎng)度約為13.0 Mb，該缺失區(qū)域覆蓋了61個(gè)已知基因，包括DOCK8、FOXD4、KANK1、DMRT等多個(gè)與智力發(fā)育相關(guān)或性發(fā)育異常相關(guān)的基因。在全外顯子組水平上未發(fā)現(xiàn)與臨床表型相關(guān)的其他致病性CNV、堿基突變、插入和缺失。見圖2。

圖2 患者各染色體CNV分布圖

2.3 臨床診斷

G顯帶核型分析結(jié)果提示本例患者9號(hào)染色體短臂末端缺失，經(jīng)全外顯子組測(cè)序分析提示該缺失區(qū)域?yàn)?p24.3-p23，缺失片段長(zhǎng)度約為13.0 Mb，覆蓋了61個(gè)已知基因。該缺失區(qū)域與9p缺失綜合征的關(guān)鍵區(qū)域9p22.2-p23有部分重疊，屬于致病性CNV。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、超聲及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，包括原發(fā)性閉經(jīng)、幼稚子宮、性激素水平異常和癲癇的特征，診斷為9p缺失綜合征。

3 討論

9p缺失綜合征于1973年首次被報(bào)道，典型的臨床表現(xiàn)有三角頭畸形、面部異常、智力低下、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，少數(shù)患者可伴有癲癇、先天性心臟病等。男性9p缺失綜合征患者可表現(xiàn)出外生殖器發(fā)育異常、性反轉(zhuǎn)等[3]。本研究采用染色體G顯帶核型分析和全外顯子組測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)1例原發(fā)性閉經(jīng)患者進(jìn)行分析，結(jié)果顯示患者染色體核型為46，XX，del（9）（p23）。采用全外顯子組測(cè)序檢測(cè)CNV，精確定位了染色體斷裂位置和缺失基因，本例患者在9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區(qū)域存在13.0 Mb單拷貝缺失，缺失區(qū)域涉及61個(gè)已知基因。從臨床表現(xiàn)上看，本例女性9p末端缺失患者除原發(fā)性閉經(jīng)、幼稚子宮、性激素異常、癲癇等癥狀外，并未表現(xiàn)出三角頭畸形、智力語言障礙等9p缺失綜合征典型的臨床癥狀，在國(guó)內(nèi)外尚未見有相似的病例報(bào)道。本研究結(jié)果為9p缺失綜合征臨床表型異質(zhì)性提供了新的參考數(shù)據(jù)。

9p末端缺可遺傳自親代一方平衡易位的染色體，母系、父系遺傳均有報(bào)道，也可能由新發(fā)染色體突變引起。本研究結(jié)果顯示，患者的染色體核型為46，XX，del（9）（p23），其父母的染色體核型均未見異常，表明本例患者是新發(fā)的9p末端缺失。既往有研究發(fā)現(xiàn)，9p缺失綜合征的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)?.5 Mb長(zhǎng)度的9p22.2-p23區(qū)域[4]。

不同9p缺失綜合征患者的臨床表型變異較大，可能與9p缺失的位置、片段大小或是否合并了其他染色體異常等因素有關(guān)[5]。有研究結(jié)果顯示，1例男性患兒在9p24.3-p23（271 257～12 048 612）區(qū)域存在11.78 Mb單拷貝缺失，缺失區(qū)域與本例患者有較多重疊，該例患兒表現(xiàn)出典型的三角頭畸形和智力低下[6]。ONESIMO等[7]報(bào)道了1例9pter-p24.1末端小片段缺失的男性患者，主要表現(xiàn)出特殊面容、癲癇、性腺發(fā)育不全等。FREDETTE等[8]報(bào)道了1例46，XY性腺發(fā)育不全患兒，其合并9p24.3-p23缺失和9p23-p21.2重復(fù)，體格檢查發(fā)現(xiàn)有女性化外生殖器和子宮。AL ACHKAR等[9]報(bào)道了1例9p24.2-p22部分三體合并9pter-p24.2部分單體的女性患者，其表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、特殊面容、原發(fā)性閉經(jīng)等特征。本例患者缺失了9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區(qū)域，與9p缺失綜合征的關(guān)鍵區(qū)域9p22.2-p23有部分重疊，該缺失區(qū)域?yàn)橹虏⌒訡NV[10]。因此，本例患者的表型也受9p缺失綜合征關(guān)鍵缺失區(qū)域的影響，從而表現(xiàn)出與既往報(bào)道的9p缺失綜合征相似的臨床表現(xiàn)，包括原發(fā)性閉經(jīng)、幼稚子宮、性激素水平異常和癲癇等。然而，本例患者并未表現(xiàn)出三角頭畸形、智力語言障礙等9p缺失綜合征典型的臨床特征，這可能與不同病例之間缺失片段差異有關(guān)，也可能與性別因素有關(guān)。

盡管染色體顯帶等細(xì)胞遺傳學(xué)分析為診斷9p缺失綜合征提供了直觀、直接的依據(jù)，但臨床對(duì)缺失區(qū)域的基因型與臨床表型的關(guān)聯(lián)性和相關(guān)機(jī)制仍然知之甚少。本研究采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)確定了患者9p24.3-p23缺失區(qū)域覆蓋了DMRT1、DMRT3、DMRT2、DOCK8、KANK1、FOXD4等多個(gè)與9p缺失綜合征表型密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，且在染色體其他區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)其他致病性CNV、堿基插入和缺失。9p末端9p24.3上的DMRT（DMRTl、DMRT2、DMRT3）是維持男性睪丸分化所必需的基因。男性9p末端缺失可導(dǎo)致DMRT1基因單倍劑量不足，引起男性性反轉(zhuǎn)[11]。DMRT基因在女性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用目前尚不明確。有研究結(jié)果顯示，DMRT1基因在人類女性胚胎的卵母細(xì)胞中有表達(dá)，其缺失可能與女性卵巢早衰有關(guān)，可引起育齡女性原發(fā)性不孕[12-13]。因此，9p24.3-p23缺失導(dǎo)致DMRT1基因單倍劑量不足可能是導(dǎo)致本例患者出現(xiàn)子宮發(fā)育不良、原發(fā)性閉經(jīng)、性激素異常的主要原因。同時(shí)，DOCK8、FOXD4、KANK1等基因與智力發(fā)育相關(guān)，DOCK8基因缺失可引起智力低下和癲癇[7]，F(xiàn)OXD4基因缺失可能導(dǎo)致智力低下或語言障礙，而KANK1基因缺失可導(dǎo)致家族性腦癱[14]。因此，DOCK8基因缺失可能是本例患者表現(xiàn)出癲癇的主要原因，但本例患者并未觀察到智力障礙，原因可能是不同患者缺失區(qū)域所涉及的DOCK8等智力發(fā)育相關(guān)基因及其附近多個(gè)基因的片段大小不同，對(duì)DOCK8基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的綜合作用，從而導(dǎo)致不同的9p缺失綜合征患者在智力發(fā)育方面表現(xiàn)出較大的差異。此外，有研究結(jié)果表明，位于9p22.3區(qū)域的CERl基因是9p缺失綜合征患者三角頭畸形的關(guān)鍵基因[15]。本例患者9p24.3-p23缺失片段并未覆蓋CERl基因，這可能是本例患者未表現(xiàn)出三角頭畸形的原因。本研究結(jié)果為揭示CER1基因型和表型的關(guān)聯(lián)性提供了更多的參考依據(jù)。

綜上所述，9p末端缺失導(dǎo)致DMRT1基因單倍劑量不足可能是導(dǎo)致本例患者幼稚子宮、原發(fā)性閉經(jīng)的主要致病因素。本研究為原發(fā)性閉經(jīng)、性發(fā)育異常和染色體病的臨床診斷提供了更多線索，進(jìn)一步揭示了9p缺失綜合征的臨床病理特征。由于9p缺失綜合征較為罕見且具有表型異質(zhì)性，通過更多病例的收集和分析將有助于明確DMRT1等基因在女性子宮及其他泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育中的作用和機(jī)制，為該病的診療和遺傳咨詢提供更多的參考依據(jù)。