液體培養(yǎng)基硝酸還原酶試驗快速檢測臨床常用抗結(jié)核藥物最小抑菌濃度和臨界濃度效果評價

杜晶輝， 黃自坤， 劉 旻， 龔菁菁， 王 丹， 劉基波， 劉 旭

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心檢驗科，天津 300193；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心感染疾病科，天津 300193）

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的感染性疾病。對利福平和異煙肼耐藥的多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（multidrug resistant-Mycobacterium tuberculosis，MDR-MTB）引起的耐藥問題日益嚴重，隨著廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌（extensively drug-resistantMycobacterium tuberculosis，XDRMTB）的出現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐藥問題已經(jīng)成為全球性的健康問題，并使世界衛(wèi)生組織結(jié)核病控制計劃的實施受到限制[1]。XDR-MTB是指除MDR-MTB外對任何氟喹諾酮類藥物和3種二線注射藥物（卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中至少1種耐藥的MTB。全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告最新數(shù)據(jù)表明，中國肺結(jié)核患者中，耐藥結(jié)核病、多重耐藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的發(fā)生率分別為38.25%、8.32%和0.68%[2]。因此，快速、準確的藥物敏感性試驗結(jié)果對及時調(diào)整治療策略，最大程度地減少耐藥菌株的出現(xiàn)非常關(guān)鍵。

目前，廣泛使用的MTB體外藥物敏感性試驗的標準方法是瓊脂比例法（agar proportion method，APM）和絕對濃度法。這2種方法需要在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原，較費時費力，不能滿足臨床的需求。雖然分子線性探針技術(shù)和MGIT 960法可快速檢測MTB的耐藥性[3-4]，但由于成本高，且需要復雜的基礎(chǔ)設(shè)施，在大多數(shù)發(fā)展中國家無法普及。資源有限的醫(yī)療機構(gòu)迫切需要準確、快速、低成本的MTB體外藥物敏感性試驗方法。

2011年，世界衛(wèi)生組織推薦采用硝酸還原酶試驗（nitrate reductase assay，NRA）篩查疑似MDR-MTB感染患者，NRA比常規(guī)APM更快捷，較MGIT 960法和分子線性探針技術(shù)成本低[5]。NRA通常是在傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)基進行[6-7]，也可在液體培養(yǎng)基中進行[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用液體培養(yǎng)基的NRA可快速檢測MTB對利福平和異煙肼等一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，結(jié)果可靠且成本低[9]。目前，采用液體培養(yǎng)基NRA檢測MTB對二線抗結(jié)核藥物耐藥性的研究較少。本研究通過多中心數(shù)據(jù)，分析液體培養(yǎng)基NRA快速檢測臨床分離MDR-MTB和XDRMTB菌株對利福平、異煙肼、氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素的耐藥性的性能。

1 材料和方法

1.1 研究對象

參與研究的實驗室包括天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科、江西省胸科醫(yī)院結(jié)核病參考實驗室、昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院檢驗科和上海市第一人民醫(yī)院寶山分院臨床微生物學實驗室。收集4個實驗室2009年1月—2011年12月臨床分離MTB菌株，從中隨機選取730株（4個實驗室分別為158、119、253、200株）進行檢測。

本研究分為3個階段進行。第1階段確定每種藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）范圍，共對206株臨床分離MTB[108株MDR-MTB（4個實驗室分別為23、18、37、30株）、20株完全敏感菌株（4個實驗室各5株）、78株對至少1種受試藥物耐藥的非MDR-MTB菌株（4個實驗室分別為16、12、27、23株）]進行檢測，質(zhì)控菌株MTB H37Rv菌株（ATCC 27294）購自美國菌種保藏中心。第2階段根據(jù)第1階段確定的MIC，每種藥物選取3個測試濃度（MIC和MIC上下各1個濃度梯度），在4個實驗室對50株MTB菌株[26株MDR-MTB（包括8株XDR-MTB），6株完全敏感菌株，18株對至少1種受試藥物耐藥的非MDR-MTB]進行盲測，將檢測結(jié)果與APM或MGIT 960法結(jié)果進行比較。第3階段，采用第2階段確定的臨界濃度檢測730株MTB，比較3種方法藥物敏感性試驗結(jié)果。所有臨床分離菌株均在羅氏培養(yǎng)基上進行新鮮傳代培養(yǎng)，所有實驗室檢測人員均具有NRA的操作經(jīng)驗，或曾接受過相關(guān)培訓。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基NRA法 液體培養(yǎng)基NRA法按照ADIKARAM等[8]的描述進行。使用Middlebrook 7H9肉湯基質(zhì)和0.31%甘油、10%油性白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶（美國BD公司），以及0.1%硝酸鹽（美國Sigma公司）制備NRA液體培養(yǎng)基。第1階段使用的藥物濃度為：利福平4～0.125 mg/L、異煙肼0.8～0.025 mg/L、氧氟沙星8～0.25 mg/L、阿米卡星8～0.25 mg/L、卡那霉素20～0.62 mg/L、卷曲霉素20～0.62 mg/L。第2階段使用的藥物濃度為：利福平0.5、1和2 mg/L，異煙肼0.1、0.2和0.4 mg/L，氧氟沙星1、2和4 mg/L，阿米卡星2、4和8 mg/L，卡那霉素2.5、5和10 mg/L，卷曲霉素2.5、5和10 mg/L。第3階段使用的藥物濃度為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、阿米卡星2 mg/L、卡那霉素5 mg /L、卷曲霉素2.5 mg/L。每種含藥物的培養(yǎng)管均接種100 μL 1.0麥氏濁度菌懸液，對照培養(yǎng)管中接種100 μL 1∶10稀釋的相同的菌懸液，將培養(yǎng)管置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育。7 d后，向其中1支對照培養(yǎng)管中加入0.5 mL新鮮配制的Griess顯色試劑（將50%鹽酸、0.2%磺胺、0.1%N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽按照1∶2∶2的比例混勻）。如果在對照培養(yǎng)管中觀察到顏色變化，則將Griess顯色試劑添加到所有含藥物的培養(yǎng)管中；如果沒有顏色變化，則將培養(yǎng)管重新放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，在第14天重復該過程，如果需要，在第21天重復該過程。如果含藥培養(yǎng)管中所顯示的粉紅色與1∶10稀釋對照培養(yǎng)管中的粉紅色相同或顏色更深，則認為該菌株具有抗性；如果1∶10稀釋對照培養(yǎng)管顏色發(fā)生變化，而含藥培養(yǎng)管在孵育21 d后顏色仍未發(fā)生變化，則認為該菌株對抗菌藥物敏感。以從高濃度至低濃度6個藥物濃度含藥培養(yǎng)管中無顏色變化的培養(yǎng)管的藥物濃度為MIC。在4個實驗室中確定每種藥物的臨界濃度與參考方法進行比較的結(jié)果，將確定的臨界濃度作為每種藥物判斷敏感或耐藥的折點。在更換藥物和試劑批號時，應使用1株完全敏感菌株和1株MDR-MTB菌株進行質(zhì)控試驗，以驗證培養(yǎng)基是否正確，配置試驗操作是否正確。細菌污染可能會導致假陽性結(jié)果，為確保培養(yǎng)基中沒有污染，使用液體培養(yǎng)基前，在綿羊血瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，以排除其他細菌生長。NRA的結(jié)果解讀應是在未知參考方法藥物敏感性試驗結(jié)果的情況下進行，避免干擾對顏色的主觀判讀。

1.2.2 APM體外藥物敏感性試驗 用羅氏培養(yǎng)斜面上的MTB菌落制備菌懸液，通過APM進行間接藥物敏感性試驗。根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南推薦的標準比例法，在7H10瓊脂上進行APM檢測，臨界濃度為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、卡那霉素5 mg/L、卷曲霉素10 mg/L[10]。

1.2.3 MGIT 960法藥物敏感性試驗 世界衛(wèi)生組織建議MGIT 960法僅適用于阿米卡星藥物敏感性試驗，本研究根據(jù)說明書要求進行檢測，阿米卡星的MGIT 960法臨界濃度為1 μg/mL。

1.2.4 差異的解決 如果NRA與APM或MGIT 960法結(jié)果不一致，則進行重復檢測。如重復檢測后結(jié)果仍不一致，則對每種特定藥物的耐藥基因進行測序，重新計算NRA對每種藥物的靈敏度和特異性，并定義為“修正后”。

1.2.5 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和測序 對于NRA與APM或MGIT 960法不一致的結(jié)果，參考文獻[11-12]對已知的耐藥基因rpoB（利福平）；inhA、katG、ahpC（異煙肼）；gyrA、gyrB（氧氟沙星）；rrs（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）；eis（卡那霉素）和tlyA（卷曲霉素）進行測序。使用十六烷基三甲基溴化銨氯化鈉溶液進行核酸提取[13]。基因測序由北京基因組研究所完成，使用Clonemanager軟件進行測序結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。以APM或MGIT 960法為參考方法評估NRA法的敏感性、特異性和準確性，計算菌株NRA檢測陽性所需的時間。

2 結(jié)果

2.1 第1階段結(jié)果

用液體培養(yǎng)基NRA檢測了206株臨床分離的MTB，結(jié)果顯示NRA法與APM或MGIT 960法MIC具有很高的一致性。NRA檢測6種藥物的MIC分別為：利福平1 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、氧氟沙星2 mg/L、阿米卡星4 mg/L、卷曲霉素5 mg/L、卡那霉素5 mg/L。

（1）利福平耐藥性檢測有3個不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為0.5 mg/L，判定為敏感；而APM法判定為耐藥。rpoB基因測序結(jié)果表明，有2株分離株存在與利福平耐藥性相關(guān)的突變位點（S531L、D516Y）。因此，這2株菌株被判定為耐藥。本研究根據(jù)測序結(jié)果重新計算了修正后NRA的敏感性、特異性和準確性，得到NRA檢測利福平耐藥性的敏感性和特異性分別為98.7%和100.0%。見表1。

表1 第1階段藥物敏感性試驗結(jié)果

（2）異煙肼耐藥性檢測有4個不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為0.1 mg/L，判定為敏感；而APM法判定為耐藥，katG、inhA和ahpC測序結(jié)果顯示，有2株分離株基因組中僅含有katG突變，其相應的氨基酸突變?yōu)镾315T。因此，修正后的NRA檢測異煙肼耐藥性的敏感性和特異性分別為98.8%和100.0%。見表1。

（3）氧氟沙星耐藥性檢測結(jié)果顯示，NRA與APM法的一致性為100%。

（4）阿米卡星耐藥性檢測有2個不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為2 mg/L，判定為敏感；而MGIT 960法判定為耐藥。rrs基因測序結(jié)果顯示，有2株分離株基因組中含有與阿米卡星耐藥相關(guān)的突變（A1401G）。因此，修正后的NRA檢測阿米卡星耐藥性的敏感性和特異性分別為95.2%和100.0%。見表1。

（5）卡那霉素耐藥性檢測有1個不一致結(jié)果。NRA得到的MIC值為2.5 mg/L，判定為敏感；而APM判定為耐藥；rrs或eis測序結(jié)果顯示，rrs和eis基因組中沒有任何突變。

（6）卷曲霉素耐藥性檢測有2個不一致的結(jié)果。NRA得到的MIC值為2.5 mg/L，判定為敏感；而APM判定為耐藥，rrs基因測序結(jié)果表明，其中1株菌株的基因組中含有A1401G突變。因此，修正后的NRA檢測卷曲霉素耐藥性的敏感性和特異性分別為96.4%和100.0%。見表1。

2.2 第2階段結(jié)果

利福平臨界濃度為1 mg/L時結(jié)果最一致，總準確性為98.0%；異煙肼臨界濃度為0.2 mg/L時結(jié)果最一致，總準確度為98.5%；氧氟沙星臨界濃度為2 mg/L時結(jié)果最一致，總準確性為98.5%；阿米卡星臨界濃度為2 mg/L時結(jié)果最一致，總準確性為97.5%；卡那霉素臨界濃度為5 mg/L時結(jié)果最一致，總準確性為97.5%；卷曲霉素臨界濃度為2.5 mg/L時結(jié)果最一致，總準確性為97.0%；見表2。4個實驗室檢測6種藥物的敏感性、特異性、準確性見表3。

表2 確定6種藥物臨界濃度

表3 4個實驗室檢測6種藥物的敏感性、特異性和準確性

2.3 第3階段結(jié)果

采用第2階段確定的臨界濃度檢測730株MTB臨床分離株。4個實驗室采用液體培養(yǎng)基NRA法與參考方法進行體外藥物敏感性試驗結(jié)果。結(jié)果顯示，利福平耐藥性檢測準確性為97.0%～100.0%，總準確性為98.4%；異煙肼準確性為96.8%～99.2%，總準確性為98.1%；氧氟沙星準確性為98%～100%，總準確性為98.8%；阿米卡星準確性為96.8%～98.5%，總準確性為97.9%；卡那霉素準確性為96.4%～99.5%，總準確性為97.9%；卷曲霉素準確性為96.8%～100.0%，總準確性為98.2%；見表5。NRA、APM和MGIT 960法結(jié)果不一致的菌株的測序結(jié)果見表6。

表4 4個實驗室液體培養(yǎng)基NRA與參考方法藥物敏感性試驗結(jié)果 株

2.4 樣本周轉(zhuǎn)時間（turn-around time，TAT）及污染率

NRA檢測的中位時間為7 d，APM為21 d（P<0.001）。在第3階段，采用NRA，76.2%（556/730）的MTB 7 d便可得到結(jié)果；采用APM，5.2%（38/730）的MTB 21 d才能得到結(jié)果。液體培養(yǎng)基沒有細菌或真菌的污染，7H10瓊脂中有5個樣品污染，MGIT 960法培養(yǎng)基有8個樣品污染。

表5 4個實驗室液體培養(yǎng)基NRA檢測6種藥物的敏感性、特異性及準確性 %

表6 第3階段藥物敏感性試驗結(jié)果不一致菌株基因測序結(jié)果

3 討論

本研究的目的是確定液體培養(yǎng)基NRA檢測一線和二線抗結(jié)核藥物的臨界濃度，并通過多中心數(shù)據(jù)評估液體培養(yǎng)基NRA的檢測性能。

首先，本研究確定了液體培養(yǎng)基NRA檢測6種臨床常用的抗結(jié)核藥物的MIC值，根據(jù)MIC值確定NRA檢測每種藥物的臨界濃度。本研究結(jié)果顯示，NRA得到的6種藥物的臨界濃度與MGIT 960法得到的結(jié)果[10]相似（表7）。本研究結(jié)果顯示，采用液體培養(yǎng)基NRA時，利福平的臨界濃度為1 mg/L、氧氟沙星和阿米卡星的臨界濃度為2 mg/L、卡那霉素的臨界濃度為5 mg/L、卷曲霉素的臨界濃度為2.5 mg/L。為驗證本研究確定的臨界濃度，4個實驗室共進行了1 200次檢測，只有13個（1.1%）假敏感結(jié)果和13個（1.1%）假耐藥結(jié)果，證實了相關(guān)研究[8-14]確定的利福平臨界濃度為1 mg/L，氧氟沙星臨界濃度為2 mg/L的適用性。

表7 液體培養(yǎng)基NRA法確定的MIC和最終臨界濃度與MGIT 960法比較 mg/L

在第3階段，本研究進行了多中心前瞻性評估，采用第2階段確定的臨界濃度，通過對6種藥物的耐藥性結(jié)果檢測評估液體培養(yǎng)基NRA同時檢測MDR-MTB和XDR-MTB的性能，結(jié)果顯示，NRA與參考方法（APM或MGIT 960法）結(jié)果一致性較高。對于不一致的結(jié)果，通過NRA、APM或MGIT 960法進行重復檢測來確認；對于重復檢測后仍然不一致的結(jié)果，對基因組中已知耐藥相關(guān)基因進行測序，為表型檢測的正確性或可靠性判斷提供了間接證據(jù)，結(jié)果顯示，在45個不一致的結(jié)果中，有11個檢測到阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素耐藥最常見的突變rrsA1401G；而對于氧氟沙星的耐藥性，本研究發(fā)現(xiàn)的最常見的gyrA突變位點是D94G，與相關(guān)報道一致[15]。

近年來，許多研究采用固體培養(yǎng)基NRA對二線抗結(jié)核藥物進行體外藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示其具有很高的敏感性和特異性[7，15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)基NRA檢測氧氟沙星的耐藥性性能優(yōu)異[14]。本研究中，液體培養(yǎng)基NRA檢測利福平、異煙肼和二線抗結(jié)核藥物耐藥性的敏感性和特異性都非常好，其中檢測利福平、異煙肼和氧氟沙星耐藥性的敏感性與相關(guān)研究結(jié)果[9，14]一致。本研究通過多中心數(shù)據(jù)證實了液體培養(yǎng)基NRA可以篩查XDR-MTB感染。

體外藥物敏感性試驗的TAT對于制定合適的治療方案非常重要。本研究結(jié)果顯示，采用液體培養(yǎng)基NRA檢測，有76%的樣本在接種第7天即可獲得結(jié)果，與傳統(tǒng)的APM相比[18]，時間顯著縮短。NRA的TAT與MGIT 960法相似，但不需要昂貴的設(shè)備，成本較低。此外，液體培養(yǎng)基NRA檢測較相關(guān)研究報道的LJ培養(yǎng)基也更快[19]。NRA需要反復打開培養(yǎng)管，易產(chǎn)生污染，但本研究中污染率為0，可能的原因為：（1）嚴格的人員培訓，人員培訓中除了操作技術(shù)部分，更注重生物安全及防止污染，為了保證操作一致，并防止污染，每次的操作人員均固定；（2）每次試驗均在專用的生物安全柜（條件允許時采用BⅡ全排型生物安全柜）中進行，并在試驗前采用75%乙醇擦拭1次，隨后把所有試驗所需的材料按清潔區(qū)和污染區(qū)分類放置于安全柜中的不同區(qū)域，試驗過程中操作人員雙手不再離開安全柜；（3）試驗過程中使用滅菌耗材進行操作，可在紅外線消毒器附近進行操作，如有污染發(fā)生，及時消毒并更換手套；（4）試驗完成后再次用75%乙醇擦拭，并用紫外線照射30 min。目前，針對病原對某些藥物（如利福平）的耐藥性檢測，有更快速的分子檢測方法，但這些檢測方法不能檢測所有藥物的耐藥情況[20]。因此，NRA等表型檢測方法為醫(yī)療資源有限的實驗室（尤其是發(fā)展中國家的實驗室）快速、準確、低成本地檢測MDRMTB或XDR-MTB提供了一個非?？煽康倪x擇。本研究尚存在一些不足，NRA需要多次加入顯色劑才能最終判讀結(jié)果；相對于APM和絕對濃度法，試驗過程中需反復打開培養(yǎng)管，人工操作次數(shù)更多，根據(jù)國際生物安全準則，MTB的體外藥物敏感性試驗需要BSL-3設(shè)施，因此所有操作均應在生物安全柜內(nèi)進行[18，21]；NRA是通過目測判定顏色，存在一定的主觀誤差。

綜上所述，液體培養(yǎng)基NRA具有檢測速度更快、成本低（不需要特殊的設(shè)備或試劑）、易于操作等優(yōu)點，在保證生物安全要求的條件下，可在醫(yī)療資源有限的實驗室開展MTB一線和二線抗結(jié)核藥物的體外藥物敏感性試驗。