流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)核分枝桿菌利福平異質(zhì)性耐藥可行性分析

李 華， 王偉亮， 謝 貝， 楊 瑜， 孟繁榮， 王 楠， 劉志輝， 張言斌

（1.廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所，廣東 廣州 510095；2.佛山市第四人民醫(yī)院結(jié)核病防治科，廣東 佛山 528000；3.廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科，廣東 廣州 510095）

耐藥結(jié)核病給結(jié)核病的防治工作帶來了極大的挑戰(zhàn)，世界衛(wèi)生組織在2020年全球結(jié)核年報中指出，2019年全球估算新發(fā)利福平（rifampicin，RFP）耐藥結(jié)核病病例46.5萬例，其中78%為耐多藥結(jié)核病，有18.2萬例患者死于耐多藥結(jié)核病[1]。結(jié)核異質(zhì)性耐藥是指在同一樣本中同時存在對藥物敏感和耐藥的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。快速、靈敏、特異地檢測MTB異質(zhì)性耐藥可有針對性地指導(dǎo)臨床用藥，大大提高結(jié)核病的治愈率。目前，應(yīng)用于結(jié)核異質(zhì)性耐藥檢測的技術(shù)包括表型法和基因法。表型法檢測大約需要3～4周，下一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）和限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）可發(fā)現(xiàn)MTB菌群基因序列的不一致，從而揭示MTB菌群的異質(zhì)性[2-6]，但該方法只能檢測與表型明確相關(guān)的耐藥基因突變[7-8]。

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）可用于白念珠菌、MTB、金黃色葡萄球菌等微生物的藥物敏感性檢測[9-12]，該方法基于表型檢測細(xì)菌的藥物敏感性，具有高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)研究證實(shí)了FCM可用于檢測傷寒沙門菌和酵母細(xì)胞的異質(zhì)性[13-14]。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，基于熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetae，F(xiàn)DA）或碘化丙錠的FCM在MTB RFP藥物敏感性檢測中具有較高的檢測效率和效能[15]。本研究以廣州市胸科醫(yī)院MTB菌株庫為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究基于FDA的FCM檢測RFP異質(zhì)性耐藥MTB樣本RFP耐藥菌比例的可行性，評估FCM在耐RFP MTB異質(zhì)菌液樣本檢測中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株均為廣州市胸科醫(yī)院“廣州地區(qū)分枝桿菌菌種保藏庫”保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；BACspreader 1100細(xì)菌超聲分散儀（廣東體必康生物科技有限公司）；Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基、Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基、OADC（美國BD公司），F(xiàn)DA（美國LIFE公司），RFP（美國SIGMA公司）。

1.2.2 菌液制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法從生物樣本庫中挑選RFP耐藥和敏感MTB臨床分離株各100株，復(fù)蘇培養(yǎng)。挑選生長良好的MTB單菌落，將全敏感MTB接種于7H10固體培養(yǎng)基（10%OADC），耐藥RFP MTB接種于含1 μg/mL RFP的7H10固體培養(yǎng)基（10% OADC），培養(yǎng)3代，并進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)。挑選生長狀況良好的MTB，刮取菌落至7H9培養(yǎng)液（10%OADC），用細(xì)菌超聲分散儀配置成1麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙骸ｋS機(jī)選擇1對RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株，按RFP耐藥MTB比例為0%、25%、50%、75%和100%進(jìn)行混合，配制成RFP異質(zhì)性耐藥MTB混懸液，共30組。所有活菌相關(guān)操作均在生物安全柜中進(jìn)行。

1.2.3 菌液的RFP處理 充分混勻菌液，移取1 800 μL菌液于無菌試管中，分別加入濃度為0、125、250、500和1 000 μg/mL的RFP工作液（用7H9培養(yǎng)液稀釋）200 μL，充分混勻，使RFP終濃度分別為0、12.5、25、50和100 μg/mL，置于37 ℃恒溫箱中孵育，分別在用RFP處理的第3、7和10天后行FDA染色。異質(zhì)菌液用50 μg/mL的RFP作用10和14 d后進(jìn)行FDA染色。

1.2.4 菌液的FDA染色和FCM檢測 取1 000 μL待檢菌液于無菌試管中，15 000×g離心10 min，去掉上清，加入1 000 μL 0.9%NaCl溶液，用超聲分散儀分散，取300 μL菌液于流式細(xì)胞儀上樣管中，加入300 μL FDA工作液（0.5 μg/mL，磷酸鹽緩沖液配置），混勻，避光染色30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測，記錄其平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）值。

1.2.5 RFP異質(zhì)性耐藥檢測藥物處理濃度和作用時間的確定 計(jì)算各處理組的敏感指數(shù)（實(shí)驗(yàn)管MFI/對照管MFI）。為了檢測到異質(zhì)性菌液中最低混合比的耐藥菌，理想的藥物處理濃度和作用時間應(yīng)既不影響混合菌液樣本中微量耐RFP MTB臨床分離株的生長，又能使混合菌液樣本中RFP敏感MTB臨床分離株的敏感指數(shù)最低，即背景信號降到最低，此時耐RFP MTB臨床分離株和RFP敏感MTB臨床分離株染色的敏感指數(shù)差異最大，檢測靈敏度最高。分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株3、7 和10 d后，比較不同處理時間FDA染色敏感指數(shù)間的差異，確定最佳藥物處理時間。通過比較MTB臨床分離株經(jīng)12.5 、25 、50和100 μg/mL的RFP處理10 d后的FDA染色敏感指數(shù)間的差異，確定最佳藥物處理濃度。

1.2.6 比例法藥物敏感性試驗(yàn) 按照《實(shí)驗(yàn)結(jié)核病學(xué)》中“結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)”操作方法進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)[16]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，多組比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價不同比例異質(zhì)菌液的敏感指數(shù)界值和檢測性能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥的藥物處理濃度和作用時間

分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB臨床分離株3、7和10 d，結(jié)果顯示，不同作用時間FDA染色的敏感指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株10 d后，不同藥物濃度處理組FDA染色的敏感指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥的藥物處理濃度和作用時間分析

2.2 基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥的性能

用50 μg/mL RFP作用10、14 d后，不同比例RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本FDA染色的敏感指數(shù)見表1。用50 μg/mL RFP作用10、14 d，基于FDA的FCM對含有0% RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本和含有25%及以上RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本具有較高的鑒別效能；對含有25%RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本和100% RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本也具有較高的鑒別效能；對其他比例RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本之間的鑒別效能較低。見表2、圖2、圖3。

表1 50 μg/mL RFP作用不同比例RFP耐藥MTB異質(zhì)菌液樣本10、14 d后FDA染色敏感指數(shù)

表2 RFP異質(zhì)性耐藥MTB經(jīng)50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指數(shù)的ROC曲線分析結(jié)果

圖2 RFP異質(zhì)性耐藥MTB經(jīng)50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指數(shù)的ROC曲線

圖3 30組RFP異質(zhì)性耐藥MTB混懸液經(jīng)50 μg/mL RFP處理后FDA染色敏感指數(shù)的分布

3 討論

結(jié)核病異質(zhì)性耐藥的本質(zhì)是致病MTB為藥物敏感菌群和耐藥菌群的混合，當(dāng)患者感染異質(zhì)性耐藥MTB時，如果根據(jù)其感染異質(zhì)性耐藥MTB中耐藥MTB和敏感MTB的比例，制定個性化的治療方案[17]，可大大提高該類結(jié)核病治療的成功率。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，基于FDA染色的FCM能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定MTB的RFP敏感性，這為應(yīng)用FCM檢測MTB異質(zhì)性耐藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[15]。

基于FDA的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥的本質(zhì)是通過染料監(jiān)測細(xì)菌在藥物處理后的活力。FDA是一種具有細(xì)胞膜透性的疏水熒光素衍生物，其進(jìn)入細(xì)胞后可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化水解生成發(fā)綠色熒光的熒光素，不具有完整細(xì)胞膜或新陳代謝活性弱的細(xì)胞會因酯酶失活而降低水解FDA的能力。為了確認(rèn)基于FDA的FCM在MTB RFP異質(zhì)性耐藥檢測中合適的RFP處理濃度和作用時間，本研究對不同RFP處理濃度作用不同時間后，MTB RFP敏感或耐藥臨床分離株經(jīng)FDA染色后的敏感指數(shù)進(jìn)行了差異性分析，結(jié)果顯示，分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株3、7和10 d后，3 d處理組、7 d處理組和10 d處理組之間FDA染色的敏感指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），提示RFP敏感MTB臨床分離株經(jīng)RFP處理的時間越長，其活力越差，基于FDA染色的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥的藥物處理時間可以選擇10 d或更長；分別用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP處理RFP敏感MTB臨床分離株和耐RFP MTB臨床分離株10 d后，不同藥物濃度處理組之間FDA染色的敏感指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但用100 μg/mL的RFP處理后，耐RFP MTB臨床分離株敏感指數(shù)明顯低于用50 μg/mL RFP處理的敏感指數(shù)，提示用100 μg/mL RFP處理對耐藥MTB的活力有影響，基于FDA染色的FCM檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥較優(yōu)的RFP處理濃度為50 μg/mL。

本研究結(jié)果顯示，基于FDA的FCM在檢測MTB RFP異質(zhì)性耐藥時，較合適的藥物處理?xiàng)l件是50 μg/mL RFP處理10 d，既不影響異質(zhì)菌液樣本中RFP耐藥MTB的生長，又可使樣本中RFP敏感MTB的敏感指數(shù)最低。本研究摸索實(shí)驗(yàn)的最長時間是10 d，不排除增加時間后會使RFP敏感MTB臨床分離株敏感指數(shù)下降到更低，而耐RFP MTB則不受影響，故在后續(xù)RFP異質(zhì)性耐藥檢測中增加了處理14 d的研究。我們用基于FDA的FCM檢測30組耐RFP MTB所占比例分別為0%、25%、50%、75%和100%的MTB RFP異質(zhì)性耐藥菌液樣本，通過ROC曲線分析其檢測不同比例MTB RFP異質(zhì)性耐藥菌液的敏感指數(shù)界值和檢測效能，結(jié)果顯示，50 μg/mL RFP處理10 d時，基于FDA的FCM在MTB RFP異質(zhì)性耐藥檢測中鑒別含0%、25%和100% RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本的敏感指數(shù)界值分別為0.48和0.83，敏感性分別為96.2%和86.7%，特異性分別為96.7%和83.3%；處理14 d時，該方法鑒別含0%、25%和100% RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本的敏感指數(shù)界值分別為0.37和0.77，敏感性分別為96.7%和96.7%，特異性分別為93.3%和86.7%，提示50 μg/mL RFP處理10和14 d時，基于FDA的FCM均可準(zhǔn)確區(qū)分含0%、25%和100%RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本，且處理14 d的檢測性能略優(yōu)于處理10 d，耗時與比例法（3～4周）相比大大減少。在指導(dǎo)臨床用藥方面，當(dāng)異質(zhì)樣本中RFP耐藥MTB比例為0%～25%時，說明樣本中耐藥菌比例較低，敏感菌比例較高，如果在治療早期加入RFP，或可明顯加快痰液樣本病原菌轉(zhuǎn)陰速度，縮短治療時間。

本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)嘗試評估了基于PI的FCM用于MTB RFP異質(zhì)性耐藥檢測的效能，該方法無法用于MTB RFP異質(zhì)性耐藥樣本的檢測，可能原因?yàn)椴煌腞FP耐藥臨床分離株之間活力差異較大，經(jīng)藥物處理后PI染色的MFI值及敏感指數(shù)差異較大，導(dǎo)致相同比例下，含有不同耐RFP MTB臨床分離株的異質(zhì)菌液樣本經(jīng)PI染色所得敏感指數(shù)變異較大，無法分析得到統(tǒng)一的界值用于檢測。截至文章撰寫之日，尚未見該方法在MTB異質(zhì)性耐藥檢測方面的其他研究報道。與比例法相比，F(xiàn)CM可檢測單個粒子的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)DA可不依賴于細(xì)菌的增殖檢測細(xì)菌活力，因而理論上基于FDA的FCM在異質(zhì)性耐藥檢測方面具有快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，這對于慢生長菌的異質(zhì)性耐藥檢測意義重大[15，18]。DE BOER等[7]發(fā)現(xiàn)，RFLP等基因型檢測技術(shù)能檢測出混合比例為1∶9的異質(zhì)性菌液，但只能檢測與表型明確相關(guān)的耐藥基因突變，無法識別未明確的耐藥基因，準(zhǔn)確率較低。因此，與基因型檢測相比，基于FDA的FCM是基于表型的檢測方法，能避開基因型異質(zhì)性耐藥檢測存在的耐藥基因突變位點(diǎn)不明、耐藥基因突變與表型不符等問題[19]，檢測的準(zhǔn)確性較基因檢測高。本研究中基于FDA的FCM可在10 d內(nèi)準(zhǔn)確區(qū)分含0%、25%和100%RFP耐藥MTB的異質(zhì)菌液樣本，耗時遠(yuǎn)低于比例法，但是依然不夠理想?？赡茉?yàn)镕DA是細(xì)胞內(nèi)酯酶依賴的熒光素，藥物作用后酯酶的失活需要一定的時間。因此，在FCM法檢測細(xì)菌異質(zhì)性耐藥的研究中，尋找一種可靈敏指示細(xì)胞活力的染料將有助于縮短檢測所用的時間，提高檢測的靈敏度。